第節(jié)藻種分離和保存

1、第四節(jié) 藻種的選擇、分離、培養(yǎng)和保存,一、選 種,1 選種的意義 選擇出合乎人們生產(chǎn)需要的優(yōu)良品種。 所選擇的生物種應(yīng)具有下列特征： 生長(zhǎng)迅速； 對(duì)極端的溫度和輻射條件的耐性范圍大； 蛋白質(zhì)，脂類和糖類含量高，或有選擇地積累一種特殊的代謝產(chǎn)物（如甘油）； 無(wú)毒性，且易于收獲。,2種和品種 ( l ）種：生物分類上的基本單位 ( 2 ）品種：同一種生物個(gè)體，受環(huán)境影響會(huì)形成一些性狀差異，具有各種性狀差異的個(gè)體被區(qū)分開，稱“品種”,3選育種的方法 （ l ）選擇育種：在單細(xì)胞藻類生產(chǎn)的過(guò)程中，不經(jīng)過(guò)人為的處理而是利用其自然發(fā)生變異，有目的地、定向地把具有符合生產(chǎn)要求的優(yōu)良性狀（生活力強(qiáng)、生長(zhǎng)快、繁

2、殖快、耐高溫等）的藻種留下進(jìn)培育。 （ 2 ）誘變育種：通過(guò)誘變劑處理（亞硝酸、鈷60、快中子、氯化鋰、紫外線等），使藻細(xì)胞發(fā)生大量變異從中選出具有優(yōu)良性狀的變異個(gè)體。,4接種： 液體接種：將藻液直接加入培養(yǎng)液中進(jìn)行攪拌，加入的藻種分量視水溫而定，水溫較低（10）時(shí)多加，約占培養(yǎng)液總量的3040左右；水溫適宜時(shí)（2530），可加58左右。 干藻接種是用干藻的藻體接種，接種量為0.10.2。,二、藻種分離,1意義：為了要進(jìn)行某種藻類的科學(xué)研究或大量培養(yǎng)，有必要把某種藻類與其他生物分離。 因?yàn)樵谂囵B(yǎng)和生產(chǎn)過(guò)程中要受敵害生物的污染，只有分離出”純種”進(jìn)行培養(yǎng)，才能獲得好效果。,2 、藻種的單種培養(yǎng)和

3、純種培養(yǎng) ( 1 ）單種培養(yǎng)：分離培養(yǎng)的藻種雖然只有一種，但還混雜細(xì)菌的生長(zhǎng)。 ( 2 ）純種培養(yǎng)：分離培養(yǎng)的藻種，僅只有藻種一種，而且無(wú)其它生物混雜。,3 藻種的采樣及預(yù)備培養(yǎng) （l）決定分離培養(yǎng)的種類 （2）采用含有該藻種的水樣（用 25 號(hào)網(wǎng)采集或刮取附著藻類） （3）鏡檢采回水樣,( 4 ）預(yù)備培養(yǎng)： 培養(yǎng)液：濃度小，為原配方的1/2 、1/3、1/4 ，對(duì)難培養(yǎng)的藻類要加入土壤浸出液：如果水樣中各種種類多，就要用幾種不同的培養(yǎng)液，使藻類在適宜培養(yǎng)液中繁殖 容器：三角燒瓶、試管（250ml 瓶中加入 100ml 培養(yǎng)液） 管理：每天搖動(dòng)一次,4 藻種的分離方法 1離心法： 將混合液用離

4、心機(jī)離心，水中不同藻體及細(xì)菌就以不同的速度下沉，因此得以分開。 將不同時(shí)間下從導(dǎo)管底的藻體取出，經(jīng)鏡檢選定某種藻類最多的沉積物，再加清水，繼續(xù)離心，如此反復(fù)就可得到比較單純的藻體，再接種相應(yīng)培養(yǎng)液中培養(yǎng)。 優(yōu)點(diǎn)：可消除細(xì)菌，并增加純粹分離的可能性，至少可作為藻種平板培養(yǎng)的準(zhǔn)備工作。另外，在水液中藻體含量較少時(shí)，可用此法集中藻體。 缺點(diǎn)：不能做到使不同藻類完全分離。,* 2稀釋法：該法源于中野治房（1933）的方法。用已消毒試管5只，在第1管盛蒸餾水10mL，第25管都裝5mL，用高壓蒸汽消毒，待冷卻后，第1管用滴管滴入混合藻液12滴，充分振蕩，使均勻稀釋。次用消毒吸管，從第1管中吸取5mL滴入

