蛋白濃度測(cè)定(完成)

1、.蛋白濃度測(cè)定蛋白質(zhì)的定量分析是生物化學(xué)和其它生命學(xué)科最常涉及的分析內(nèi)容，是臨床上診斷疾病及檢查康復(fù)情況的重要指標(biāo)，也是許多生物制品，藥物、食品質(zhì)量檢測(cè)的重要指標(biāo)。在生化實(shí)驗(yàn)中，對(duì)樣品中的蛋白質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確可靠的定量分析，則是經(jīng)常進(jìn)行的一項(xiàng)非常重要的工作。 蛋白質(zhì)是一種十分重要的生物大分子：它的種類(lèi)很多，結(jié)構(gòu)不均一，分子量又相差很大，功能各異，這樣就給建立一個(gè)理想而又通用的蛋白質(zhì)定量分析的方法代來(lái)了許多具體的困難。目前測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法有很多種，下面列出根據(jù)蛋白質(zhì)不同性質(zhì)建立的一些蛋白質(zhì)測(cè)定方法：物理性質(zhì)：紫外分光光度法化學(xué)性質(zhì)：凱氏定氮法、雙縮脲法、lowry 法，bca法，膠體金法染色性質(zhì)：

2、考馬氏亮藍(lán)染色法、銀染法其他性質(zhì)：熒光法 蛋白質(zhì)測(cè)定的方法很多，但每種方法都有其特點(diǎn)和局限性，因而需要在了解各種方法的基礎(chǔ)上根據(jù)不同情況選用恰當(dāng)?shù)姆椒ǎ詽M(mǎn)足不同的要求。例如凱氏定氮法結(jié)果最精確，但操作復(fù)雜，用于大批量樣品的測(cè)試則不太合格；雙縮脲法操作簡(jiǎn)單，線(xiàn)性關(guān)系好，但靈敏度差，樣品需要量大，測(cè)量范圍窄，因此在科研上的應(yīng)用受到限制；而酚試劑法彌補(bǔ)了它的缺點(diǎn)，因而在科研中被廣泛采用，但是它的干擾因素多；考馬氏亮蘭染色法因其靈敏而又簡(jiǎn)便開(kāi)始重新受到關(guān)注；bca法又以其試劑穩(wěn)定，抗干擾能力較強(qiáng)，結(jié)果穩(wěn)定，靈敏度高而受到歡迎；膠體金法具有較高的靈敏度，可達(dá)到毫微克水平，用于微量蛋白的測(cè)定。常用的測(cè)定

3、蛋白質(zhì)含量方法的比較方 法測(cè)定范圍（g/ml）不同種類(lèi)蛋白的差異最大吸收波長(zhǎng)(nm)特 點(diǎn)凱氏定氮法小標(biāo)準(zhǔn)方法，準(zhǔn)確，操作麻煩，費(fèi)時(shí)，靈敏度低，適用于標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)定紫外分光光度法1001000大280205靈敏，快速，不消耗樣品，核酸類(lèi)物質(zhì)有影響雙縮脲法100010000小540重復(fù)性、線(xiàn)性關(guān)系好，靈敏度低，測(cè)定范圍窄，樣品需要量大folin-酚試劑法20500大750靈敏，費(fèi)時(shí)較長(zhǎng)，干擾物質(zhì)多考馬氏亮藍(lán)g-25050500大595靈敏度高，穩(wěn)定，誤差較大，顏色會(huì)轉(zhuǎn)移bca50500大562靈敏度高，穩(wěn)定，干擾因素少，費(fèi)時(shí)較長(zhǎng)由于凱氏定氮法的操作作過(guò)于復(fù)雜，雙縮脲法的靈敏度又太低，下面介紹foli

4、n酚試劑法，考馬氏亮藍(lán)g250染色法，紫外分光光度法、膠體金法等幾種最常用使用的方法。精品.試驗(yàn)一：bca法bca法測(cè)定蛋白濃度不受絕大部分樣品中的化學(xué)物質(zhì)的影響。在組織細(xì)胞裂解實(shí)驗(yàn)中，常用濃度的去垢劑sds，triton x-100，tween不影響檢測(cè)結(jié)果，但受螯合劑(edta，egta)、還原劑（dtt，巰基乙醇）和脂類(lèi)的影響。基本原理：堿性條件下，蛋白將cu2+還原為cu+， cu+與bca試劑形成紫顏色的絡(luò)合物，測(cè)定其在562nm處的吸收值，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)比，即可計(jì)算待測(cè)蛋白的濃度。主要特點(diǎn) 1. 準(zhǔn)確靈敏, 線(xiàn)性范圍廣： bca試劑的蛋白質(zhì)測(cè)定范圍是102000ug/ml； 2.

