細(xì)胞電生理學(xué)與膜片鉗技術(shù)ppt課件

1、2、膜片鉗技術(shù)及其應(yīng)用,3、膜片鉗系統(tǒng)裝置,1、細(xì)胞電生理學(xué),OUTLINE,小林/forry 祝你科研學(xué)習(xí)順利,膜片鉗實驗室基本設(shè)備,膜片鉗放大器 信號轉(zhuǎn)換器 倒置顯微鏡 微操縱器 防震工作臺及靜電屏蔽籠 微電極拉制儀及拋光儀 計算機 專用軟件 細(xì)胞記錄槽 恒速灌流泵,Automatic Patch Clamp Robot,原理：硅硼玻璃制造的芯片對懸浮細(xì)胞進(jìn)行鉗制。芯片上有約1m的孔，從芯片內(nèi)側(cè)用泵施以負(fù)壓使懸浮細(xì)胞被吸引到開孔處而形成封接。,膜片鉗記錄的基本步驟,可概括為4大部分： 1.液體配制。主要根據(jù)研究通道的不同，配制相應(yīng)的液體，基本原則是保持2個平衡：滲透壓平衡和酸堿平衡。 2.

2、標(biāo)本的制備。膜片鉗記錄標(biāo)本的制備主要有：急性分離、細(xì)胞培養(yǎng)、腦片或其它組織薄片。當(dāng)根據(jù)不同的研究要求而相應(yīng)選擇。 3.膜片鉗記錄 4. 資料分析用相應(yīng)的計算機軟件進(jìn)行,3.膜片鉗記錄,電極拉制：一般采用常規(guī)二步法完成，電極尖端直徑在0.5-2.0m之間，是否涂膠與拋光應(yīng)根據(jù)經(jīng)驗而定，不必強求。 億歐姆封接：電極充灌安裝后即給持續(xù)正壓，在倒置顯微鏡監(jiān)視下將電極貼近細(xì)胞，以微操縱器將電極貼于細(xì)胞，去掉正壓后再稍施負(fù)壓吸引，億歐姆封接便瞬間形成。要保證億歐姆封接就必須做到： 1)電極電阻適當(dāng)；2)電極尖端清潔；3)電極氣路通暢； 4)電極與細(xì)胞相貼寧不及而勿過之； 5)細(xì)胞膜清潔，活性好。,4.資料

3、分析,一般電學(xué)性質(zhì)：通過I/V關(guān)系計算單通道電導(dǎo)，觀察通道有無整流。通過離子選擇性、翻轉(zhuǎn)電位或其它通道激活條件初步確定通道類型。 通道動力學(xué)分析：開放時間、開放概率、關(guān)閉時間、通道的時間依賴性失活、開放與關(guān)閉類型(簇狀猝發(fā)，Burst)樣開放與閃動樣短暫關(guān)閉(flickering)，化學(xué)門控性通道的開、關(guān)速率常數(shù)等。 藥理學(xué)研究： 研究的藥物，阻斷劑、激動劑或其它調(diào)制因素對通道活動的影響情況。 綜合分析得出最后結(jié)淪,膜片鉗在藥理學(xué)研究中的應(yīng)用,膜片鉗技術(shù)不僅對于細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展以及對于闡明各種疾病的機制具有革命性意義，而且開辟了一條探索藥物作用機制和發(fā)展新的更為有效藥物的途徑。正如諾貝爾基

4、金會在頒獎時所說:“Neher和Sadmann的貢獻(xiàn)有利于了解不同疾病機理,為研制新的更為特效的藥物開辟了道路” 。,膜片鉗技術(shù)的一大優(yōu)點就是在通道電流記錄中,可分別于不同時間、不同部位(膜內(nèi)或膜外)施加各種濃度的藥物或毒素,研究它們對通道功能的可能影響。通過研究,一方面可深入了解哪些選擇性作用于通道的藥物和毒素影響人和動物生理功能的分子機理;另一方面,分析各種藥物對通道蛋白的選擇性相互作用的特點,提供有關(guān)通道蛋白亞單位結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的信息。,藥物作用機制研究,膜片鉗技術(shù)對離子通道的動力學(xué)研究以及藥物與通道相互作用機制的研究。 藥物對通道電壓依賴的激活和滅活過程的影響 藥物對離子通道狀態(tài)依賴性

