β-乳球蛋白修飾

1、-乳球蛋白修飾將3-羥基-鄰苯二甲酸酐HP溶于二甲基亞颯DMSO中，得到飽和的HP溶液；將-乳球蛋白-LG溶于pH8.5，0.1M磷酸鈉溶液中，得到蛋白終濃度為20mg/mL的蛋白溶液；再將上述HP溶液分為五等份，每12min加入蛋白溶液中，震蕩混勻，1MNaOH調(diào)節(jié)pH為8.5，酸酐在反應(yīng)體系中的終濃度為60mM，在溫度為25的條件下，放置l小時(shí)，pH7.4PBS透析，再用0.45uM微孔濾膜過濾除菌，4保存，即得成品。3-羥基-鄰苯二甲酸酐修飾乳清蛋白南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào) 第31卷P1176乳清蛋白（OVA），3-羥基-鄰苯二甲酸酐HP，二甲基亞颯DMSOHP-OVA的制備（化學(xué)修飾）配制20

2、mg/ml的OVA溶液（pH8.5 0.1mol/L的磷酸鈉溶液），將飽和的3-羥基-鄰苯二甲酸酐HP溶液分成5等分，每間隔12分鐘加入OVA中，振蕩混勻，滴加1MNaOH調(diào)節(jié)溶液維持pH為8.5，置室溫1小時(shí)，然后pH7.4PBS透析，再用0.45uM微孔濾膜過濾除菌，4保存，即得成品。專利修飾種預(yù)防和控制人乳頭瘤病毒感染的生物制劑的制備方法，包括以下步驟：將3-羥基-鄰苯二甲酸酐（3-hydroxyphthalicanhydride，縮寫HP）溶于二甲基亞颯DMSO中，得到飽和的HP溶液；將-乳球蛋白-LG溶于pH8.5，0.1M磷酸鈉（應(yīng)該是磷酸鹽緩沖液）溶液中，得到蛋白終濃度為20mg

3、/mL的蛋白溶液；再將上述HP溶液分為五等份，每12min加入蛋白溶液中，震蕩混勻，每次加完后用1MNaOH調(diào)節(jié)pH為8.5，酸酐在反應(yīng)體系中的終濃度為60mM，在溫度為25的條件下，放置l小時(shí)，pH7.4磷酸緩沖溶液PBS在4度透析過夜，再用0.45uM微孔濾膜過濾除菌，4保存，即可制得成品。1.一種預(yù)防和控制人乳頭瘤病毒感染的生物制劑的制備方法，其特征是包括以下步驟：將3-羥基-鄰苯二甲酸酐HP溶于二甲基亞颯DMSO中，得到飽和的HP溶液；將-乳球蛋白-LG溶于pH8.5，0.1M磷酸鈉溶液中，得到蛋白終濃度為20mg/mL的蛋白溶液；再將上述HP溶液分為五等份，每12min加入蛋白溶液中

4、，震蕩混勻，1MNaOH調(diào)節(jié)pH為8.5，酸酐在反應(yīng)體系中的終濃度為60mM，在溫度為25的條件下，放置l小時(shí)，pH7.4PBS透析，再用0.45uM微孔濾膜過濾除菌，4保存，即可按照常規(guī)方法制成各種劑型的成品。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種預(yù)防和控制人乳頭瘤病毒感染的生物制劑的制備方法，其特征是所述的-乳球蛋白從牛奶中分離及純化得到。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種預(yù)防和控制人乳頭瘤病毒感染的生物制劑的制備方法，其特征是所述的-乳球蛋白用雞血清蛋白OVA、兔血清蛋白RSA、豬血清白蛋白PSA、冷水魚皮明膠G-FS、豬皮明膠G-PS代替。4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種預(yù)防和控制人乳頭瘤病毒感染的生