5、快速：45分鐘內(nèi)完成測(cè)定，比經(jīng)典的lowry法快4倍而且更加方便。 3. 經(jīng)濟(jì)實(shí)用：在微孔板中進(jìn)行測(cè)定，可大大節(jié)約樣品和試劑用量。 4. 不受樣品中離子型和非離子型去污劑影響。 5. 檢測(cè)不同蛋白質(zhì)分子的變異系數(shù)遠(yuǎn)小于考馬氏亮藍(lán)。試劑要求 bca試劑a, b液室溫保存，蛋白標(biāo)準(zhǔn)(5mg/ml) -20保存儀器準(zhǔn)備96孔板，酶標(biāo)儀，37恒溫箱使用說(shuō)明 1. 配制工作液: 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品數(shù)量，按體積比a ：b （50：1）配制適量bca工作液，充分混勻。bca工作液室溫24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。2. 稀釋標(biāo)準(zhǔn)品：取10微升標(biāo)準(zhǔn)品用pbs稀釋至100ul（標(biāo)準(zhǔn)品一般可用pbs稀釋?zhuān)?，使終濃度為0.5mg/m

6、l。將標(biāo)準(zhǔn)品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20ul加到96孔板的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品孔中，加pbs補(bǔ)足到20ul?；蛘咭勒障旅娴谋砀裰性O(shè)置的濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。 3. 加適當(dāng)體積樣品到96孔板的樣品孔中，補(bǔ)加pbs到20ul。一般蛋白樣品可以幾個(gè)不同的稀釋比例檢測(cè)，常用的是每孔中加入1ul，2ul，4ul樣品，補(bǔ)加pbs到20ul。 4. 各孔加入200ul bca工作液，37放置30分鐘。5. 冷卻到室溫，用酶標(biāo)儀562nm測(cè)定od值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出蛋白濃度。精品.20ul體系蛋白濃度mg/ml加入c液量ul補(bǔ)足pbs量ul00200.050.219.80.10.419.60.20.

7、819.20.31.218.80.41.618.40.52180.62.417.60.72.817.20.83.216.80.93.616.414161.561428122.5101031283.514641645200注意事項(xiàng)1. 在低溫條件或長(zhǎng)期保存出現(xiàn)沉淀時(shí)，可攪拌或37溫育使溶解, 如發(fā)現(xiàn)細(xì)菌污染則應(yīng)丟棄。2. 樣品中若含有edta、egta、dtt、硫酸銨、脂類(lèi)會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果，請(qǐng)?jiān)囉胋radford蛋白濃度測(cè)定試劑盒；高濃度的去垢劑也影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可用tca沉淀去除干擾物質(zhì)。 3要得到更為精確的蛋白濃度結(jié)果，每個(gè)蛋白梯度和樣品均需做復(fù)孔, 每次均應(yīng)做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。 4當(dāng)試劑a和b混合時(shí)可

8、能會(huì)有渾濁，但混勻后就會(huì)消失，工作液在密閉情況下可保存1周。 5需準(zhǔn)備37水浴或溫箱、酶標(biāo)儀或普通分光光度計(jì)，測(cè)定波長(zhǎng)為540-595nm之間，562nm最佳。酶標(biāo)儀需與96孔酶標(biāo)板配套使用。使用分光光度計(jì)測(cè)定蛋白濃度時(shí)，試劑盒測(cè)定的樣品數(shù)量會(huì)因此而減 少。使用溫箱孵育時(shí)，應(yīng)注意防止因水粉蒸發(fā)影響檢測(cè)結(jié)果。精品.二、考馬氏亮藍(lán)g250染色法（bradford法）此方法是1976年bradform建立。染料結(jié)合法測(cè)定蛋白質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度較高，可檢測(cè)到微量蛋白，操作簡(jiǎn)便、快迅，試劑配制極簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，但干擾因素多?！驹?理】考馬氏亮藍(lán)g250具有紅色和青色兩種色調(diào)、在酸性溶液中游離狀度下為棕紅色

