蛋白酶產生菌的分離

1、蛋白酶產生菌的分離、活化選育、發(fā)酵及酶活力的測定許多細菌和霉菌產生蛋白酶，細菌中的芽孢桿菌是常見的蛋白酶產生菌。本實驗將土壤樣品懸液加熱處理，殺死非芽孢細菌及其它微生物后進行劃線分離得到芽孢桿菌，將其接種到酪蛋白平板進行培養(yǎng)，根據(jù)酪蛋白平板的水解圈做初篩。也可直接將細菌或霉菌接種到酪蛋白平板進行培養(yǎng)，分離篩選其它蛋白酶產生菌。本實驗主要包括：蛋白酶產生菌的分離純化、產酶微生物菌種的選育、產酶微生物的發(fā)酵與酶活力的測定、蛋白酶產生菌的生長及生長曲線、培養(yǎng)基優(yōu)化。通過本實驗項目，使學生學會從自然界中分離蛋白酶產生菌的方法，菌種的純化技術、高產菌的選育技術；了解蛋白酶產生菌的生長情況，學會繪制其生長

2、曲線；學會培養(yǎng)基優(yōu)化的方法；了解蛋白酶的性質及蛋白酶的測定原理；掌握蛋白酶的發(fā)酵及酶活力測定方法。1實驗材料1.1實驗樣品校園內土壤樣品1.2實驗儀器與材料牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板、酪蛋白平板、無菌水（帶玻璃珠）、芽孢染色液番紅；顯微鏡、恒溫水浴鍋、酒精燈、接種針、游標卡尺、無菌移液管、無菌試管、血球計數(shù)板、試管、三角燒瓶、燒杯、量筒、，玻棒、電子天平、牛角匙、高壓蒸汽滅菌鍋、pH試紙（pH5590）、棉花、牛皮紙、記號筆、麻繩、紗布、培養(yǎng)皿、膠頭滴管、分光光度計（應符合GB9721的規(guī)定）等。2實驗方法與步驟2.1培養(yǎng)基的配制方法1.稱量按培養(yǎng)基配方比例依次準確地稱藥品放入燒杯中。2.溶化在上

3、述燒杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒攪勻，然后，在石棉網上加熱使其溶解。待藥品完全溶解后，補充水分到所需的總體積。3.調pH4.分裝按實驗要求，可將配制的培養(yǎng)基分裝入試管內或三角燒瓶內。5包扎塞好棉花的試管和錐形瓶應蓋上厚紙用繩捆扎，用記號筆注明培養(yǎng)基名稱、組別、日期。6滅菌將上述培養(yǎng)基以1.02kg/cm2（15磅/英寸2），1213，15-20min高壓蒸汽滅菌。如因特殊情況不能及時滅菌，則應放入冰箱內暫存。7制作平板將滅菌后的培養(yǎng)基冷凝至5560,放在超凈臺上，點燃酒精燈，右手托起錐形瓶瓶底，左手拔下棉塞，將瓶口在酒精燈上稍加灼燒，左手打開培養(yǎng)皿蓋，右手迅速將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，以鋪

4、滿皿底為度。8無菌檢查待培養(yǎng)基凝固后，5個培養(yǎng)皿一疊，倒置平放在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2448小時，以檢查滅菌是否徹底。2.2蛋白酶產生菌的分離1）采集土壤樣品，用無菌水制備1：10土壤懸液；2）取1：10土壤懸液5ml，注入已滅過菌的試管中，將此試管放入75-80水浴中熱處理10min，以殺死非芽孢細菌；3）取加熱處理過的土壤懸液100-200L，涂布接種到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板，將平板倒置，于30-32培養(yǎng)24-48h；4）對長出的單菌落進行編號，選擇表面干燥、粗糙、不透明的菌落，挑取少許菌苔涂片，做芽孢染色，判斷是否為芽孢桿菌。2.3蛋白酶產生菌的篩選1）從判定為芽孢桿菌的菌落處，分別挑取少許

5、菌苔，先接種含酪蛋白的斜面培養(yǎng)基，再點接于含酪蛋白的平板，30-32培養(yǎng)24-48h，測定平板上菌苔直徑和水解圈直徑。2）水解圈直徑與菌落直徑比值大的那個菌株對應的斜面培養(yǎng)物，可作為進行誘變選育或酶發(fā)酵、酶活力測定菌株。2.4蛋白酶產生菌的選育2.4.1紫外線對出發(fā)菌株的誘變效應1）菌懸液的制備：取培養(yǎng)48小時生長旺盛的出發(fā)菌株斜面4-5支，用10ml無菌生理鹽水將菌苔洗下，倒入盛有玻璃珠的小三角燒瓶中，振蕩30分鐘，以打碎菌塊。將上述菌液離心（3000r/min，離心15分鐘），棄去上清液，將菌體用無菌生理鹽水洗滌2-3次，最后制成菌懸液。用顯微鏡直接計數(shù)法計數(shù)，調整細胞濃度為每毫升108個

