ELISA試驗的質(zhì)量保證

1、1,ELISA,測定技術(shù)的,發(fā)展和質(zhì)量控制,2,ELISA,試驗是一種敏感性高，特異,性強，重復(fù)性好的實驗診斷方法。由,于其試劑穩(wěn)定、易保存，操作簡便,結(jié)果判斷較客觀等因素，已廣泛應(yīng)用,在免疫學(xué)檢驗的各領(lǐng)域中。然而，影,響,ELISA,試驗結(jié)果的因素很多，故加,強各個環(huán)節(jié)的質(zhì)量保證才能充分發(fā)揮,其方法學(xué)的優(yōu)點,3,一,ELISA,試劑盒測定技術(shù)的發(fā)展,臨床測定技術(shù)的發(fā)展主要在于方法學(xué)的發(fā)展,而方法學(xué)的發(fā)展依托于試劑生產(chǎn)技術(shù)不斷進步更,新和型標記物的應(yīng)用。目前，分子生物學(xué)正在并,最終肯定會讓我們對整個生命科學(xué)有一個全面而,徹底的認識，其對免疫測定技術(shù)發(fā)展的影響也是,直接而又有效的，它使我們對以前

2、一些難以檢測,的生物活性物質(zhì)的測定變得輕而易舉，并且大大,提高了檢測的靈敏度和特異性,4,1,基因工程試劑對免疫測定技術(shù),發(fā),展,的,影,響,免疫測定技術(shù)的基礎(chǔ)在于抗原抗體之間的特異結(jié),合反應(yīng)，所以任何優(yōu)質(zhì)的診斷試劑離不開優(yōu)質(zhì)的,原料，如抗原抗體，酶等。以前用于免疫測定的,抗原通常為各種純化抗原，而抗體則為純化抗原,免疫動物后獲得的多克隆抗體和使用雜交瘤技術(shù),得到的單克隆抗體，而抗原或抗體的標記物如酶,標結(jié)合物則通過各總化學(xué)合成方法制備,近年來,隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，使用基因工程方法制備,各種特殊的抗原或抗體及其酶結(jié)合物等免疫測定,試劑幾成為現(xiàn)實的新一代試劑，各種新型使用的,測定方法也不斷出現(xiàn)

3、,5,HBsAg,試劑特點,檢測模式：臨,床抗體夾心法,包被抗體為山羊多抗，多抗具有高親和性和對抗原,各種表位的反應(yīng)性,酶表抗體為與,HBsAg,有不同結(jié)合位點的鼠復(fù)合單,位,可測得,HBsAg,變異樣品,提高檢測的特異性,99.98,提高檢測的靈敏度，應(yīng)用,Parl Ehrich,學(xué)說,PEI,HBsAg,標準品，對,ad,標準品的靈敏度為,0.05n,ml,對,ay,標準品靈敏度為,0.025ng/ml,例如,6,2,基,因,工,程,較早用于免疫測定的基因工程抗原是,HBcAg,和,HBsAg,這兩種基因工程抗原的出,現(xiàn)，較好地解決了抗,HBc,和,HBe,的測定問題,因為要從病毒本身去大

4、量獲取這兩種純抗原,較為困難，并且這一點對于難培養(yǎng)的病原微,生物來說，如,HIV,HCV,和梅毒螺旋體等都,有些共性,7,2.1 HCV-ELISA,試劑,HCV,目前尚不能體外培養(yǎng)，只能用基因工程,或化學(xué)合成方法獲取,HCV,結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)區(qū)的,各種抗原片斷，已知,HCV,基因組有,7,個功能,區(qū)組成：核心,E,1,E,2,NS,1,NS,2,NS,3,NS,4,NS,5,有分為,NS,5a,和,NS,5b,區(qū)，合成抗原的,優(yōu)點是易于純化，特異性好，抗原抗體反應(yīng),強,8,2.1.1,第一代抗,HCV-ELISA,試劑盒,由美國,ortho,公司克隆,C,1003,抗原幾個片斷與人超氧化物歧化酶

5、,SOD,結(jié)合。用酵母從病毒基因組非結(jié)合區(qū)得到表達，表達,為融合蛋白，亦作為包被固相載體,抗原組合,NS,4,區(qū)二個基因片斷為,NS,5-1-1,和,C,1003,特性,IgG,抗,C,100,在發(fā)病后數(shù)月后，才檢出，故不宜作早期診,斷,約由,20,的病人不出現(xiàn)抗體,IgM,抗,C,100,急性期檢出率只有,64,C,100,的抗原性較弱，在,HCV,復(fù)制中，不能充分暴露宿主的免疫,系統(tǒng),特異性和靈敏性較差,9,2.1.2,第二代,HCV-ELISA,試劑盒,用基因重組的,HCV,結(jié)構(gòu)蛋白與非結(jié)構(gòu)蛋白抗,原包被固相載體,抗原組合：核心區(qū),C,區(qū)）多肽,C,22,NS,區(qū),多肽,C,33,C,1

6、003,和,NS,5-1-1,增加,C,22,區(qū)和,C,33,區(qū)后，抗體出現(xiàn)早，有助早,期診斷，提高陽性率。有利早期診斷,C,22,是早期易出現(xiàn)病毒血癥,10,2.1.3,第三代,HCV-ELISA,試劑盒,人工合成多肽抗原，由,36,個氨基酸組成的,Cp9,內(nèi)殼蛋白,和,19,個氨基酸組成,Cp10,混合包被固相載體,抗原組合：除有,C,100-3,C,22,C,33,外又增加了,core,和,NS3,NS,4,NS,5,特點,core NS,3,NS,5,由,Baculovirus,重組表達，沒有非特異性的,載體，試劑特異性高,重組的蛋白經(jīng)融合形成大分子抗原，利,于提高檢測靈敏度,NS,3

