實(shí)驗(yàn)室常用菌株及特性

1、一、 實(shí)驗(yàn)室常見菌株簡(jiǎn)介Xl1-Blue菌株基因型：endA1 gyrA96(nalR) thi-1 recA1 relA1 lac glnV44 FTn10 proAB+ lacIq (lacZ)M15 hsdR17(rK- mK+)。特點(diǎn)：具有卡那抗性、四環(huán)素抗性和氯霉素抗性。用途：分子克隆和質(zhì)粒提取。BL21(DE3)菌株基因型：F ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) (DE3 lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5)。特點(diǎn)：該菌株用于以T7 RNA聚合酶為表達(dá)系統(tǒng)的高效外源基因的蛋白表達(dá)宿主。T7噬菌體RNA聚合酶基因的表達(dá)

2、受控于噬菌體DE3區(qū)的lacUV5啟動(dòng)子，該區(qū)整合于BL21的染色體上。該菌適合于非毒性蛋白的表達(dá)。用途：蛋白質(zhì)表達(dá)。BL21(DE3)ply菌株基因型：F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) (DE3) pLysS(cmR)。特點(diǎn)：該菌株帶有pLysS，具有氯霉素抗性。此質(zhì)粒還有表達(dá)T7溶菌酶的基因，T7溶菌酶能夠降低目的基因的背景表達(dá)水平，但不干擾IPTG誘導(dǎo)的表達(dá)。 適合于毒性蛋白和非毒性蛋白的表達(dá)。用途：蛋白質(zhì)表達(dá)DH5菌株基因型：F- endA1 glnV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR nupG 80dlacZM15 (

3、lacZYA-argF)U169, hsdR17(rK-, 特點(diǎn)：一種常用于質(zhì)粒克隆的菌株。 其80dlacZM15基因的表達(dá)產(chǎn)物與pUC載體編碼的-半乳糖苷酶氨基端實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)，可用于藍(lán)白斑篩選。recA1和 endA1的突變有利于克隆DNA的穩(wěn)定和高純度質(zhì)粒DNA的提取。用途：分子克隆、質(zhì)粒提取和蛋白質(zhì)表達(dá)。JM109菌株基因型：endA1 glnV44 thi-1 relA1 gyrA96 recA1 mcrB+ (lac-proAB) e14- F traD36 proAB+ lacIq lacZM15hsdR17(rK-mK+)。特點(diǎn)：部分抗性缺陷，適合重復(fù)基因表達(dá), 可用于M13克隆序

4、列測(cè)定和藍(lán)白斑篩選。用途：分子克隆、質(zhì)粒提取和蛋白質(zhì)表達(dá)。DH10B菌株基因型：F- mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC) 80dlacZM15 lacX74 endA1 recA1 deoR (ara,leu)7697 araD139 galU galK nupG rpsL -The most widely used E. coli strain for BAC cloning is DH10B 。host for pUC and other -complementation vectors; pBR322useful for generating genomic librarie

5、s containing methylated cytosine or adenine residues，useful for plasmid rescue procedures。ELECTROMAX DH10B T1 CELLS說明：DH10B細(xì)胞是高轉(zhuǎn)化效率的E. coli，可以完美應(yīng)用于大多數(shù)實(shí)驗(yàn)應(yīng)用。DH10B基因型具有以下特點(diǎn)： lacZM15 用于重組克隆的藍(lán)/白斑篩選消除了mcrA、mcrBC、mrr和hsdRMS限制系統(tǒng)，允許構(gòu)建更多具有代表性的基因組文庫(kù)(1,2)endA1突變，可以增加質(zhì)粒產(chǎn)量和數(shù)量? 高效率轉(zhuǎn)化大小為150 kb的質(zhì)粒，用于產(chǎn)生cDNA或基因組文庫(kù)DH10

6、B?可以表達(dá)tonA的基因型，tonA能夠提供對(duì)T1和T5噬菌體感染的抗性(DH10B? T1R)。DH10B的基因型：F mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC) 80lacZM15 lacX74 recA1 endA1 araD139 (ara, leu)7697 galU galK rpsL (StrR) nupGDH10B T1R的基因型：F mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC) 80lacZM15 lacX74 recA1 endA1 araD139 (ara, leu)7697 galU galK rpsL (StrR) nupG tonARosetta(DE3)菌