5、物制劑的制備方法，其特征是所述的3-羥基-鄰苯二甲酸酐用3-羥基-鄰苯二甲酸酐的衍生物、琥珀酸酐、馬來酸酐代替。5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種預(yù)防和控制人乳頭瘤病毒感染的生物制劑的制備方法，其特征是所述的劑型為凝膠制劑、膏霜劑、噴霧劑、搽洗劑、盥洗劑。Chemical modification of B-LG.B-LG(111.1 or 11.1uM in 0.1 M phosphate pH 8.5)was treated with 3HP(1.19M in dimethylformamide),added in five aliquots (final concentration,60m

6、M)in 12-min intervals and the pH was maintained at 8.5.The mixture(10ml) was kept for another 1h at 25,dialyzed against 4 I of 0.15M NaCl,10mM phosphate,pH 7.4 (PBS) overnight,redialyzed for 4 h with fresh buffer, and filtered through 0.45-um syringe filters. 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS

7、)(28.4mM)was carried out at pH 9.0 in phosphate buffer for 3h at 25. Protein concentration were determined using the BCA Protein Assay Reagent To quantitate lysine in the original and the chemically modified preparation,they were treatment with TNBS and dialyzed against 0.1M NaHSO3. The absorbance a

8、t 420nm(A420) of the dialyzed preparation and their appropriate dilutions in 0.1M NaHSO3 were measured.Quantitation of lysine, determined from calibration curvers relating A420 values to lysine concentrations in standard,revealed that 11 to 14 of the 15 B-LG lysines were modified,depending on the 3H

9、P/ B-LG rations.The preparations han similar properties. 專利制劑配方及制法 JB-蛋白 千分之0.051 卡波姆 13% 綠茶提取物 0.52% 三氯生 0.10.3% 甘油 15% 加水總蛋白測定一.合成的酸酐修飾蛋白濃度按照BCA蛋白濃度分析試劑盒的操作步驟測定，具體方法如下:(1)稀釋BSA蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，使終濃度為0，25，125，250，500，750，1000，2000ug/mL，標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與待測蛋白樣品溶液相同;(2)分別將25ul各濃度標(biāo)準(zhǔn)品和25ul待測樣品加入96孔圓底細(xì)胞板中，復(fù)孔對照;(3)制備反應(yīng)工作液，將Rea

10、gentA與ReagentB按50:1比例混勻;(4)每孔200ul反應(yīng)工作液，輕柔震蕩30s，混勻;(5)37孵育30min，冷卻至室溫，680型酶標(biāo)儀測定OD562nm吸光度;(6)繪制蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待測樣品濃度。二TNBS法及p-HPG法測定蛋白的酸酐修飾比率，及檢測正電荷氨基-酸賴氨酸和精氨酸殘基的被修飾率賴氨酸殘基檢測采用2，4，6一三硝基苯磺酸(TNBS)檢測修飾后蛋白末端的賴氨酸殘基被相應(yīng)酸酐修飾的比率。（1）系列稀釋的待測酸配修飾蛋白樣品與陰性對照未修飾的蛋白各25ul加入96孔圓底細(xì)胞培養(yǎng)板中，空白對照孔加入25ul/孔0.1M磷酸鈉溶液;（2）25u

11、l/孔的0.1M四硼酸鈉Na2B4O7:與各待測樣品室溫混勻5min;各孔加入10ul的，TNBS，室溫混勻，5min;（3）加入100ul/孔的終止液(0.1MNaH2PO4;和l.5mMNa2SO3)，終止反應(yīng)，測OD420nm值，根據(jù)其與陰性對照蛋白OD值差異，計(jì)算賴氨酸的修飾率。（4）賴氨酸修飾率%=1-(OD450nm樣品-OD450nm空白)/(OD450nm陰性-OD450nm空白)x100精氨酸殘基檢測采用p-HPG（p-phydroxyphenylglyoxal(p-HPG)）檢測合成的修飾蛋白末端的精氨酸殘基被相應(yīng)酸酐修飾的比率。（1）系列稀釋的待測酸配修飾蛋白樣品與陰性對照未修飾的蛋白各90ul