5、第2管中如前振蕩，使均勻稀釋充分震蕩后再取5毫升到第三支試管中，如此直至第五個(gè)試管。然后把五個(gè)已盛有消毒的瓊膠培養(yǎng)基培養(yǎng)皿，加熱使之溶解，待冷卻而尚未凝固時(shí)，分別滴入五個(gè)試管的藻液各一滴，用力振蕩，使藻液充分混入培養(yǎng)基中。待冷凝后，把五個(gè)培養(yǎng)皿放在受著漫射光窗口，一直到出現(xiàn)藻群時(shí)為止。在20左右時(shí)，約10天即出現(xiàn)藻群。用消過(guò)毒的白金絲取些藻群，進(jìn)行瓊膠固體培養(yǎng)基的不通氣培養(yǎng)。,此過(guò)程反復(fù)多次，直至得到完全分離的純?cè)宸N群為止。 此法稀釋要使用較多容器分組培養(yǎng)，比較麻煩，但較易成功,* 3微吸管法： 選直徑5mm的細(xì)玻璃管在酒精噴燈上拉成極細(xì)的微吸管（口徑0.0080.16mm），將稀釋的藻液置于

6、凹玻片上（或?qū)⑺畼釉谳d玻片上滴成綠豆粒大小的一些水滴，這樣可使每個(gè)水滴中有很少生物而便于分離），在解剖鏡下用微吸管吸出所需要的藻種放入另一凹玻片上（用蒸餾水或平衡礦物質(zhì)溶液沖洗數(shù)次），鏡檢這滴水中是否達(dá)到純的要求，如不純要反復(fù)數(shù)次，直至達(dá)到分離的目的為止，然后移入滅菌的培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)（先導(dǎo)入有培養(yǎng)基的小培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，待生長(zhǎng)旺盛后，再擴(kuò)大培養(yǎng)）。 此種方法適合于大型藻類和浮游動(dòng)物。 技術(shù)操作要求高，細(xì)心，吸取一個(gè)細(xì)胞要反復(fù)幾次才能成功。,4趨向反應(yīng)法：利用藻類的特殊趨向性（如向光、向地等）不同而分離藻體。此過(guò)程反復(fù)幾次就可得到一定純度的藻體。分離效果較好，只是不能應(yīng)用于不運(yùn)動(dòng)的藻體。,*5平板

7、分離法： 平板培養(yǎng)基的制備 A選擇恰當(dāng)?shù)臒o(wú)機(jī)培養(yǎng)液，加入 1瓊脂（剪成細(xì)條）放在培養(yǎng)液中浸泡 B. 加熱融化，攪拌，并且補(bǔ)充蒸發(fā)掉的水分 C分裝：冷卻后分裝在培養(yǎng)皿中，約0.30.5cm 厚 D滅菌：高壓蒸氣滅菌，間歇蒸氣滅菌, 接種：用滅菌淡水稀釋水樣至適宜的濃度，裝入消毒過(guò)的小型噴霧器中，噴于培養(yǎng)基上，形成均勻分布的一層小水珠（或用接種環(huán)），蓋上培養(yǎng)皿的蓋子，在適宜的光照條件下培養(yǎng) 10 天左右，鏡檢各群落，找出純?cè)迦郝洌孟静Ａп樔〕?，移入培養(yǎng)液中，如果未達(dá)到目的，需反復(fù)進(jìn)行。 步驟：無(wú)機(jī)培養(yǎng)液 l瓊脂加熱融化、攪拌冷卻分裝消毒接種培養(yǎng)。,6固氮藍(lán)藻分離培養(yǎng)法：將一小片藻絲群接種到培養(yǎng)

8、基上，幾天后再用滅菌白金絲挑取生出的新藻絲接種到平板培養(yǎng)基上。這樣經(jīng)幾次分離接種就得到較純的藻種。,* 7水滴分離法 用微吸管吸取稀釋適度的藻液，滴到消毒過(guò)的載玻片上，水滴盡可能小，能在鏡下（低倍）看到整個(gè)視野的全部水滴或大部分，一個(gè)載玻片上放 24 滴，作直線排列，水滴間要有一定的距，如果一滴水內(nèi)有 1至幾個(gè)所需要的同種藻細(xì)胞，并無(wú)其它生物混雜，即用微吸管吸取培養(yǎng)液把這滴水沖入裝有培養(yǎng)液并經(jīng)過(guò)消毒滅菌的試管或小三角燒瓶中不成功要反復(fù)做 此法簡(jiǎn)便，易操作，適宜分離優(yōu)勢(shì)種類,三、藻種培養(yǎng),1、容器消毒：100, 200, 300, 500,1000, 1500ml三角燒瓶 2、工具（微吸管、接種