7、株首先來一些大腸桿菌表達(dá)的基本概念：一個(gè)完整的表達(dá)系統(tǒng)通常包括配套的表達(dá)載體和表達(dá)菌株，如果是特殊的誘導(dǎo)表達(dá)還包括誘導(dǎo)劑，如果是融合表達(dá)還包括純化系統(tǒng)或者Tag檢測(cè)等等。選擇表達(dá)系統(tǒng)通常要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩砜紤]，比如表達(dá)量高低，目標(biāo)蛋白的活性，表達(dá)產(chǎn)物的純化方法等等。主要?dú)w結(jié)在表達(dá)載體的選擇上。表達(dá)載體：我們關(guān)心的質(zhì)粒上的元件包括啟動(dòng)子，多克隆位點(diǎn)，終止密碼，融合Tag（如果有的話），復(fù)制子，篩選標(biāo)記/報(bào)告基因等。通常，載體很貴，我們可以通過實(shí)驗(yàn)室之間交換得到免費(fèi)的載體。但是要小心，輾轉(zhuǎn)多個(gè)實(shí)驗(yàn)室和多個(gè)實(shí)驗(yàn)室成員之手的載體是否保持原來的遺傳背景？MCS是否還是原來那個(gè)MCS？是我們要特別注意的。復(fù)

8、制子：通常表達(dá)載體都會(huì)選用高拷貝的復(fù)制子。pSC101類質(zhì)粒是嚴(yán)謹(jǐn)方式復(fù)制，拷貝數(shù)低，pCoE1，pMBI(pUC)類的復(fù)制子的拷貝數(shù)高達(dá)500以上，是表達(dá)載體常用的。通常情況下質(zhì)粒拷貝數(shù)和表達(dá)量是非線性的正相關(guān)，當(dāng)然也不是越多越好，超過細(xì)胞的承受范圍反而會(huì)損害細(xì)胞的生長(zhǎng)。如果碰巧需要2個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化，就要考慮復(fù)制元是否相容的問題。篩選標(biāo)記和報(bào)告基因：氨芐青霉素抗性是最常見的篩選標(biāo)記，卡那霉素或者是新霉素次之，通常是另一個(gè)載體的篩選標(biāo)記用。四環(huán)素，紅霉素和氯霉素等已經(jīng)日漸式微。抗性基因的選擇要注意是否會(huì)對(duì)研究對(duì)象產(chǎn)生干擾，比如代謝研究中要留意抗性基因編碼的酶是否和代謝物相互作用。在表達(dá)篩選中要注

9、意的問題應(yīng)該就是LB倒板前加抗生素的溫度，溫度過高容易導(dǎo)致抗生素失效。今天耐青霉素的超級(jí)細(xì)菌泛濫，不知道是否有我們實(shí)驗(yàn)人員的功勞呢？大家“隨便倒掉”已經(jīng)獲得氨芐抗性的大腸桿菌之前有沒有經(jīng)過煮沸或者消毒等處理呢？從以前的一針50萬單位到現(xiàn)在100多萬個(gè)單位，青霉素劑量似乎越來越大了。 對(duì)于做表達(dá)來說，如果不是要研究啟動(dòng)子的強(qiáng)弱，通常比較少關(guān)心或者用到報(bào)告基因吧。綠色熒光蛋白是最常用的報(bào)告基因了（注意選擇適用原核表達(dá)版本的GFP），其他還有半乳糖苷酶啊，熒光素酶啊等等。一些融合表達(dá)Tag也有報(bào)告基因的功能。啟動(dòng)子、終止子和核糖體結(jié)合位點(diǎn)啟動(dòng)子：?jiǎn)?dòng)子的強(qiáng)弱是對(duì)表達(dá)量有決定性影響的因素之一。從轉(zhuǎn)錄模

10、式上看有組成型表達(dá)和誘導(dǎo)調(diào)控型表達(dá)。lac和Tac，PL和PR，T7是最常用的啟動(dòng)子，生物通在下面和后繼的文章中會(huì)逐一介紹組成型表達(dá)：表達(dá)載體的啟動(dòng)子為組成型啟動(dòng)子，也就是一直努力不停表達(dá)目的蛋白的啟動(dòng)子，如pMAL系統(tǒng)。持續(xù)性表達(dá)通常表達(dá)量比較高，成本低，但是不適合表達(dá)一些對(duì)宿主細(xì)菌生長(zhǎng)有害的蛋白。因?yàn)檫^量或者有害的表達(dá)產(chǎn)物會(huì)影響細(xì)菌的生長(zhǎng)，反過來影響表達(dá)量的積累。誘導(dǎo)調(diào)控型表達(dá)：表達(dá)載體采用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，只有在誘導(dǎo)劑存在的條件下才能表達(dá)目的產(chǎn)物。這種方法有助于避免菌體生長(zhǎng)前期高表達(dá)對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響，又可減少菌體蛋白酶對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的降解。特別適合解決有毒蛋白的表達(dá)。另外也有啟動(dòng)子是組成型的，但