9、，當(dāng)它通過(guò)疏水作用與蛋白質(zhì)結(jié)合后，變成藍(lán)色，最大吸收波長(zhǎng)從465nm轉(zhuǎn)移到595nm處，在一定的范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)含量與 595nm的吸光度成正比，測(cè)定595nm處光密度值的增加即可進(jìn)行蛋白質(zhì)的定量?！静僮鞑襟E】1、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備：按下表操作，在試管中分別加入0、20、40、80、100微克蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，用水補(bǔ)足到100微升，加入3ml的染色液，混勻后室溫放置15分鐘。編號(hào)123456蛋白標(biāo)準(zhǔn)(ml)00.020.040.060.080.10蒸餾水(ml)0.100.080.060.040.020染色液(ml)333333在595nm波長(zhǎng)比色，讀出吸光度，以各管的標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度為橫坐標(biāo)，以其吸光度為

10、縱坐標(biāo)繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。2、血清蛋白質(zhì)測(cè)定稀釋血清（或其它蛋白樣品溶液），準(zhǔn)確吸取0.1ml血清，置入50ml容量瓶中，用生理鹽水稀釋至刻度（此為稀釋500倍，其它蛋白樣品酌情而定）。再取三只試管，分別標(biāo)以1、2、3號(hào)，按下表操作。混勻后室溫放置15分鐘，在595nm波長(zhǎng)比色，計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。試劑(毫升)1(空白管)2(標(biāo)準(zhǔn)管)3(樣品管)蒸餾水0.1蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)0.1稀釋血清0.1染色液333【計(jì) 算】每100毫升血清中蛋白質(zhì)的含量（g）精品.【試 劑】1、考馬氏亮藍(lán)g250染色液：稱(chēng)取100mg考馬氏亮藍(lán)g250溶解于50毫升95的乙醇中，加入100 毫升85的磷酸，加入稀釋到1升。2、蛋白標(biāo)準(zhǔn)

11、（0.1mg/ml）準(zhǔn)確稱(chēng)取10mg牛血清白蛋白，在100ml容量瓶中加生理鹽水至刻度，溶后分裝，20冰箱保存?！咀⒁馐马?xiàng)】1、常用試劑的干擾：有些常用試劑在測(cè)定中會(huì)受到不同程度的干擾。tris、巰基乙醇、蔗糖、甘油、edta及少量去垢劑有較少影響，而1sds、1 tritonx-100及1hemosol的干擾嚴(yán)重。2、顯色結(jié)果受時(shí)間與溫度影響較大，須注意保證樣品與標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)定控制在同一條件下進(jìn)行。3、考馬氏亮藍(lán)g250染色能力很強(qiáng)，特別要注意比色杯的清洗。顏色的吸附對(duì)本次測(cè)定影響很大。可將測(cè)量杯在0.1mol/l hcl中浸泡數(shù)小時(shí)，再?zèng)_洗干凈即可。精品.三、紫外分光光度法紫外光譜吸收法測(cè)定蛋

12、白質(zhì)含量是將蛋白質(zhì)溶液直接在紫外分光光度計(jì)中測(cè)定的方法，不需要任何試劑，操作很簡(jiǎn)便，而且樣品可以回收?！驹?理】蛋白質(zhì)溶液在280nm附近有強(qiáng)烈的吸收，這是由于蛋白質(zhì)中酪氨酸、色氨酸殘基而引起的，所以光密度受這兩種氨基酸含量的支配。另外核蛋白或提取過(guò)程中雜有的核酸對(duì)測(cè)定結(jié)果引起極大誤差，其最大吸收在260nm。所以同時(shí)測(cè)定280及260nm兩種波長(zhǎng)的吸光度，通過(guò)計(jì)算可得較為正確的蛋白質(zhì)含量?！静?作】將待測(cè)蛋白質(zhì)溶液適當(dāng)稀釋k倍，在紫外分光度計(jì)中分別測(cè)定樣品在10mm光徑石英比色皿中，分別在280nm及260nm兩種波長(zhǎng)下的吸光度值a280和a260?！居?jì) 算】1、當(dāng)?shù)鞍讟悠返奈馐毡戎礱28