7、,區(qū)增加了氨基酸片斷（比例十分重要）。改進了反映的,靈敏度,NS,5,經(jīng)優(yōu)化，徐去了非特異性的區(qū)域,G-D-D,NS,3,NS,5,是血轉(zhuǎn)化最早測得的抗體，提高了診斷的準確性,NS,4,為倆個片斷的合成多肽，去掉了非特異性反應(yīng)的區(qū)域,加強了試劑的靈敏度和特異性,11,2.1.4,第四代,HCV,ELISA,試劑盒,美國新近推出一種包括,HCV,基因組,7,個功能區(qū)所有,免疫決定基的單一融合蛋白，稱為多決定基融合抗,原，采用表面活性劑處理分界病毒表面復(fù)合物，釋,放,HCV,核心抗原,core,并用,ELISA,法，靈敏度,可達,500,拷貝,ml,已接近核酸擴增檢測水平,抗原組合：以,Core,

8、和,NS,3,作為主要檢測片斷（比例,十分重要）加合成多肽,NS,4,特點：直接測,Core,抗原,不易發(fā)生變異,抗,IgM,和,IgG,檢出率可達,100,特異性達,99.8,靈敏度為,100,12,3,基因工程抗體及其功能試劑,80,年代后人們開始使用基因工程技術(shù)制備抗體,并進而將抗體分子片斷與其它蛋白（或另一種抗體,分子）融合得到多功能試劑，到目前為止，基因工,程抗體在免疫測定上的應(yīng)用尚處于一個初級階段,且主要是將抗體與其它蛋白以融合蛋白形式表達而,得到多功能試劑，如澳大利亞學(xué)者應(yīng)用基因工程技,術(shù)制備了抗人紅細胞抗體與,HIV-1gpN,41,的融合蛋,白。這種重組蛋白，即基因工程雙功能

9、試劑，在此,基礎(chǔ)上，建立了快速，靈敏和特異的自身紅細胞凝,集試驗,AGEN,13,3.1 HIV-ELISA,抗原,抗體試劑,2019,年,美國首先研制第四代試劑,對檢測,HIV,的同時檢測,P,24,核心,抗原,故稱,HIV,抗,原,抗體試劑,國內(nèi)已有引進,抗原組成,gp,160,gp,36,gp,170,和單克隆抗,p,24,抗體包被,14,3.1.2 P,24,抗原測定,采用夾心法,ELISA,即將將純化的已知抗體,包被，當(dāng)加入帶測血清后，若血清中含有,P,24,與包被抗體形成抗原抗體復(fù)合物，再加,入酶,HRP,標記,HIV,抗體。在抗原上又結(jié),合了酶標記的抗體，加底物,顯色后在酶標,儀

10、上讀結(jié)果,近來為提高檢測血清中,P,24,抗原的敏感性,將血清中免疫復(fù)合物,ICD,解離后再進行,測定。發(fā)展了,ICD) P,24,抗原測定技術(shù),15,3.1.3,抗,HIV-ELISA,試劑,目前對,HIV,的檢測原料有了較大改進，主要如下,1,可用于檢測血清或血漿中,HIV IgM,亞特異性抗體和檢,測,HIV-1,2,和多種亞型,2,標記的抗原,a,含,HIV-1B,亞型,gp,41,和,P,24,的,HIV-1,重組融合蛋白,b,可特異性檢測血清或血漿中,HIV M,群的抗體，絕大多數(shù),HIV-1.0,群和,HIV-2,群的抗體,c.gp,36,免疫調(diào)控區(qū)的,HIV-2,多肽可測定特異

11、性的,HIV-2,抗體,d.gp,41,的倆段,HIV 1.0,群多肽，可測特異性,HIV 1.0,群的抗體,和,HIV 1M,群的抗體,16,從以上抗原設(shè)計保證,HIV,的來自不同亞型,或區(qū)域,的抗原亞型抗體的檢測。減少了變異株的漏檢,HIV-1.0.2,對,759,份各類臨床樣品包括,401,份,HIV,1,感染不同階段病人樣品,204,分,HIV-2,感染不同,階段病人樣品，和,154,份與,HIV,無關(guān)的其他疾病患,者的樣品的檢測結(jié)果,特異性,99.93,靈敏度,100,對歐洲血液中心的,8842,份常規(guī)鮮血者樣品用,HIV,1.0.2,進行評價篩選，并經(jīng)確認實驗獲得的結(jié)果,17,3.

12、1.4 HIV,確認試劑,免疫印記,WB,或,RIBA,試劑,判斷標準,我國,HIV,抗體陽性：至少二條膜帶（即,gp,160,gp,120,或至少一條膜帶和,p,24,核心,帶同時,出現(xiàn),美國,HIV-1,陽性（任何兩個中有二條帶,P,24,gp,41,gp,120,gp,160,HIV-2,無陽性,WHO : HIV -1,陽性（不管有無核心帶或酶帶,但有兩條膜帶,HIV-2,陽性（不管有無核心帶或酶帶，單,有兩條膜帶即為陽性,18,4,基因工程酶及其融合蛋白,除了基因工程抗原、抗體外，與標記免疫測定有關(guān),的另一中重要的基因工程試劑就是酶及其融合蛋白,以重組酶建立免疫測定方法較為成功的是,

