α-淀粉酶的發(fā)酵、提取和參考PPT

1、1,淀粉酶的發(fā)酵、提取和活性測定,2,背景知識,淀粉酶是水解淀粉和糖原酶類的總稱，廣泛存在于動植物和微生物中。-淀粉酶作用于淀粉時，可從分子內(nèi)部切開-1，4鍵而生成糊精和還原糖。產(chǎn)物的末端葡萄糖殘基C1碳原子為-構(gòu)型，故稱-淀粉酶。如枯草桿菌BF7658 -淀粉酶，廣泛應(yīng)用于食品、釀造、制藥、紡織以至石油開采等許多方面,3,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?通過以-淀粉酶的發(fā)酵生產(chǎn)為實(shí)例，學(xué)習(xí)和掌握酶的液體發(fā)酵和鹽析沉淀法提取純化的基本原理和過程，掌握-淀粉酶分析方法、發(fā)酵和提取的評價標(biāo)準(zhǔn),4,二、實(shí)驗(yàn)原理 1、工業(yè)生產(chǎn)中酶的提取多數(shù)采用鹽析沉淀法，即：通過加入不同的金屬鹽破壞酶的水化層同時中和酶的表面電荷，而使

2、酶快速的形成沉淀，得到分離純化。本實(shí)驗(yàn)通過向枯草桿菌發(fā)酵液中加入適量的硫酸銨，對發(fā)酵液中的胞外-淀粉酶進(jìn)行純化提取,5,2. 在堿性溶液(NaOH)中，雙縮脲(H2NOCNHCONH2)能與Cu2+作用，形成紫色或紫紅色的絡(luò)合物，這個反應(yīng)叫做雙縮脲反應(yīng)。由于蛋白質(zhì)分子中含有很多與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似的肽鍵（CONH），因此，蛋白質(zhì)可與雙縮脲試劑發(fā)生顏色反應(yīng)。 此絡(luò)合物在540nm吸收值在一定范圍內(nèi)與蛋白質(zhì)的質(zhì)量成正比,6,3. 淀粉在碘液中會呈現(xiàn)紫色。-淀粉酶作用于淀粉時，可從分子內(nèi)部切開-1，4鍵而生成糊精和還原糖。而糊精和還原糖在碘液中不顯色，故可通過預(yù)先盛有淀粉和比色稀碘液的試管中的顏色變化（

3、由紫色變棕色）來辨別反應(yīng)終點(diǎn),7,三、實(shí)驗(yàn)步驟 1. 硫酸銨沉淀法從發(fā)酵液中分離-淀粉酶。 先將固體硫酸銨研成細(xì)粉末，然后按37%（重量/體積比）的比例加入到經(jīng)離心的發(fā)酵液中，混合均勻， 靜置30min。 具體操作:5ml發(fā)酵液,加1.87克硫酸銨細(xì)粉末,混勻, 靜置30min. 兩組配平,4000r.m.p離心10分鐘, 離心去除上清液保留沉淀。測活前加入10ml去離子水溶解。(即稀釋一倍) 注意:(剩下的溶液留下來用于下一次測蛋白含量,8,2.雙縮脲法繪制小牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線 取7支試管，編號，按下表加入試劑： 震蕩15分鐘，室溫靜置30分鐘后，540nm比色，以蛋白質(zhì)含量（mg/ml）

4、為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,9,2. 取發(fā)酵液5ml +5ml去離子水(即稀釋一倍) 3. 分別測定發(fā)酵液和提取液中的-淀粉酶的酶活并計算它們各自的酶比活力 -淀粉酶的酶活測定 （1）吸取1ml標(biāo)準(zhǔn)糊精溶液，置于盛有3ml標(biāo)準(zhǔn)稀碘液的試管中 （2） 在試管中加入2%可溶性淀粉20ml,加緩沖液5ml,在60度水浴中平衡4-5分鐘,加入0.5ml稀釋酶液,立即記時,充分混勻,1分鐘后取出1ml反應(yīng)液于預(yù)先盛有3ml比色稀碘液的試管內(nèi)(也需放在水浴中),當(dāng)顏色反應(yīng)由紫色逐漸變成棕色,與標(biāo)準(zhǔn)比色管顏色相同時,記錄時間為反應(yīng)時間(發(fā)酵液和提取液每組各做2個重復(fù),10,計算: 酶活性單位:以1克酶粉或1ml酶液于60度,pH為6.0的條件下,在1小時內(nèi)液化可溶性淀粉的克數(shù)表示 淀粉酶活力單位=(60/t *20*2%*f)/0.5=48*f/t 試中f表示酶的稀釋倍數(shù),t為反應(yīng)時間 活性回收率=（提取液酶活提取液體積）/（發(fā)酵濾過液酶活用于鹽析沉淀的發(fā)酵濾過液體積,11,四、 思考題 1