13、0a260約為1.8，可用下面的公試進(jìn)行計(jì)算：蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）（1.45a280 0.74a260）k（稀釋倍數(shù)）2、也可以先計(jì)算出a280a260的比值后從下表中查出校正因子 “f”值，由下面的經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算出溶液的蛋白質(zhì)濃度。同時(shí)從表中還可以查出樣品中混雜的核酸的百分含量：蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）fa280 ka280/a260核酸(%)fa280/a260核酸(%)f1.750.001.1160.8465.500.6561.630.251.0810.8226.000.6321.520.501.0540.8046.500.6071.400.751.0230.7847.000.5851

14、.361.000.9940.7677.500.5651.301.250.9750.7538.000.5451.251.500.9440.7309.000.5081.162.000.8990.70510.000.4781.092.500.8520.67112.000.4221.033.000.8140.64414.000.3770.9793.500.7760.61517.000.3220.9394.000.7430.59520.000.2780.8745.000.682注：一般純凈蛋白質(zhì)的光吸收比值a280/a260約為1.8，而核酸a280/a260的比值約為0.5?！痉椒ㄔu(píng)價(jià)】操作簡(jiǎn)便、樣品

15、溶液可回收，同時(shí)可估計(jì)核酸含量。但核酸含量小于20或溶液混濁、則測(cè)定結(jié)果誤差較大。在使用上表和公式計(jì)算時(shí)也應(yīng)注意各種蛋白質(zhì)和各種核酸在 280nm及260nm處的光吸收值也不盡相同，故計(jì)算結(jié)果有一定誤差。四、雙縮脲法精品.【原 理】利用半飽和硫酸銨或27.8硫酸鈉亞硫酸鈉可使血清球蛋白沉淀下來(lái)，而此時(shí)血清白蛋白仍處于溶解狀態(tài)，因此可把兩者分開(kāi)，這種利用不同濃度的中性鹽分離蛋白的方法稱(chēng)為鹽方法。鹽析分離蛋白質(zhì)的方法不僅用于臨床醫(yī)學(xué)，而且還廣泛地用于生物化學(xué)研究工作中，如一些特殊蛋白質(zhì)酶、蛋白激素等的分離和純化。蛋白質(zhì)和雙縮脲一樣，在堿性溶液中能與銅離子形成紫色絡(luò)合物（雙縮脲反應(yīng)），且其呈色深淺與

16、蛋白質(zhì)的含量成正比，因此可于蛋白質(zhì)的定量測(cè)定。但必須注意，此反應(yīng)并非蛋白質(zhì)所特有，凡分子內(nèi)有兩個(gè)或兩個(gè)以上的肽鍵的化合物以及分子內(nèi)有ch2nh2等結(jié)構(gòu)化合物，雙縮脲反應(yīng)也呈陽(yáng)性。本實(shí)驗(yàn)用27.8硫酸鈉亞硫酸鈉溶液稀釋血清，取出一部分用雙縮脲反應(yīng)測(cè)定蛋白質(zhì)的含量，剩余部分則用濾紙過(guò)濾，使析出的球蛋白與白蛋白分離，取出濾液用同一反應(yīng)測(cè)定白蛋白的含量?？偟鞍着c白蛋白含量之差即球蛋白的含量。白蛋白與球蛋白之比即所謂的白球比值。【操 作】1、取中試管4支，分別標(biāo)以“1”、“2”、“3”、“4”，吸取27.8硫酸鈉亞硫酸鈉1ml，置“1”管中備用。2、吸取血清0.2ml于另一試管中，加27.8硫酸鈉一亞硫

17、酸鈉4.8ml，用拇指壓住管口倒轉(zhuǎn)混合56次，放置約15秒，用1ml刻度管吸取1ml置于管 “4”中（總蛋白測(cè)定管）。3、將剩余的血清混懸液（如濾液不清，可重復(fù)過(guò)濾，直至澄清為止），用另一支1ml刻度吸管取此液1ml，置于管 “3”（白蛋白測(cè)定管）。4、另用一支1ml刻度吸管吸取標(biāo)準(zhǔn)血清1ml，置管“2”中（標(biāo)準(zhǔn)管）。5、于上述4支試管中分別加入雙縮脲試劑4ml，混勻。6、在室溫下放置10分鐘后，以管“1”（空白管）調(diào)零，在540nm的波長(zhǎng)下進(jìn)行比色，分別記錄“2”、“3”、“4”管的光密讀數(shù)【計(jì) 算】血清球蛋白含量（克100ml）總蛋白含量白蛋白含量白：球比值白蛋白含量球蛋白含量。【臨床意義