13、CEDIATM,均相酶免疫試驗,使用基因工程酶技術(shù)生產(chǎn)免疫測定標記酶,是得到,符合標記要求的高純度酶的一條新途徑，但如以其,他蛋白（抗原或抗體）融合的方法,不但避免了繁,瑣且低效率的酶與蛋白的化學(xué)交聯(lián)，而且無需得到,純化的酶和抗原或抗體,隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā),展，將有越來越多的酶免疫測定方法建立在基因工,程酶或其融合蛋白的基礎(chǔ)之上,19,發(fā)展趨勢如下,1,由單一病原蛋白向多決定簇融合蛋白,轉(zhuǎn)變，并盡可能包括病原體基因組功能區(qū)的,所有的能引起肌體免疫應(yīng)答的決定簇,2,表達的抗原將盡可能少含有非特異性,抗原,或共同抗原,3,為某一目的如病原體基因型確定而設(shè),計表達特定的多肽抗原片斷,總之，將圍繞

14、改善免疫測定的特異性和敏感,性來制備基因工程片斷,20,二,試劑盒的方法學(xué)設(shè)計,目前,ELISA,的測定模式，主要有雙抗體夾,心法測定抗原，如,HBsAg,HBeAg,AFP,HCG,等；間接法測定,抗體如,HCV,抗,HIV,等；雙抗體夾心法測抗,體如,HBs,競爭法測抗體，如,HBe,抗,HBc,等；競爭法測抗原，如激素等小分子。固相,捕獲法測,IgM,抗體等，這里只簡述雙抗夾心,法測抗原,目前有一步法和二步法之分,21,1,HBsAg-ELISA,法,1.1,一步法：在加入待測物的同時加入酶結(jié)合物一起溫育,一步即完成反應(yīng)過程，一步法,ELISA,的反應(yīng)曲線為鐘型曲線,見,圖,1,也就是說

15、測定隨著待測物中抗原濃度的增加而升高至一,定后，測定吸光度即隨抗原濃度的增加而開始下降直至不顯色,即所謂的“鉤狀效應(yīng),HOOK effect,也就是我們在免疫沉,淀實驗中所稱的“帶現(xiàn)象,Ab+Ag+Ab,Ab,Ag,Ab*+Ab,Ag+Ag,Ab*+Ab,Ag,Ab,a,b) (c) (d,22,其中,a,為最后測定結(jié)果的顯色源,當(dāng)待測物中,Ag,濃,度增加時，無疑會使,b,c,和,d,復(fù)合物增加，從而消,耗有限的,Ab,使,a,復(fù)合物相應(yīng)減少，顯色降低,吸,光度對抗原濃度的變化曲線成鐘型曲線，而且由于,d,復(fù)合物的形成，使得在同樣的,Ab,濃度下，一步,顯色較二步法為淺,應(yīng)”，現(xiàn)已有進展，即

16、采用包被為一種抗體，酶標,記用空間距離較遠的決定簇的抗體，同時在操作中,充分混勻反應(yīng)液，并適當(dāng)延長溫育時間，則可使,b,c,和,d,復(fù)合物減少到最低程度，而不出現(xiàn)“鉤狀效,應(yīng),23,圖,1,一步法,ELISA,抗原濃度與顯色,變化的反映曲線,24,二步法,隨著待測物中抗原濃度的逐步增加，將使固相抗體與抗原的結(jié),合逐步達到飽和,見,1,式,這樣在一定濃度,Ab,的存在下,Ab,Ag,復(fù)合物的形成將直接與,Ab,結(jié)合,見,2,式,抗原濃度的逐,步增加導(dǎo)致了顯色的逐步加深,而形成,S,形變化曲線,見下圖,2,Ab+Ag,Ab,Ag (1,Ab,Ag+Ab,Ab,Ag,Ab* (2,綜上所述，一步法,

17、ELISA,試劑盒作為適合臨床實驗室簡便快速,要求的產(chǎn)物，有著巨大市場，其雖有潛在缺陷，易導(dǎo)致高濃度,待測物的標本檢測為假陰性，但精心的實驗設(shè)計，對包被和酶,標記抗體的仔細選擇，完全可以將“鉤狀效應(yīng)”出現(xiàn)的可能性,降至最低,25,圖,2,二步法,ELISA,抗原濃度與顯色,變化的反映曲線,26,灰區(qū)概念：合并二種方法,一步法試劑其反應(yīng)平衡點為圖中反應(yīng)曲線,A,點,處在抗原抗體,反應(yīng)的上坡圖中，故受反映條件的改變而影響,A,值,二步法抗原抗體反應(yīng)已達反應(yīng)的平臺期,從圖見一步法,A,點則受反應(yīng)條件的改變而影響,A,值。因此出現(xiàn),Al,可能是假陽性,A2,可能是假陰性,因此將,A1,A2,間的區(qū)域稱

18、為灰區(qū),27,灰區(qū)的設(shè)置有二種方法,1,以試劑批內(nèi),CV,值（一般為,15,左右,設(shè)定，灰區(qū)范圍為,CO,1+CV,2,以試劑盒用臨界值血清測定,S,值來設(shè)定,公式為,CO+2S,以上一般以,S,值確定的灰區(qū)范圍比,CV,值確定,值要大。凡灰區(qū)范圍內(nèi)的結(jié)果可報告可疑或,重復(fù)檢測,28,2.HIV,檢測法,目前市場上也有一步,法和二步法兩種。,一步法存在以下三個,問題,鉤狀效應(yīng),Hook,Effect,：有漏檢傾,向,29,HIV-2,型抗體的檢測,P19,P20,兩個,HIV-2,型抗體強陽性標本的檢,測中，二步法試劑盒,OD,值至少比一步法試劑,高出,35,倍,30,3,本底,與一步發(fā)試劑盒