11、是啟動(dòng)子所依賴的轉(zhuǎn)錄酶是誘導(dǎo)表達(dá)的，也屬于誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)。融合表達(dá)：表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)上有一段融合表達(dá)標(biāo)簽（Tag），表達(dá)產(chǎn)物為融合蛋白（有分N端或者C端融合表達(dá)），方便后繼的純化步驟或者檢測(cè)。對(duì)于特別小的分子建議用較大的Tag（如GST）以獲得穩(wěn)定表達(dá)；而一般的基因多選擇小Tag以減少對(duì)目的蛋白的影響。His-Tag是最廣泛采用的Tag。分泌表達(dá)：在起始密碼和目的基因之間加入信號(hào)肽，可以引導(dǎo)目的蛋白穿越細(xì)胞膜，避免表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)的過度累積而影響細(xì)胞生長(zhǎng)，或者形成包含體，而且表達(dá)產(chǎn)物是可溶的活性狀態(tài)不需要復(fù)性。通常這種分泌只是分泌到細(xì)胞膜和細(xì)胞壁之間的周質(zhì)空間?？扇苄员磉_(dá)：大腸桿菌表達(dá)效率很

12、高，特別是強(qiáng)啟動(dòng)子，目的蛋白來不及折疊而形成不溶的包含體顆粒，包含體容易純化但是復(fù)性效率不高。分泌表達(dá)可以得到可溶的產(chǎn)物，也有部分融合Tag有助于提高產(chǎn)物的可溶性，比如Thio，pMAL系統(tǒng)。轉(zhuǎn)錄終止子對(duì)外源基因在大腸桿菌中的高效表達(dá)有重要作用控制轉(zhuǎn)錄的RNA長(zhǎng)度提高穩(wěn)定性，避免質(zhì)粒上異常表達(dá)導(dǎo)致質(zhì)粒穩(wěn)定性下降。放在啟動(dòng)子上游的轉(zhuǎn)錄終止子還可以防止其他啟動(dòng)子的通讀，降低本底。轉(zhuǎn)錄終止子有兩類，Rho因子作用下使轉(zhuǎn)錄終止mRNA和根據(jù)模版上的對(duì)稱序列形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)而終止mRNA。常見的是rrnB rRNA操縱子的T1T2串連轉(zhuǎn)錄終止子。核糖體結(jié)合位點(diǎn)：?jiǎn)?dòng)子下游從轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)開始延伸的一段堿基序列

13、，其中能與rRNA16S亞基3端互補(bǔ)的SD序列對(duì)形成翻譯起始復(fù)合物是必需的，多數(shù)載體啟動(dòng)子下游都有SD序列，也有些載體沒有，適合自帶SD序列的基因表達(dá)，要留意。表達(dá)菌株：我們往往最容易忽視的一點(diǎn)。不同的表達(dá)載體對(duì)應(yīng)有不同的表達(dá)菌株，一些特別設(shè)計(jì)的菌株更有助于解決一些表達(dá)難題，這一點(diǎn)生物通會(huì)有專門的介紹。同樣的，交換獲得的免費(fèi)菌株，要小心其遺傳背景是否已經(jīng)發(fā)生改變？當(dāng)心。注：以上各種特性是可以相互組合的，不是排他的！幾個(gè)常用的啟動(dòng)子和誘導(dǎo)調(diào)控表達(dá)系統(tǒng) 最早應(yīng)用于的表達(dá)系統(tǒng)是Lac乳糖操縱子，由 啟動(dòng)子Plac + 操縱基因lacO + 結(jié)構(gòu)基因組成。其轉(zhuǎn)錄受CAP正調(diào)控和lacI負(fù)調(diào)控。lacU

14、V5突變能夠在沒有CAP的存在下更有效地起始轉(zhuǎn)錄，該啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)錄水平上只受lacI的調(diào)控，因而隨后得到了更廣泛采用。lacI產(chǎn)物是一種阻遏蛋白，能結(jié)合在操縱基因lacO 上從而阻遏轉(zhuǎn)錄起始。乳糖的類似物IPTG可以和lacI產(chǎn)物結(jié)合，使其構(gòu)象改變離開lacO，從而激活轉(zhuǎn)錄。這種可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控成為了大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)載體構(gòu)建的常用元件。tac啟動(dòng)子是trp啟動(dòng)子和lacUV5的拼接雜合啟動(dòng)子，且轉(zhuǎn)錄水平更高，比lacUV5更優(yōu)越。trc啟動(dòng)子是trp啟動(dòng)子和lac啟動(dòng)子的拼合啟動(dòng)子，同樣具有比trp更高的轉(zhuǎn)錄效率和受lacI阻遏蛋白調(diào)控的強(qiáng)啟動(dòng)子特性。在常規(guī)的大腸桿菌中，lacI阻遏蛋白表達(dá)量不