5、的作用（如大多數(shù)類抗心律失常藥與失活狀態(tài)的Na+通道結(jié)合而發(fā)揮作用）。 藥物的頻率依賴性（frequency-dependent）或使用依賴性（use-dependent）（如維拉帕米）以及藥物對離子通道亞型的選擇性作用等 。,膜片鉗技術(shù)還在作用于通道活性受體和第二信使調(diào)節(jié)的藥物的機制研究中發(fā)揮了重要作用。如證明了腎上腺素能介質(zhì)及藥物激活受體后，通過第二信使cAMP激活蛋白激酶A，使鈣通道磷酸化，由關(guān)閉狀態(tài)轉(zhuǎn)為開放。,新藥開發(fā),在現(xiàn)代藥物研究中，新靶點的建立往往是新藥創(chuàng)制的前提。隨著膜片鉗技術(shù)運用對許多新受體亞型的發(fā)現(xiàn)和特性研究，新型受體阻斷劑將在選擇性 、高效性上發(fā)揮更大的作用。,近十年來藥

6、物學(xué)研究最重要的成就之一就是首先合成了各類鈣拮抗劑(如硝苯砒啶、硫氮卓酮和維拉帕米及其衍生物) 。 研制出鉀通道開放劑（nicorandil、pinacidil等） 類抗心律失常新藥是近年來心血管藥理的重要研究方向 。,離子通道病及與離子通道調(diào)節(jié)缺陷有關(guān) 疾病的研究。 將基因工程與膜片鉗技術(shù)結(jié)合起來,把通道蛋白有目的地重組于人工膜中進(jìn)行研究。設(shè)想將合成的通道蛋白分子接種入機體以替換有缺陷和異常的通道的功能而達(dá)到治療的目的。,離子通道藥理學(xué),離子通道藥理學(xué),Patch-clamp技術(shù),新藥開發(fā),Na+,Ca2+,K+,Cl-等電流,分子生物學(xué)技術(shù),單細(xì)胞電流記錄,離子通道的結(jié)構(gòu)與功能,藥物作用機

7、制,基因克隆及蛋白表達(dá),通道蛋白功能測定,一、離子選擇性(selectivity )（大小和電荷）： 某一種離子只能通過與其相應(yīng)的通道跨膜擴散(安靜：KNa 100倍、興奮： NaK 10-20倍）；各離子通道在不同狀態(tài)下，對相應(yīng)離子的通透性不同。 二、門控特性(Gating)： 失活狀態(tài)不僅是通道處于關(guān)閉狀態(tài)，而且只有在經(jīng)過一個額外刺激使通道從失活關(guān)閉狀態(tài)進(jìn)入靜息關(guān)閉狀態(tài)后，通道才能再度接受外界刺激而激活開放。,二、離子通道的特性(Characteristic of Ion Channels),(參見P27圖24-1),三、離子通道的功能(Function of Ion Channels),

8、1.產(chǎn)生細(xì)胞生物電現(xiàn)象,與細(xì)胞興奮性相關(guān)。 2.神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、腺體的分泌、肌肉的運動、學(xué)習(xí)和記憶 3.維持細(xì)胞正常形態(tài)和功能完整性,膜離子通道的基因變異及功能障礙與許多疾病有關(guān)，某些先天性與后天獲得性疾病是離子通道基因缺陷與功能改變的結(jié)果，稱為離子通道病 (ionchannelpathies)。,四、Classification of ion channels,（一）、非門控離子通道 （背景或漏通道）： 始終處于開放狀態(tài)，離子可隨時進(jìn)出細(xì)胞，并不受外界信號的明顯影響，如產(chǎn)生靜息電位的K+通道。 （二）、門控離子通道： 電壓門控（Voltage gated channels)離子通道：受膜電位