6、。2）平板制作：將淀粉瓊脂培養(yǎng)基溶化后，冷至55左右時倒平板27套，凝固后待用。3）紫外線處理：將紫外線燈開關打開，預熱約20分鐘。取直徑6cm無菌平皿2套，分別加入上述調整好細胞濃度的菌懸液3ml，并放入一根無菌攪拌棒于平皿中。將上述2套平皿先后置于磁力攪拌器上，打開皿蓋，在距離為30cm，功率為15W的紫外線燈下分別攪拌照射1分鐘和3分鐘。蓋上皿蓋，關閉紫外燈。4）稀釋：在紅燈下，將上述經誘變處理的菌懸液以10倍稀釋法稀釋成10-1-10-6（具體可按估計的存活率進行稀釋）。5）涂平板：取10-4、10-5、10-6三個稀釋度涂平板，每個稀釋度涂平板3只，每只平板加稀釋菌液0.1ml，用無

7、菌玻璃刮棒涂勻。以同樣操作，取未經紫外線處理的菌稀釋液涂平板作對照。6）培養(yǎng)：將上述涂勻的平板，用黑布（或黑紙）包好，置37培養(yǎng)48小時。注意每個平皿背面要標明處理時間和稀釋度。7）計數(shù)：將培養(yǎng)48小時后的平板取出進行細菌計數(shù)，根據(jù)對照平板上菌落數(shù)，計算出每毫升菌液中的活菌數(shù)。同樣計算出紫外線處理1分鐘、3分鐘后的存活細胞數(shù)及其致死率。8）觀察誘變效應：將細胞計數(shù)后的平板，分別向菌落數(shù)在5-6個左右的平板內加碘液數(shù)滴，在菌落周圍將出現(xiàn)透明圈。分別測量透明圈直徑與菌落直徑并計算其比值（HC值）。與對照平板進行比較，根據(jù)結果，說明誘變效應。并選取HC比值大的菌落移接到試管斜面上培養(yǎng)。此斜面可作復篩

8、用。2.5蛋白酶產生菌的發(fā)酵與酶活力測定2.5.1蛋白酶產生菌的發(fā)酵（1）將保藏培養(yǎng)基中的產蛋白酶芽孢桿菌接種兩環(huán)到種子培養(yǎng)液中，30-32搖床發(fā)酵培養(yǎng)16h,4冰箱保存。（2）取10ml含產蛋白酶芽孢桿菌的種子培養(yǎng)液接入含100ml酪素液體發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，30-32搖床發(fā)酵培養(yǎng)，作為樣一。（3）樣一培養(yǎng)12h后，再取10ml含產蛋白酶芽孢桿菌的種子培養(yǎng)液接入含100ml酪素液體發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，30-32搖床發(fā)酵培養(yǎng)，作為樣二。（4）在發(fā)酵培養(yǎng)的48h內，每3h取一次樣，每次取5ml,放入10ml的離心管中，于4冰箱冷藏。（5）48h后將所有取樣3000rpm離

9、心10min，離心所得上清液680nm進行酶活力測定，每管沉淀加5ml蒸餾水600nm測生長曲線。2.5.2試劑和溶液2.5.2.1福林試劑2.5.2.2碳酸鈉溶液c(Na2CO3)=0.4mol/L稱取無水碳酸鈉(Na2CO3)42.4g，用水溶解并定容至1000mL.2.5.2.3三氯乙酸c(CCl3COOH)=0.4mol/L稱取三氯乙酸65.4g,用水溶解并定容至1000mL。2.5.2.4氫氧化鈉溶液c(NaOH)=0.5mol/L按GB601配制。2.5.2.5鹽酸溶液c(HCI)=lmol/L及0.lmol/L按GB601配制。2.5.2.6緩沖溶液a磷酸緩沖液(pH=7.5)，

10、適用于中性蛋白酶稱取磷酸氫二鈉(Na2HP0412H20)6.02g和磷酸二氫鈉(NaH2PO42H20)0.5g，加水溶解并定容至I000mL2.5.2.710g/L酪素溶液稱取酪素1.000g，精確至0.00lg，用少量0.5mol/L氫氧化鈉溶液(若酸性蛋白酶則用濃乳酸2-3滴)濕潤后，加人適量的各種適宜pH的緩沖溶液約80mL，在沸水浴中邊加熱邊攪拌，直至完全溶解，冷卻后，轉人100mL容量瓶中，用適宜的pH緩沖溶液稀釋至刻度。此溶液在冰箱內貯存，有效期為三天。2.5.2.8l00g/mLL-酪氨酸標準溶液a.稱取預先于105干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g，精確至0.0002g，

11、用lmol/L鹽酸60mL溶解后定容至l00mL，即為lmg/mL酪氨酸標準溶液。b.吸取lmg/mL酪氨酸標準溶液10.00mL，用0.1mol/L鹽酸定容至100mL，即得到l00g/mLL一酩氨酸標準溶液。2.5.3分析步驟2.5.3.1L-酪氨酸標準曲線的繪制a.L-酪氨酸標準溶液的配制：管號 酪氨酸標準溶液的濃度g/ml 取100g/mlL-酪氨酸標準溶液的體積取水的體積ml000101101922028330374404655055b.分別取上述落液各1.00mL(做平行試驗)，各加0.4mol/L碳酸鈉溶液5.00mL,福林試劑使用溶液1.00mL，置于40士0.2水浴中顯色20