19、相比，因二步法試劑盒標本,孵育時間長。酶結(jié)合物反應(yīng)充分，特異性強,不僅抗,HIV-1,2,型陽性標本,OD,值比一步法,高而且本地清晰。一般二步法本地,0.02,31,三,儀器的質(zhì)量控制,隨著全自動生化分析儀的不斷更新發(fā)展，目前國內(nèi),已有多家引進先進的自動化酶免疫分析儀來替代,ELISA,法的手工操作，使試驗的特性更加全面規(guī)范,化,1,全自動酶免分析儀的特點,加液的精密度,始終如一的洗滌,環(huán)境控制,QC,特性,過程安全性,32,2,酶標儀的簡易校準和質(zhì)量控制,移液器,水浴箱,洗板機,33,酶標儀的簡易校準和質(zhì)量控制,濾光片波長精度檢查,通道差和孔間差檢測,零點漂移即儀器穩(wěn)定性觀察,精密度評價,

20、線性測定,雙波長測定評價,34,四、開展質(zhì)量控制前的準備,檢驗工作的質(zhì)量控制應(yīng)包括實驗室工作的全,過程，只有建立在完善的,質(zhì)量管理工作基,礎(chǔ)之上，才能對測定結(jié)果進行質(zhì)量控制。沒,有健全的,實驗室質(zhì)量管理、質(zhì)量體系，一,切均在非控制之中，只靠一份質(zhì)控血清，分,析這份血清的質(zhì)控結(jié)果是達不到質(zhì)量保證的,預(yù)期結(jié)果的，也不可能做好室內(nèi)質(zhì)控，作好,質(zhì)控圖,35,1,建立質(zhì)量體系,建立質(zhì)量管理，編制質(zhì)量手冊，健全質(zhì)量體,系，使實驗室的工作有條不紊，從樣品采集,運送、記錄、檢測方法的選擇、試劑、儀器,人員素質(zhì)、操作技術(shù)水平、計算、質(zhì)控方法,報告填寫、實驗環(huán)境、工作量、相互協(xié)作等,等，每一步驟都準確按質(zhì)量手冊的

21、規(guī)程辦,可預(yù)防差錯，即使偶爾發(fā)現(xiàn)失控，就能容易,地分析出產(chǎn)生變異的因素,36,2,質(zhì)控血清的制備,各實驗室可以按美國,CAP,或國家檢定新的標準建立,起定值質(zhì)控品,制備方法,1,收集血清,2,滅活,3,離心或過濾除去沉淀物,4,稀釋,5,保存,6,定期校正,37,HBsAg,標準曲線圖,1 2 5 10 ng/ml,2.0,1.0,38,3,質(zhì)控物定值的選擇,室內(nèi)質(zhì)控點的選擇，以需要設(shè)置質(zhì)控的點,設(shè)置質(zhì)控物進行質(zhì)控為原則,病毒性肝炎酶免疫檢驗中，有高值、中值,低值的質(zhì)控物，我們認為其中以低值的質(zhì)控,物為最重要,設(shè)置臨界于,cutoff,值,CO,值,的低值弱陽性質(zhì)控物是室內(nèi)質(zhì)控的關(guān)鍵,重,點抓

22、住低值弱陽性,臨界值血清的室內(nèi)質(zhì)控檢,測，是室內(nèi)質(zhì)控精密度觀測的最敏感的窗口,也是揭示試驗成功與否的重要標志,39,臨界值血清是室內(nèi)質(zhì)控血清，不是判斷陰,陽性的標準，判斷樣品不是判斷陰、陽性結(jié),果的標準是以試劑盒說明書提供的,cutoff,值,為標準。任何人不能隨意更改試劑盒說明書,中提供的判斷陰、陽性結(jié)果的公式,40,4,cut off (CO,值又稱臨界值,或陽性與陰性界限值,CO,值計算實例：（以夾心法為例,1,依據(jù)試劑盒說明書規(guī)定,S/N 2 .1,為陽性,S,樣品,N,陰性對照,因為,S N,2.1,判斷為陽性,所以,S = N,2.1,為陰陽性結(jié)果分界點，即,CO,值,CO (cu

23、t off,值,N,2.1,當(dāng),SCO,值時，判為陽性,SCO,值時，判為陰性,2,樣品結(jié)果表示法,S/CO,值,S/CO,樣品,A,值,CO,值,當(dāng),S/CO 1,時，判為陽性,S/CO 1,時判為陰,性,41,CO,值計算實例,ELISA,抗,HBc,競爭抑制試驗,依據(jù)試劑盒說明書規(guī)定,1,S/N 2 .1,為陽性,S,樣本,N,陰性對照,所以,S,N,2.1,判斷為陽性,當(dāng),S = N,2.1,為陰陽性結(jié)果分界點，即,CO,值,CO (cut off,值,N,2.1,當(dāng),S,CO,值時，判為陽性,S CO,值時，判為陰性,2,樣品結(jié)果新表示法,S/CO,值,當(dāng),S/CO,1,時，判為陽性

24、,S/CO 1,時，判為陰性,每天檢驗常規(guī)樣本時帶入臨界值血清,進行每日（日間），每塊板（板間）的監(jiān)測,觀察其靈敏度，這對盒試劑的質(zhì)量檢驗是十分,重要的,42,每塊版放置臨界,CO,值血清做試劑盒質(zhì)檢是,十分簡便可行的事,5,試劑盒的質(zhì)檢,43,五、室內(nèi)質(zhì)控步驟,根據(jù)英國,Whitehead,的意見，室內(nèi)質(zhì)控分,為以下幾個階段,1,最佳條件下的變異,optimal condition variation,OCV,2,常規(guī)條件下已知值質(zhì)控血清的變異,routine condition variation-known,RCVK,3,常規(guī)條件下未知值質(zhì)控血清的變異,routine condition