9、環(huán)、載玻片等）和培養(yǎng)液消毒 3、培養(yǎng)液置于容器中加入藻種，并用消毒紙包扎瓶口 4、在適宜光照下進(jìn)行培養(yǎng)，每天搖動(dòng)二次 5、鏡檢：觀察有否異常情況，是否受敵害生物侵襲 6、移養(yǎng)：經(jīng)過(guò)一個(gè)星期培養(yǎng)，可進(jìn)行移養(yǎng),四、藻種的保存,1 意義：在一定時(shí)間內(nèi)供接種用，免去重復(fù)分離，保持純種可以節(jié)省時(shí)間 2 方法 （瓊脂斜面保存） (l）制備固體培養(yǎng)基 容器： 500ml三角燒瓶、克氏扁瓶、試管 消毒：化學(xué)或物理方法 營(yíng)養(yǎng)液的濃度：比正常高出1倍，加入瓊脂1 1.5% ，加熱融化，冷卻 分裝：將制備好的固體倍養(yǎng)基分裝于容器中，試管裝1/4制成斜面，三角燒瓶、克氏扁瓶裝量厚度為0.50.8cm ，冷卻在水平桌上

10、 滅菌、消毒：在制成斜面或平面以前進(jìn)行,（2）接種：接種于冷卻的固體培養(yǎng)基上。接種后用消毒紙封口，接種后再在固體培養(yǎng)基上加培養(yǎng)液，以防止干燥。 （3）培養(yǎng)：置于弱光下培養(yǎng)，使其慢慢生長(zhǎng)，長(zhǎng)到一定密度，放入 5 的冰箱中，可保存一年：如果每天接受短弱的光照（幾小時(shí)）可保存 23 年；在完全黑暗的條件下，保存時(shí)間大大縮短。,藻種保存的其他方法,液 氮 保 存 固定化保存 液 體 保 存 減少接種量 加大氮素濃度 液體低溫保存,五、復(fù)習(xí)題：,1選種和育種具有什么意義？ 2選擇育種有哪幾種方法？ 3闡述藻種分離的方法及其特點(diǎn)？為什么要進(jìn)行藻種分離？ 4如何進(jìn)行藻種培養(yǎng)？ 5闡述保存藻種的操作過(guò)程？藻種

11、的保存應(yīng)注意哪些方面的問(wèn)題？ 6如何制備固體培養(yǎng)基？,附：分析技術(shù) 1細(xì)胞計(jì)數(shù)顯微鏡法 培養(yǎng)物中的個(gè)體數(shù)測(cè)定，是按照個(gè)體計(jì)數(shù)方法，測(cè)定和估計(jì)培養(yǎng)物單位容積中的個(gè)體數(shù)。計(jì)數(shù)方法同浮游植物定量的方法。此外，也可以采用血球計(jì)數(shù)法。 2分光光度計(jì)法： 培養(yǎng)物的藻類密度也可用分光光度計(jì)測(cè)定。當(dāng)藻類密度較低時(shí)，光徑中的細(xì)胞數(shù)與測(cè)量到的光密度有一簡(jiǎn)單的幾何關(guān)系。在藻類密度不大時(shí)，光密度大，細(xì)胞數(shù)目就多，即可用測(cè)得的光密度值表示細(xì)胞數(shù)目。,3干重測(cè)定 測(cè)定干重的增加量是生產(chǎn)估測(cè)方法中的一個(gè)最直接的方法，其步驟如下： 取樣取有代表性的一小部分體積的藻液。取樣時(shí)要特別注意：a將培養(yǎng)物攪拌均勻b快速吸取樣品以免沉積

