CTAB法提取細菌Total_DNA原理

1、CTAB法提取細菌Total DNA原理CTAB法原理 CTAB(Hexadecyltrimethy Ammonium Bromide，十六烷基三甲基溴化銨)，是一種陽離子去污劑，具有從低離子強度溶液中沉淀核酸與酸性多聚糖的特性。陽離子表面活性劑，呈白色或淺黃色結晶體至粉末狀。易溶于異丙醇，可溶于水，熔于熱水、乙醇、三氯甲烷，微溶于丙酮，不溶于醚和苯。在高離子強度的溶液中(0.7mol/L NaCl)，CTAB與蛋白質和多聚糖形成復合物，只是不能沉淀核酸。通過有機溶劑抽提，去除蛋白，多糖，酚類等雜質后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。CTAB提取緩沖液的經典配方：Tris-HCl (pH8.0)

2、提供一個緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞；EDTA螯合Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase活性；NaCl 提供一個高鹽環(huán)境，使DNA充分溶解于液相；CTAB溶解細胞膜，并結合核酸，使核酸便于分離；-巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易去除；PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的絡合物，能與多酚形成一種不溶的絡合物質，有效去除多酚，減少DNA中酚的污染；同時它也能和多糖結合，有效去除多糖。 1.用酚抽提細胞DNA時，有什么作用？使蛋白質變性，同時抑制了DNase的降解作用。用苯酚處理勻漿液時，由于蛋白與DNA 聯結鍵已斷，蛋白分子表面又含有很多極性基團與苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，

3、而DNA溶于水相。 使用酚的優(yōu)點:有效變性蛋白質； 抑制了DNase的降解作用。 缺點：能溶解10-15%的水，從而溶解一部分poly(A)RNA；不能完全抑制RNase的活性。2.氯仿的作用？ 氯仿：克服酚的缺點；加速有機相與液相分層。 最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的跡量酚。（酚易溶于氯仿中）3. 用酚-氯仿抽提細胞基因組DNA時，通常要在酚-氯仿中加少許異戊醇，為什么？ 減少蛋白質變性操作過程中產生的氣泡；降低表面張力，從而減少氣泡產生；另外，異戊醇有助于分相，使離心后的上層含DNA的水相、中間的變性蛋白相及下層有機溶劑相維持穩(wěn)定。4.用乙醇沉淀DNA時，為什么加入單價的陽離子？ 用乙醇

4、沉淀DNA時，通常要在溶液中加入單價的陽離子，如NaCl 或 NaAc（20mmol/L？）Na+中和DNA分子上的負電荷，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，而易于聚集沉淀。不同生物DNA的提取方法不盡相同，但各種提取方法也有很多相通之處，可以相互借鑒。在DNA提取過程中應做到：1、根據不同研究需要，保證結構的相應完整性；2、盡量排除其它大分子成分的污染(蛋白質、多糖及RNA等)；3、保證提取樣品中不含對酶有抑制作用的有機溶劑及高濃度的金屬離子。核酸的提取關鍵是去除蛋白質，通常情況下，先用某些蛋白水解酶消化大部分蛋白質后，再用有機溶劑抽提，在單價陽離子存在下，核酸在乙醇中形成沉淀。真核生物中

5、的染色體DNA與堿性蛋白（組蛋白）結合，形成核蛋白（DNA），存在于核內。DNA在低濃度NaCl中，隨NaCl濃度升高，溶解度降低，但升高到0.14mol/L時，DNA溶解度又隨著濃度升高而增大，至1mol/L氯化鈉中的溶解度比純水高2倍。DNA溶于濃鹽溶液（如1mol/L的NaCl），但不溶于生理鹽溶液（0.14mol/L的NaCl）。RNA在0.14mol/L的NaCl中溶解度相當大，因此可以以0.14mol/L的NaCl把DNA和RNA分開。真核生物中，DNA總是與纏繞的組蛋白同時存在，而原核生物的DNA卻是單獨存在的。DNA、RNA和核苷酸都是極性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿

6、等有機溶劑，它們的鈉鹽比游離酸易溶于水，RNA鈉鹽在水中溶解度可達40g/L。DNA在水中為10g/L，呈黏性膠體溶液。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。真核生物DNA提取先將細胞破壁，用濃鹽溶液提取，再稀釋到0.14mol/L的鹽溶液，使DNP沉淀出來；再溶解沉淀多次以純化；用苯酚多次抽提，去除蛋白。用水飽和的苯酚與DNP一起振蕩、離心，不溶性的變性蛋白在中間界面，DNA溶于上層，部分變性蛋白溶于苯酚。將含DNA的水相，在鹽存在的條件下，用乙醇等將DNA沉淀出來。用乙醚或乙醇洗DNA1。微生物DNA提取常規(guī)的微生物DNA提取多是根據某種微生物的具體特點選擇合適的方法3 。對真菌DNA的提取關鍵是破碎細胞，通常采取酶解破壁法或物理破壁法（以液氮冷凍