25、 variation-unknown,RCVu,4,病人結(jié)果的資料統(tǒng)計應(yīng)用,statistics use of patients results,44,1,最佳條件下的質(zhì)控血清變異測定,在本實驗室最佳條件下（包括操作者、試劑,儀器等）檢測質(zhì)控血清,2030,次，將測得,結(jié)果計算，求出該組數(shù)據(jù)的均值,x,和標,準差,s,表示該實驗室的最佳條件下質(zhì)控血,清變異,舉例說明,HBsAg-ELISA,法檢測時,OCV,的測,定,45,使用的質(zhì)控血清,HBsAg,臨界值血清。在實驗,室中選擇素質(zhì)最好、操作最熟練的技術(shù)員進,行認真地專門測定，選用最佳的試劑盒，檢,測之前應(yīng)將恒溫箱、加樣器等認真校正、調(diào),試，

26、使用新的加樣吸頭等，即在最佳、最理,想地條件下進行檢測，測定陰性對照品和陽,性對照品,質(zhì)控血清做雙測定,得出,2,個吸,光值,A,值）的均值,獲得,X,1,X,20,通過,計算,S/CO,值計算，獲,20,個,S/CO,值。這組,數(shù)據(jù)舉例見表,2.1,46,次數(shù),質(zhì)控血清,1,陰性對照品,Cut-off,值,S/CO,值,A,值,A,值,陰性,A,值,X2.1,1,0.180,0.050,0.105,1.71,2,0.190,0.050,0.105,181,3,0.180,0.050,0.105,1.71,4,0.185,0.050,0.105,1.76,5,0.195,0.050,0.105

27、,1.86,6,0.205,0.050,0.105,1.95,7,0.215,0.050,0.105,2.05,8,0.170,0.050,0.105,1.62,9,0.473,0.050,0.210,2.25,10,0.140,0.050,0.105,1.33,11,0.215,0.050,0.105,2.05,12,0.205,0.050,0.105,1.95,13,0.180,0.050,0.105,1.71,14,0.170,0.050,0.105,1.62,15,0.116,0.050,0.105,1.10,16,0.185,0.050,0.102,1.76,17,0.205,0.0

28、50,0.105,1.958,18,0.170,0.050,0.105,1.62,19,0.190,0.050,0.105,1.81,20,0.200,0.050,0.105,1.90,47,通過表,2.1,計算,20,各質(zhì)控血清的,s/co,值的,均值,X,，標準差,s,和變異系數(shù),cv,X=1.78 s=0.25 cv=14.3,從而獲得該實驗室,OCV,測定數(shù)據(jù),48,2,常規(guī)條件下已知值質(zhì)控血清變異,做常規(guī)檢驗的技術(shù)人員，在常規(guī)檢驗的條件,下，將質(zhì)控血清放在常規(guī)檢測樣本中，進行,20,次檢驗，結(jié)果計算同,OCV,法。仍以,HBsAg,為例，檢測,2ng/ml,的質(zhì)控血清，結(jié),果和計算見

29、表,2.2,49,次數(shù),質(zhì)控血清,1,陰性對照品,Cut-off,值,S/CO,值,A,值,A,值,陰性,A,值,X2.1,1,0.250,0.050,0.105,2.38,2,0.180,0.050,0.105,1.71,3,0.290,0.050,0.105,2.76,4,0.310,0.050,0.105,2.95,5,0.160,0.070,0.147,1.09,6,0.150,0.080,0.168,0.89,7,0.270,0.050,0.105,2.57,8,0.400,0.100,0.210,1.90,9,0.270,0.120,0.252,1.07,10,0.100,0.09

30、0,0.189,0.53,11,0.353,0.050,0.105,3.36,12,0.160,0.070,0.147,1.09,13,0.110,0.040,0.084,1.31,14,0.120,0.030,0.063,1.90,15,0.270,0.120,0.252,1.07,16,0.350,0.110,0.231,1.52,17,0.220,0.090,0.189,1.16,18,0.370,0.100,0.210,0.33,19,0.500,0.150,0.315,1.59,20,0.410,0.090,0.189,2.17,50,通過表,2.2,計算,20,各質(zhì)控血清的,s/c

31、o,值的,均值,X,，標準差,s,和變異系數(shù),cv,X=1.67 s=0.82 cv=49.1,這組數(shù)據(jù)中的,s,值變異太大,s,值為,0.82,已經(jīng),3,倍于,ocv,的,s 0.25,不予接受,一般,RCV,的,S,值在,OCV,的,S,值的兩倍范圍內(nèi)可以接受,若太大應(yīng)該查找原因，使其向,ocv,的,s,值靠近,在改進實驗條件后（例如校正加樣器，糾正,洗板操作，調(diào)整溫育溫度等），重新進行,RCVK,的測定結(jié)果，其結(jié)果見標,2.3,51,次數(shù),質(zhì)控血清,1,陰性對照品,Cut-off,值,S/CO,值,A,值,A,值,陰性,A,值,X2.1,1,0.180,0.050,0.105,1.71,

32、2,1.190,0.050,0.105,1.81,3,0.200,0.050,0.105,1.90,4,0.228,0.060,0.126,1.81,5,0.137,0.060,0.126,1.09,6,0.221,0.050,0.105,2.10,7,0.150,0.050,0.105,1.43,8,0.170,0.050,0.105,1.62,9,0.180,0.040,0.084,2.14,10,0.150,0.050,0.105,1.43,11,0.200,0.050,0.105,1.90,12,0.142,0.050,0.105,1.35,13,0.210,0.050,0.105,2

