實驗報告2熒光分光光度法測定維生素B2的含量

1、. 實驗項目：熒光分光光度法測定維生素B2的含量【實驗題目】熒光分光光度法測定維生素B2的含量【實驗目的】1、掌握標準曲線法定量分析維生素B2的基本原理。2、了解熒光分光光度計的基本原理、結(jié)構(gòu)及性能，掌握其基本操作?！緦嶒炘怼烤S生素B2(又叫核黃素，VB2)是橘黃色無臭的針狀結(jié)晶。其結(jié)構(gòu)式為： 由于分子中有三個芳香環(huán)，具有平面剛性結(jié)構(gòu)，因此它能夠發(fā)射熒光。維生素B2易溶于水而不溶于乙醚等有機溶劑，在中性或酸性溶液中穩(wěn)定，光照易分解，對熱穩(wěn)定。 維生素B2溶液在430440nm藍光的照射下，發(fā)出綠色熒光，熒光峰在535nm附近。維生素B2在pH67的溶液中熒光強度最大，而且其熒光強度與維生素B

2、2溶液濃度呈線性關(guān)系，因此可以用熒光光譜法測維生素B2的含量。維生素B2在堿性溶液中經(jīng)光線照射會發(fā)生分解而轉(zhuǎn)化為另一物質(zhì)光黃素，光黃素也是一個能發(fā)熒光的物質(zhì)，其熒光比維生素B2的熒光強得多，故測維生素B2的熒光時溶液要控制在酸性范圍內(nèi)，且在避光條件下進行。 在稀溶液中，熒光強度F與物質(zhì)的濃度c有以下關(guān)系：F2.303I0bc當實驗條件一定時，熒光強度與熒光物質(zhì)的濃度呈線性關(guān)系：F=Kc這是熒光光語法定量分析的依據(jù)?！局饕獌x器與試劑】主要儀器：F-2500 HiTachi熒光分光光度計；1cm石英皿；50mL容量瓶；5mL移液管；燒杯；膠頭滴管試劑：維生素B2標準溶液：未知液4【實驗內(nèi)容及步驟】

3、1、系列標準溶液的制備取維生素B2標準溶液(10.0g/mL)1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL分別置于50mL的容量瓶中，各加入去離子水稀釋至刻度，搖勻。標記為的一系列維生素B2標準溶液。待測。2、待測液制備 取5.00mL未知液4置于50mL容量瓶中，加入去離子水稀釋至刻度，搖勻。待測。3、激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜的繪制設置em540nm為發(fā)射波長，在250500nm范圍內(nèi)掃描標準溶液，記錄熒光發(fā)射強度和激發(fā)波長的關(guān)系曲線，便得到激發(fā)光譜。從激發(fā)光譜圖上找出其最大激發(fā)波長ex。在此激發(fā)波長下，在400600nm范圍內(nèi)掃描，記錄發(fā)射強度與發(fā)射波長間的函數(shù)關(guān)系，

4、便得到熒光發(fā)射光譜。從熒光發(fā)射光譜上找出其最大熒光發(fā)射波長em。4、標準溶液及樣品的熒光測定 將激發(fā)波長固定在最大激發(fā)波長ex，熒光發(fā)射波長固定在最大熒光發(fā)射波長處em。掃描蒸餾水和上述5個標準液的熒光發(fā)射強度。數(shù)據(jù)記錄于表1中。以溶液的熒光發(fā)射強度為縱坐標，標準溶液濃度為橫坐標，制作標準曲線。 在同樣條件下測定未知溶液的熒光強度，并由標準曲線確定未知試樣中維生素B2的濃度，計算待測樣品溶液中的維生素B2的含量?！緮?shù)據(jù)記錄與結(jié)果分析】、維生素B2激發(fā)光譜圖： 最大激發(fā)波長ex=373nm、維生素B2熒光發(fā)射光譜圖： 最大熒光發(fā)射波長處em=524nm表1：標準溶液及待測溶液的濃度和熒光強度數(shù)據(jù)

5、記錄： 維生素B2溶液濃度/（g/mL）0.0000.2000.4000.6000.8001.000相對熒光強度0.23424.6548.0070.5091.86112.9、系列標準溶液濃度與熒光發(fā)射強度的標準曲線圖： 由計算機處理得標準曲線方程為 y=112.49x-1.7769相關(guān)系數(shù)r= 則待測溶液的濃度c =0.907g/mL【問題討論】1、試解釋熒光光度法較吸收光度法靈敏度高的原因？答：原因是由于現(xiàn)代電子技術(shù)具有檢測十分微弱光信號的能力，并且熒光強度與激發(fā)光強度成正比，提高激發(fā)光強度也可以增大熒光強度，使測定的靈敏度提高；而吸收光度法測定的是吸光度，不管是增大入射光強度，還是提高檢測器的靈敏度，都會使透射光信號與入射光信號以同樣的比例增大，吸光度值不會改變，因此靈敏度不能提高。2、維生素B2在pH=67時熒光最強，本實驗為何