9、的變化影響，如決定細(xì)胞興奮性、不應(yīng)期和傳導(dǎo)性的K+通道、Na+通道、Ca2+通道。 配體門控（Ligand gated channels)離子通道：由遞質(zhì)與通道蛋白分子上結(jié)合位點相結(jié)合開啟，如乙酰膽堿激活鉀通道等。 機械門控離子通道(Mechanically gated ion channels)：由機械牽拉激活，如內(nèi)耳毛細(xì)胞頂端機械門控通道。,電壓門控離子通道的分子結(jié)構(gòu)示意圖,亞基 (,等） 亞基的四個跨膜區(qū)（D1-D4）,離子通道的晶體結(jié)構(gòu)與模型,鉀離子,孔道螺旋,選擇性過濾器,N,C,（一）電壓門控離子通道的分類,快反應(yīng)細(xì)胞AP and Ion channels,0,1,2,3,4,IN

10、a,ICa,IKr,IKs,1.電壓門控鈉通道,選擇性允許Na+跨膜通過。維持細(xì)胞膜興奮性及其傳導(dǎo)（AP的0相）。存在于心房、心室肌細(xì)胞和希普系統(tǒng)。,特征 電壓依賴性：去極化激活，產(chǎn)生內(nèi)向鈉電流（INa） 快速激活（1ms）和快速失活（10ms） 有特異性激活劑（BTX、GTX）和阻滯劑（TTX、STX、CTX）,電壓門控鈉通道分類,神經(jīng)類鈉通道（對TTX敏感性高、對CTX敏感性低） 骨骼肌類鈉通道（對TTX和CTX敏感性均高） 心肌類鈉通道（對TTX和CTX敏感性均低），又分為持久（慢）鈉通道和瞬時（快）鈉通道。,2.電壓門控鈣通道,鈣通道存在于機體各種組織細(xì)胞，在正常情況下為細(xì)胞外Ca2+

11、內(nèi)流的離子通道（AP平臺期），是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度（Ca2+i）的主要途徑。,特征: 電壓依賴性：去極化激活 緩慢激活（20-30ms）和緩慢失活（100-300ms）：在心肌細(xì)胞上，當(dāng)鈣通道尚未激活時，鈉通道已經(jīng)失活。 對離子的選擇性較低：在細(xì)胞外Ca2+濃度（Ca2+o）下降時，也允許Na+通過。,電壓門控鈣通道,目前已克隆出L、T、N、P、Q和R6種亞型的電壓依賴性鈣通道，心血管系統(tǒng)主要有L-型和T-型。,3. 電壓門控鉀通道,選擇性允許K+跨膜通過的離子通道(參于RP、心率、APD調(diào)節(jié)）。是目前發(fā)現(xiàn)的亞型最多、作用最復(fù)雜的一類離子通道。,1.瞬時外向鉀通道電流（Ito）： Ito1

12、（不依賴于細(xì)胞內(nèi)鈣濃度，對4-AP敏感）是復(fù)極1期的主要參與電流。 Ito2（依賴于細(xì)胞內(nèi)鈣濃度，對4-AP不敏感）可能是減少鈣超載的一種負(fù)反饋機制（縮短動作電位時程）。,2.延遲整流鉀通道電流（IK）：緩慢成分（IKs）和快速成分（IKr）是AP2、3相的主要復(fù)極電流。類抗心律失常藥物選擇性阻滯IKr，使動作電位時程延長。超快速成分（IKur）對心房肌復(fù)極重要，與房性心律失常有關(guān)。 3.內(nèi)向整流鉀通道電流（IK1）：IK1主要參與AP3相復(fù)極晚期及4相RP的維持。 4.起搏電流（If）：If由K+和Na+共同攜帶的離子電流。腎上腺素使If電流增加，交感神經(jīng)刺激加快心率,乙酰膽堿可抑制If，迷