33、.00,14,0.221,0.050,0.105,1.52,15,0.180,0.050,0.105,1.71,16,0.190,0.050,0.105,1.81,17,0.160,0.050,0.105,1.52,18,0.221,0.050,0.105,2.10,19,0.210,0.050,0.105,2.00,20,0.150,0.050,0.105,4.13,52,通過表,2.3,計算,20,各質(zhì)控血清的,s/co,值的,均值,X,，標準差,s,和變異系數(shù),cv,X=1.72 s=0.29 cv=16.9,這組數(shù)據(jù)中的,s,值變異太大,s,值為,0.29,有明,顯改善，已經(jīng)接近,oc

34、v,的,s 0.25,符合要求,如果,RCVK,的值比,OCV,的,S,值更小，說明,OCV,不是最佳條件下測定的，應(yīng)重新測定,OCV,53,3,常規(guī)條件下未知值質(zhì)控血清變異的測定,有時為了避免主觀性，再做,RCVU,測定。測,定步驟同,RCVK,但測定的操作者不知質(zhì)控,血清的定值；或在操作者不知道哪一份是質(zhì),控血清的條件下進行常規(guī)檢驗，以排除操作,者的主觀性。在此不再舉例說明,54,4,質(zhì)控圖,55,次數(shù),日（月、日,質(zhì)控血清,1,陰性對照品,Cut-off,值,S/CO,值,A,值,A,值,陰性,A,值,X2.1,21,7.4,0.160,0.050,0.105,1.52,22,7.7,0

35、.1900,0.050,0.105,1.81,23,7.8,0.200,0.050,0.105,1.90,24,7.11,0.228,0.060,0.126,1081,25,7.12,0.139,0.050,0.126,1.10,26,7.15,0.221,0.050,0.105,2.10,27,7.16,0.150,0.050,0.105,1.43,28,7.18,0.170,0.050,0.105,1.62,29,7.19,0.225,0.050,0.105,2.14,56,室內(nèi)質(zhì)控圖示例,57,5,病人資料的統(tǒng)計,1,正常人群的,S/CO,值分布統(tǒng)計,2,陽性陽本的,S/CO,值分布統(tǒng)計

36、,3,以陰性和陽性陽本的,X,和,S,分別做質(zhì)控,圖,58,6,統(tǒng)計學(xué)計算方法,即刻法”質(zhì)控,Gribbsit,法,ELISA,有其特殊性，最合適的質(zhì)控方法尚待研究建,立有些實驗室不是每天進行,ELISA,項目的檢驗,而,ELISA,試劑盒效期短，同一批號試劑盒連續(xù)常規(guī),測次，難度較大，采用即刻法質(zhì)控統(tǒng)計方法,只需連續(xù)測次，即可對第次檢驗結(jié)果進行質(zhì),控,具體計算方法如下,先將測定值從小到大排列,n,為最小值,n,為最大），總計算出,和值,59,計算上限值和下限值,最大值,X,I,上限,最小值,I,下限,將上限下限與值表中的數(shù)字,比較,60,表,值表,n n3s n2s n n3s n2s,3

37、1.15 1.15 12 2.55 2.29,4 1.49 1.46 13 2.61 2.33,5 1.75 1.67 14 2.66 2.37,6 1.94 1.82 15 2.71 2.41,7 2.10 1.94 16 2.75 2.44,8 2.22 2.03 17 2.79 2.47,9 2.32 2.11 18 2.82 2.50,10 2.41 2.18 19 2.85 2.53,11 2.48 2.23 20 2.88 2.56,上下限值,n2s,在控,n2s,上下限有一值,n3s,告警,上下限有一值,n3s,失控,表中數(shù)值適用于吸光度,ELISA,法的值濃度值（如,g,類）滴

38、定的對,數(shù)值或細胞計數(shù)值等,61,對告警失控的測定值均予剔除，并,在以后的檢測計算時亦不再用,查表時,n,次數(shù)一定要與相對應(yīng),的,n,界值比較，絕不能查錯,從以上實例可看出，通過即刻法統(tǒng)計計,算的和值，與,RCV,法測得的次獲得,是十分接近的即刻法質(zhì)控的統(tǒng)計方,法，適于免疫學(xué)測定的質(zhì)控,如即刻法已達到,20,次，就可以做,Levey,Jennings,質(zhì)控圖,62,示例,20,次質(zhì)控血清,S/CO,值,次數(shù),s/co,值,次數(shù),s/co,值,1,1.71,12,1.35,2,1.81,13,2.00,3,1.90,14,1.52,4,1.81,15,1.71,5,1.09,16,1.81,6,

39、2.10,17,1.52,7,1.43,18,2.10,8,1.62,19,2.00,9,2.14,20,1.43,10,1.43,21,1.52,11,1.90,63,在第三次測定后，按“即刻法”計算,n=3,三次,s/co,值從大到小排列為,1.71 1.81 1.90,求出,x=1.81,s=0.10,計算,SI,下限,1.81-1.71=1.0,0.1,SI,上限,1.90-1.81=0.9,0.1,查,SI,值表,n=3,時,n,2,1.15,n,3,1.15,SI,下限,SI,上限,均小于,n,2s,n,3s,因此該三次檢測數(shù)據(jù)在控制范圍,內(nèi),64,在第四次測定后，按上法計算,n=

40、4,測得,S /CO,值為,1.81,1.71 1.81 1.81 1.90,求出,x=1.81,s=0.08,計算,SI,下限,1.81-1.71=1.25,0.08,SI,上限,1.90-1.81=1.13,0.08,查,SI,值表,n=4,時,n,2,1.46,n,3,1.49,SI,下限,SI,上限,均小于,n,2s,n,3s,因此該三次檢測數(shù)據(jù)在控制范圍,內(nèi),65,在第五次測定后，按上法計算,n=5,測得,S /CO,值為,1.09,1.09 1.71 1.81 1.90,求出,x=1.66,s=0.33,計算,SI,下限,1.81-1.71=1.73,0.33,SI,上限,1.90