12、c足夠多的樣品 分離取出樣品后，用過(guò)濾膜過(guò)濾或用離心法把藻體與介質(zhì)分開。細(xì)胞必須洗過(guò)以除去鹽分和其它污物，通常是用稀釋的培養(yǎng)液或緩沖液。海洋藻類不能用蒸餾水洗，以免質(zhì)壁分離和細(xì)胞脹破。 干燥選擇對(duì)特定有機(jī)體最適的烘干溫度。a避免過(guò)熱b有好的重復(fù)性c對(duì)同一樣品烘1小時(shí)后，稱得統(tǒng)一重量。 測(cè)定結(jié)果的表示法所得干重測(cè)定值要以單位培養(yǎng)液體積的干重表示。室外的培養(yǎng)池則用單位照光面積的干重來(lái)表示。,附：一些已大量培養(yǎng)利用藻類的生態(tài)適應(yīng)性,三角褐指藻Phaeodactylum tricornutum隸屬于硅藻門。體長(zhǎng)2628m。繁殖方法為平行分裂。培養(yǎng)的生態(tài)條件為生存pH710，最適pH7.58.5；生存鹽

13、度992，最適鹽度2532；生長(zhǎng)適溫525，最適溫度1020。新月菱形藻Nitzschia clostertum隸屬于硅藻門。1323m。繁殖方法為縱分裂。培養(yǎng)的生態(tài)條件為生存pH710，最適pH7.58.5；生存鹽度1861.5，最適鹽度2532；生長(zhǎng)適溫528，最適溫度：1520。牟氏角毛藻Chaetoceros muelleri隸屬于硅藻門。（4.04.9）（5.58.4）m。繁殖方法為無(wú)性為二分裂，環(huán)境不良形成休眠孢子。培養(yǎng)的生態(tài)條件為最適pH8.08.9；最適鹽度：1025；生長(zhǎng)適溫530，最適溫度：2530。,纖細(xì)角毛藻Chaetoceros gracilis隸屬于硅藻門。574m

14、。繁殖方法為無(wú)性為二分裂也可有性生殖；環(huán)境不良形成休眠孢子。培養(yǎng)的生態(tài)條件為最適鹽度1535；最適溫度2830。中肋骨條藻Skeletonema costatum隸屬于硅藻門。直徑67m。繁殖方法為無(wú)性二分裂，也可形成增大孢子。培養(yǎng)的生態(tài)條件為最適pH7.58.5；最適鹽度2530；生長(zhǎng)適溫832，最適溫度2025。亞心形扁藻Platymonas subcordiformis隸屬于綠藻門。(1116 )(79) 。繁殖方法為無(wú)性繁殖，動(dòng)孢子，環(huán)境不良形成休眠孢子。培養(yǎng)的生態(tài)條件為生存pH69，最適pH7.58.5；生存鹽度880，最適鹽度3040；生長(zhǎng)適溫730，最適溫度2028。,鹽藻Dun

15、aliella sp. 隸屬于綠藻門。1216m，寬812m。培養(yǎng)的生態(tài)條件為生存pH79，最適pH7.08.5；最適鹽度6070；最適溫度2530。小球藻Chlorella spp. 隸屬于綠藻門。直徑35m。繁殖方法為細(xì)胞內(nèi)原生質(zhì)體分裂形成似親孢子，待細(xì)胞破裂后釋放。培養(yǎng)的生態(tài)條件為最適pH68；鹽度適宜范圍廣；生長(zhǎng)適溫1036，最適溫度25左右。微綠球藻Nannocholris oculata隸屬于綠藻門。直徑24m。繁殖方法為二分裂。培養(yǎng)的生態(tài)條件為最適pH7.58.5；生存鹽度436；生長(zhǎng)適溫1036，最適溫度2530。,球等鞭金藻Isochrysis galbana隸屬于金藻門。56m寬24m。繁殖方法為無(wú)性二分裂環(huán)境不良形成內(nèi)生孢子。培養(yǎng)的生態(tài)條件為生存鹽度1030；生長(zhǎng)適溫1035，最適溫度2530。湛江等鞭金藻Isochrysis galbana隸屬于金藻門，（67）（56）m，繁殖方法為無(wú)性二分裂，環(huán)境不良形成膠群體。培養(yǎng)的生態(tài)條件為生存pH69最適pH7.58.5；生存鹽度935，最適鹽度2532；生長(zhǎng)適溫935，最適溫度2532。綠色巴夫藻Isochrysis zhanjianggensis 隸屬于金藻門，64.84m，繁殖方法為縱分裂。培養(yǎng)的生態(tài)條件為生存鹽度580，最適鹽度1040；生長(zhǎng)適溫1035，最適