18、】正常人每100ml血清中含蛋白質(zhì)68克，平均7克左右，白球比為1.52.5:1。長(zhǎng)期營(yíng)養(yǎng)不良，肝臟疾病，慢性腎炎時(shí)，總蛋白含量降低；大量失水（如嘔吐、腹瀉）時(shí)則升高。肝臟疾病、慢性腎炎以及慢性傳染病有大量抗體生成時(shí)，白球比值變小，甚至倒置?！驹噭┡c器材】（一）器材1、中試管 6支。2、刻度吸管：0.2ml、5ml、10ml、1ml。3、玻璃精品.漏斗。4、快速濾紙。5、分光光度計(jì)。（二）試劑1、27.8硫酸鈉亞硫酸鈉溶液：取濃硫酸2ml加到900ml蒸餾水中，將此含酸蒸餾水加于盛有無(wú)水硫酸鈉208克及無(wú)水亞硫酸鈉 70克，的燒杯中，邊加邊攪拌，待液解后全部移至1000ml容量瓶中，加蒸餾水至

19、刻度。取此溶液1ml，加蒸餾水24ml，檢查其ph，應(yīng)為7或略高于 7，本試劑應(yīng)貯于25溫箱中。2、雙縮脲試劑：稱(chēng)取硫酸銅（cuso45h2o）1.5克及石酒石酸鉀鈉（c4h4o6kna4h2o）6克，分別用適量蒸餾水溶解，混合后加入10naoh溶液300ml，最后加蒸餾水至1000ml。3、標(biāo)準(zhǔn)血清：取經(jīng)凱氏定氮標(biāo)定后的血清用15的 nacl溶液稀釋25倍，貯于冰箱中備用。【注意事項(xiàng)】（一）硫酸鈉的溶解度與溫度有關(guān)，溫度低于30易結(jié)晶析出，故室溫較低時(shí)應(yīng)在37水浴或恒溫箱進(jìn)行保溫。（二）血清樣品必須新鮮，如有細(xì)菌污染或溶血，則不能得到正確的結(jié)果。（三）含脂類(lèi)較多的血清，可用乙醚3ml抽提一次

20、后再進(jìn)行測(cè)定。五、 folin酚試劑法（又名lowry）法目前實(shí)驗(yàn)室較多用用folin-酚法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，此法的特點(diǎn)是靈敏度高，較雙縮脲高兩個(gè)數(shù)量級(jí)，較紫外法略高，操作稍微麻煩，反應(yīng)約在15分鐘有最大顯色，并最少可穩(wěn)定幾個(gè)小時(shí)，其不足之處是干擾因素較多，有較多種類(lèi)的物質(zhì)都會(huì)影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性?！驹?理】蛋白質(zhì)中含有酚基的酪氨酸，可與酚試劑中的磷鉬鎢酸作用產(chǎn)生蘭色化合物，顏色深淺與蛋白含量成正比。【操 作】1、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備：按下表操作，在精品.試管中分別加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1ml蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，用生理鹽水補(bǔ)足到 1ml。加入5ml的堿性酮試劑，混勻后室溫放置20分鐘后，再

21、加入0.5ml酚試劑混勻。編 號(hào)123456蛋白標(biāo)準(zhǔn)（ml）00.20.40.60.81.00.9% nacl（ml）1.00.80.60.40.20堿性酮試劑（ml）555555混勻后室溫(25)放置20分鐘酚試劑（ml）0.50.50.50.50.50.530分鐘后，以第1管為空白，在650nm波長(zhǎng)比色，讀出吸光度，以各客的標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度為橫坐標(biāo)，以其吸光度為縱坐標(biāo)繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。2、血清蛋白質(zhì)測(cè)定。稀釋血清（或其它蛋白樣品濃度）：準(zhǔn)確吸取0.1ml血清，置于50ml容量瓶中，用生理鹽水釋釋至刻度（此為稀釋500倍，其它蛋白樣品酌情而定）。再取三只試管，分別標(biāo)以1、2、3號(hào)，按下表操作：編 號(hào)測(cè)定管標(biāo)準(zhǔn)管空白管稀釋標(biāo)本(ml)0.2稀釋標(biāo)準(zhǔn)液(ml)0.20.9%nacl(ml)0.2堿性酮液(ml)1.01.01.0混勻后于室溫放置20分鐘酚試劑(ml)0.10.10.1混勻各管，30分鐘后，在波長(zhǎng)650nm比色，讀取吸光度?！居?jì)