41、-1.81=0.73,0.33,查,SI,值表,n=5,時,n,2,1.67,n,3,1.75,SI,下限,SI,上限,在,n,2s,n,3s,之間,因此本次檢測數(shù)據(jù)處于“警告,棄去,1.09,值,66,在第六次測定后，按上,5,計算,n=5,測得,S /CO,值為,2.10,1.71 1.81 1.81 1.90 2.10,求出,x=1.87,s=0.15,計算,SI,下限,1.81-1.71=1.07,0.15,SI,上限,1.90-1.81=1.53,0.15,查,SI,值表,n,2,1.67,n,3,1.75,SI,下限,SI,上限,均小,于,n,2s,n,3s,因此該三次檢測數(shù)據(jù)在控

42、制范圍內(nèi)，繼續(xù),檢測并計算,67,當(dāng)測定達到,21,次時，因舍去一個數(shù)據(jù)（第,5,個,n=20,排序如下,1.35 1.43 1.43 1.43 1.52 1.52 1.62,1.71 1.71 1.81 1.81 1.81 1.90 1.90,1.90 2.00 2.00 2.10 2.10 2.14,X=1.76,s=0.25,SI,下限,1.76-1.35=1.64,0.15,SI,上限,2.14-1.76=1.52,0.15,68,7.1,孔間差變異的控制,ELISA,檢驗孔與孔間的差異的調(diào)查，可以在同一塊,板上獲取同一份質(zhì)控血清至少十孔并行試驗的,S/CO,值的均值和標準差,質(zhì)控血清

43、,HBsAg 1 ng/ml,作孔間變異值檢測,結(jié)果如下,0.125 0.103 0.103 0.098 0.092 0.099,0.098 0.106 0.098 0.092,1.101 S=0.01 CV=9.3,通過孔間的變異調(diào)查，可以了解不同試劑，不同批,號，不同操作者的變異，以便于選擇，改進,了解孔間變異，就可以了解每個樣品測定值的可能,變動范圍，對于制定處于值上下的樣品的結(jié)果,是十分有用的,69,2.2,批內(nèi)變異（板間差異）與批間變異的,控制,實驗室一天需用數(shù)塊微孔板，這里就存在同,一天檢測數(shù)塊板之間的變異（批內(nèi)變異）和,不同天檢測之間的變異（批間,變異）的問,題。如表,70,某實

44、驗室內(nèi)質(zhì)控數(shù)據(jù)表,日期序號,1,2,3,4,5,6,7,8,s/co,值,2.24,3.39,2.83,3.25,2.07,3.16,2.50,2.70,3.37,3.06,1.32,1.52,8.00,3.95,3.04,2.51,3.00,3.46,3.79,3.97,1.39,2.01,1.71,3.02,2.13,2.20,2.38,4.26,8.62,2.12,2.97,2.23,2.13,4.01,2.42,2.74,9.22,3.95,1.58,1.98,1.94,2.71,2.91,4.06,3.08,9.83,2.58,3.45,日期序號,9,10,11,12,13,14,1

45、5,16,17,s/co,值,4.65,7.30,2.38,1.90,2.63,12.86,4.85,10.50,8.80,6.26,4.96,4.13,3.20,1.72,2.63,4.40,4.88,6.90,6.20,8.91,7.68,2.65,3.38,3.19,5.20,4.51,6.10,2.83,6.40,3.02,3.57,3.61,8.91,9.73,4.95,8.59,7.80,8.62,2.88,6.68,2.18,8.53,2.66,6.78,2.64,3.32,3.02,6.88,日期序號,18,19,20,21,22,23,s/co,值,3.37,9.10,5.5

46、0,5.81,4.27,5.95,2.60,2.20,5.20,8.61,4.18,6.20,4.47,2.33,4.45,2.77,5.00,2.38,3.69,9.67,3.70,2.80,4.52,5.19,2.81,2.53,1.86,4.80,4.35,3.27,5.27,2.42,4.56,5.90,9.40,3.40,2.87,2.29,71,取表,2.7,中連續(xù),20,天的每天最大值,x,大,和,最小值,x,小,列表，并計算其值差,x,差,求,20,天值差的均值和標準差，此為批內(nèi)變異,以,x,內(nèi),s,內(nèi),表示）；取每天數(shù)值的均值,x,求,20,天均值的均值和標準差，此為批間變異

47、,以,x,間,s,間,表示，見表,2.8,72,表,2.8,某實驗室室內(nèi)質(zhì)控批內(nèi)、批間,數(shù)值表,S/CO,值,第,n,天,最小值,最大值,值差,均值,第,n,天,最小值,最大值,值差,均值,X,小,X,大,X,差,X,X,小,X,大,X,差,X,1,1.32,2.24,0.92,1.65,11,2.38,3.57,1.19,2.95,2,1.52,8.00,6.48,3.02,12,1.72,3.81,2.09,2.77,3,2.23,3.95,1.72,3.11,13,2.63,6.91,4.28,4.34,4,1.98,3.16,1.18,2.43,14,4.40,12.86,8.46,7

48、.61,5,1.94,9.83,7.89,3.91,15,2.18,4.95,2.77,4.00,6,2.42,3.46,1.04,2.73,16,6.10,10.50,4.40,8.02,7,2.58,4.26,1.68,3.28,17,2.89,8.80,5.97,6.33,8,3.06,9.22,6.16,5.40,18,3.27,9.67,6.30,6.17,9,4.65,8.91,4.26,6.71,19,3.70,6.20,2.50,5.13,10,3.02,7.68,4.66,5.53,20,2.80,9.40,6.60,5.36,73,通過表,2.8,計算值差項得出,X,內(nèi),4