12、min，取出，用分光光度計于波長680nm,10mm比色皿，以不含酪氨酸的0管為空白，分別測定其吸光度。以吸光度A為縱坐標，酪氨酸的濃度c為橫坐標，繪制標準曲線(此線應通過零點)。根據(jù)作圖或用回歸方程計算出當吸光度為1時的酪氨酸的量(g)，即為吸光常數(shù)K值。2.5.4酶活力的測定a.先將酪素溶液放人40C士2C恒溫水浴中，預熱5minb.按下列程序操作:步驟試管A(空白)試管B(酶試樣，做3個平行試樣)1加酶液1.00ml（離心上清液）加酶液1.00ml（離心上清液）2400.2,水浴2min400.2,水浴2min3加三氯乙酸2.00ml(搖勻)加酪素1.00ml(搖勻)4400.2,10m

13、in400.2,10min5加酪素1.00ml(搖勻)加三氯乙酸2.00ml(搖勻)6取出靜止10min,過濾取出靜止10min,過濾7取1.00ml濾液取1.00ml濾液8加碳酸鈉溶液5.0ml加碳酸鈉溶液5.0ml9加福林試劑使用液1.00ml加福林試劑使用液1.00ml10400.2,顯色20min400.2,顯色20min11于680nm波長測其吸光度于680nm波長測其吸光度2.5.4.2計算X=A*K*4/10*n=2/5*A*K*n式中:X一一樣品的醉活力，u/g(u/mL)tA一一樣品平行試驗的平均吸光度;K一吸光常數(shù);4一反應試劑的總體積,mL10一一反應時間10min，以l

14、min計;n一一稀釋倍數(shù)。所得結果表示至整數(shù)。2.6 培養(yǎng)基優(yōu)化（正交實驗）正交試驗設計是利用正交表來安排與分析多因素試驗的一種設計方法。它是由試驗因素的全部水平組合中，挑選部分有代表性的水平組合進行試驗的，通過對這部分試驗結果的分析了解全面試驗的情況，找出最優(yōu)的水平組合。正交試驗設計的基本特點是：用部分試驗來代替全面試驗，通過對部分試驗結果的分析，了解全面試驗的情況。 正因為正交試驗是用部分試驗來代替全面試驗的，它不可能像全面試驗那樣對各因素效應、交互作用一一分析；當交互作用存在時，有可能出現(xiàn)交互作用的混雜。雖然正交試驗設計有上述不足，但它能通過部分試驗找到最優(yōu)水平組合 ，因 而 很 受實際

15、工作者青睞。 例如下表為一培養(yǎng)基優(yōu)化的4因素3水平簡表4因素3水平表 因素水平蔗糖（%）NH4NO3 （%）KH2PO4 （%）MgSO47H2O （%）ABCD1100.10.050.12150.20.10.253200.30.30.52.7產蛋白酶菌生長曲線的測定2.7.1獲取不同培養(yǎng)時間發(fā)酵液2.7.1.1 整點8:00時，準時接入已經活化好的對數(shù)期菌種，用1000ul 的移液槍吸取5ml的對數(shù)期菌液加入到發(fā)酵瓶A中（液體為酪素培養(yǎng)基），剩下的對數(shù)期菌種菌液置于4冰箱種中保藏于。并同時將A號發(fā)酵瓶放到搖床中，繼續(xù)30震蕩發(fā)酵。在直到20:00時將放在冰箱中保藏的菌種液（活化的對數(shù)期菌種）

16、取出5ml接種到B號發(fā)酵瓶中。并放在30的搖床中繼續(xù)發(fā)酵。2.7.1.2 在8：00時，將放在冰箱中保藏的菌種液（活化的對數(shù)期菌種）取出5ml接種到C號發(fā)酵瓶中。立即從A、B、C號瓶移取發(fā)酵液5ml到對應的離心管中。A瓶取樣分別對應的編號是12、13、14、15、16、17、18對應培養(yǎng)時間為24h、26h、28h、30h、32h、34h、36h。B瓶取樣分別對應的編號是6、7、8、9、10、11對應培養(yǎng)時間為12h、14h、16h、18h、20h、20h完成全部取樣。C瓶取樣分別對應的編號是0、1、2、3、4、5對應培養(yǎng)時間為0h、2h、4h、6h、8h、10h。并且全部放到4冰箱封存。2.7.2 吸光度值的測定將編號0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18的離心管從冰箱里取出，用離心機在設定的轉速為3500rpm,離心10min,將要測酶活力的的編號的上清液倒入另一干凈的試管中。沉淀留下。（2） 離心管中加入蒸餾水5ml輕微震蕩制成懸浮液。（3） 將懸浮液加到比色皿中，測其吸光度值。 測定的OD600值填入下表。 編號對照012345678發(fā)