13、走神經(jīng)減慢心率。,電壓門控鉀通道,（二）配體門控離子通道,當(dāng)配體與配體門控離子通道結(jié)合后，引起通道蛋白構(gòu)型變化，致通道開放。 心血管系統(tǒng)主要有: 1.乙酰膽堿激活鉀通道(KACh)：參與迷走調(diào)控。 2. ATP敏感鉀通道(KATP)：心肌缺血、缺氧開放。 3.鈣激活鉀通道(KCa)：參與血管張力調(diào)控。,配體門控離子通道,Classification of ion channels(離子通道的分類),（一）、非門控離子通道 （背景或漏通道）： 始終處于開放狀態(tài)，離子可隨時進(jìn)出細(xì)胞，并不受外界信號的明顯影響，如產(chǎn)生靜息電位的K+通道。 （二）、門控離子通道： 電壓門控（Voltage gated

14、channels)離子通道：受膜電位的變化影響，如決定細(xì)胞興奮性、不應(yīng)期和傳導(dǎo)性的K+通道、Na+通道、Ca2+通道。 配體門控（Ligand gated channels)離子通道：由遞質(zhì)與通道蛋白分子上結(jié)合位點相結(jié)合開啟，如乙酰膽堿激活鉀通道等。 機械門控離子通道(Mechanically gated ion channels)：由機械牽拉激活，如內(nèi)耳毛細(xì)胞頂端機械門控通道。,第二節(jié) 作用于心血管系統(tǒng)離子通道的藥物Drugs used in cardiovascular ion channels,作用于鈉通道的藥物 作用于鉀通道的藥物 作用于鈣通道的藥物,一、作用于鈉通道的藥物 The d

15、rugs used in sodium channel,作用于鈉通道的藥物主要是鈉通道阻滯藥，臨床常用的有局部麻醉藥、抗癲癇藥和類抗心律失常藥。,二、作用于鉀通道的藥物The drugs used in potassium channel,作用于鉀通道的藥物被稱為鉀通道調(diào)控劑，包括鉀通道阻滯藥（阻滯細(xì)胞內(nèi)K+外流）和鉀通道開放藥（促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)K+外流）。 鉀通道阻滯藥（Potassium channel blockers,PCBs）是一類可抑制K+通過膜不同鉀通道亞型的化合物。包括非選擇性PCBs（四乙基銨、4-氨基吡啶）和選擇性PCBs（磺酰脲類降糖藥、類抗心律失常藥）。,鉀通道開放藥（PCO

16、s）是選擇性作用于鉀通道，增加細(xì)胞膜對K+的通透性，促進(jìn)K+外流)的一類藥物。 促細(xì)胞內(nèi)K+外流，膜超級化，降低鈣通道開放、阻止Ca2+ 的重攝取、儲存和釋放，細(xì)胞內(nèi)Ca2+下降。均作用于KATP ，舒張血管平滑肌。 按化學(xué)結(jié)構(gòu)分為7組: (1)苯并吡喃類:克羅卡林 (5)苯并噻二嗪類：二氮嗪 (2)吡啶類：尼可地爾 (6)硫代甲酰胺類：RP25891 (3)嘧啶類：米諾地爾 (7)1,4二氫吡啶類：尼古地平 (4)氰胍類：吡那地爾,Potassium channel opener鉀通道開放藥（PCOs）,【藥理作用與臨床應(yīng)用】,高血壓：高選擇性地舒張阻力血管(強，吡那地爾和米諾地爾）。 心絞痛和心肌梗死：高選擇性地擴張正常及有病變的冠脈，改善冠脈血供(尼可地爾)。 心肌保護作用：使缺血心肌細(xì)胞膜超極化，恢復(fù)紊亂的電解質(zhì)平衡，減輕Ca2+超載。 充血性心衰：降低安靜及運動時的左、右心室負(fù)荷(尼可地爾) 。,Potassium channel opener鉀通道開放藥（PCOs）,鈣通道阻滯藥(Calcium channel blockers)/鈣拮抗藥(calcium antagoni