49、.11,S,內(nèi),2.52,計算均值項得出,X,間,4.52,S,間,1.83,表,2.8,X,內(nèi),4.11,S,內(nèi),2.52,為批內(nèi),變異,X,間,4.52,S,間,1.83,為批間,變異,從該數(shù)據(jù)反映該室批內(nèi)變異,S,內(nèi),2.52,大,于批間變異,S,間,1.83,一般認為批間變異,批內(nèi)，而事實往往不一,定。因必須重視精密度檢測水平,74,利用表,2.8,中的,X,內(nèi),和,S,內(nèi),做批內(nèi)變異質(zhì)控,框架圖,將,X,大,和,X,小,描紀上，并連成線段，觀察,批內(nèi)變異十分直觀,75,利用表,2.8,中,X,間,和,S,間,做室內(nèi)批間變異控框架圖,并將第,21,次以后的,x,值依次描記上。在這里，僅

50、利,用表,2.8,中的均值數(shù)據(jù),x,進行范例描記。見圖,2.5,從圖,2.4,中可以看到，線段長短不等。線段越長,反映精密度越差；線段長的越多，反映這一階段精,密度總體情況不好。線段上上下下不平衡地分布在,X,軸線的上下兩側(cè)，反映出批內(nèi)變異的偏離也很差,從圖,2.5,中可以看到，前,7,次數(shù)值偏于,X,軸的下方及,第,21,次到,29,次，數(shù)值呈明顯上升趨勢，反映出這,76,7.3,個體操作變異的控制,當(dāng)每天檢測質(zhì)控數(shù)據(jù)按操作者分類計算時,獲取每個操作者的日間變異，在日間變異質(zhì),控圖中，描出本室質(zhì)控曲線變化的同時，用,不同顏色，描記出每個操作者質(zhì)控數(shù)值。以,了解每個操作者質(zhì)控結(jié)果的變異趨勢，用

51、以,加強對每個操作者的質(zhì)控。具體做法，在此,77,圖,2.5,某實驗室批間變異質(zhì)控圖,78,8,室內(nèi)質(zhì)控圖的建立及判斷,8.1Levey-Jennings,美國,W.A.Shewhart,于,1924,年首先提出質(zhì)量控制圖的統(tǒng)計質(zhì),控方法，自從,Shewhart,質(zhì)控圖在工業(yè)企業(yè)中運用以來，用數(shù),理統(tǒng)計的方法監(jiān)測產(chǎn)品質(zhì)量的不合格成為可行。使產(chǎn)品的不合,1949,年美國,CAP(The College of American Pathologists,首先開展室間質(zhì)評,EQA,從,EQA,調(diào)查中發(fā)現(xiàn)許多問題，引起,1950,年美國學(xué)者,Levey,和,Jenning,發(fā)表第一篇關(guān)于醫(yī)學(xué)檢驗室,內(nèi)

52、質(zhì)控方法學(xué)研究的論文，將,Shewhart,質(zhì)控圖介紹給臨床化,79,8.2 Levey-Jennings,質(zhì)控圖做法,以,20,次質(zhì)控物的檢測結(jié)果，計算平均值,X,和標準差,s,定出控制限,一般以,x,2s,為警告限，以,x,3s,為失控限,做質(zhì)控框架圖。每次,或每天,隨病人樣本測,定的質(zhì)控物值，標記在質(zhì)控圖上。分析質(zhì)控,圖中每天檢測質(zhì)控的結(jié)果分布，判斷當(dāng)天檢,測的樣本是否在控制限之列。若當(dāng)天質(zhì)控物,檢測結(jié)果失控，則當(dāng)天病人樣本的測定結(jié)果,80,當(dāng)以,3s,為失控限時，每,100,次約有一次判為,失控,99,的合格率,顯然，這個標準太低,使許多失控狀態(tài)判為合格。當(dāng)以,2s,為失控限,時，每,

53、20,次約有一次失控,95,的合格率,這個標準可以接受。當(dāng)我們以,1.5s,為失控限,時，就將,2/10,的結(jié)果設(shè)定為失控,即約,80,的合格率,顯然提高了質(zhì)控的難度，使操,作者需更用心操作，否則易處失控狀態(tài)。我,們建議采用,1.5s,為失控限,81,各實驗室選擇失控限時，應(yīng)根據(jù)本室條件給,予規(guī)定。失控限定得太寬,例如定到,3s,幾,乎不必擔(dān)心有失控可能，這樣常將失控結(jié)果,誤判為合格，使質(zhì)控失去意義；相反，失控,限定得太嚴,例如定,1s,為失控限,使太多的,結(jié)果，甚至合格的結(jié)果，判為失控，這也使,質(zhì)控失去意義。依據(jù)本室條件，設(shè)定失控限,目前，衛(wèi)生部臨檢中心提供某些項目室內(nèi)質(zhì),控的全國平均變異系數(shù),cv,各室可以計算,出本室質(zhì)控,s,的參考值，直接引入質(zhì)控圖中,82,8.3 Westgrad,多規(guī)則控制方法,以下簡稱多規(guī)則,1,前述,x,3S,和,x,2S,的控制方法二者在誤差出靈敏,度和對失控誤差識別特異性上有著明顯的差,Westgard,將它們巧妙地結(jié)合起來，并且引進其它,控制規(guī)則，成了多規(guī)則控制方法。目的是提高控制,效率，既對誤差檢出具較好的靈敏度，又對失控誤,1,在多規(guī)則控制方法中,Westgard,建議使用,2,個,控制品，濃度一高一低，形成一個范圍的控制（沒,有條件也可只用,1,個控制品，但有很多局限性,2