15、高，僅能滿足細(xì)胞自身的lac操縱子，無法應(yīng)付多拷貝的質(zhì)粒的需求，導(dǎo)致非誘導(dǎo)條件下較高的本底表達(dá)，為了讓表達(dá)系統(tǒng)嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控產(chǎn)物表達(dá)，能過量表達(dá)lacI阻遏蛋白的lacIq突變菌株常被選為L(zhǎng)ac/Tac/trc表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)菌株?，F(xiàn)在的Lac/Tac/trc載體上通常還帶有l(wèi)acIq基因，以表達(dá)更多l(xiāng)acI阻遏蛋白實(shí)現(xiàn)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)恼T導(dǎo)調(diào)控。IPTG廣泛用于誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，但是IPTG有一定毒性，有人認(rèn)為在制備醫(yī)療目的的重組蛋白并不合適，因而也有用乳糖代替IPTG作為誘導(dǎo)物的研究。另外一種研究方向是用lacI的溫度敏感突變體，30度下抑制轉(zhuǎn)錄，42度開發(fā)。熱誘導(dǎo)不用添加外來的誘導(dǎo)物，成本低，但是由于發(fā)酵過程中

16、加熱升溫比較慢而影響誘導(dǎo)效果，而且熱誘導(dǎo)本身會(huì)導(dǎo)致大腸桿菌的熱休克蛋白激活，一些蛋白酶會(huì)影響產(chǎn)物穩(wěn)定。以噬菌體再起轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子PL、PR構(gòu)建的載體也為大家所熟悉。這兩個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子受控于噬菌體cI基因產(chǎn)物。cI基因的溫度敏感突變體cI857(ts)常常被用于調(diào)控PL、PR啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。同樣也是30度下阻遏啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄，42度下解除抑制開發(fā)轉(zhuǎn)錄。同樣的，PL、PR表達(dá)載體需要攜帶cI857(ts)菌株作為表達(dá)載體，現(xiàn)在更常見的做法是在載體上攜帶cI857(ts)基因，所以可以有更大的宿主選擇范圍。另外一種思路是通過嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控cI產(chǎn)物來間接調(diào)控PL、PR啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。比如Invitrogen的PL表達(dá)系統(tǒng)，

17、就是將受trp啟動(dòng)子嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控的cI基因溶源化到宿主菌染色體上，通過加入酪氨酸誘導(dǎo)抑制trp啟動(dòng)子，抑制cI基因的表達(dá)，從而解除強(qiáng)大的PL啟動(dòng)子的抑制。 T7啟動(dòng)子是當(dāng)今大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的主流，這個(gè)功能強(qiáng)大兼專一性高的啟動(dòng)子經(jīng)過巧妙的設(shè)計(jì)而成為原核表達(dá)的首選，尤其以Novagen公司的pET系統(tǒng)為杰出代表。強(qiáng)大的T7啟動(dòng)子完全專一受控于T7 RNA 聚合酶，而高活性的T7 RNA 聚合酶合成mRNA的速度比大腸桿菌RNA聚合酶快5倍當(dāng)二者同時(shí)存在時(shí)，宿主本身基因的轉(zhuǎn)錄競(jìng)爭(zhēng)不過T7表達(dá)系統(tǒng)，幾乎所有的細(xì)胞資源都用于表達(dá)目的蛋白；誘導(dǎo)表達(dá)后僅幾個(gè)小時(shí)目的蛋白通?？梢哉嫉郊?xì)胞總蛋白的50%以上。由于大

18、腸桿菌本身不含T7 RNA 聚合酶，需要將外源的T7 RNA 聚合酶引入宿主菌，因而T7 RNA 聚合酶的調(diào)控模式就決定了T7系統(tǒng)的調(diào)控模式非誘導(dǎo)條件下，可以使目的基因完全處于沉默狀態(tài)而不轉(zhuǎn)錄，從而避免目的基因毒性對(duì)宿主細(xì)胞以及質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響；通過控制誘導(dǎo)條件控制T7 RNA 聚合酶的量，就可以控制產(chǎn)物表達(dá)量，某些情況下可以提高產(chǎn)物的可溶性部分。有何高招？且看生物通為你一一道來： 有幾種方案可用于調(diào)控T7 RNA 聚合酶的合成，從而調(diào)控T7表達(dá)系統(tǒng)。1.噬菌體DE3是lambda噬菌體的衍生株，含有l(wèi)acI抑制基因和位于lacUV5啟動(dòng)子下的T7 RNA 聚合酶基因。DE3溶源化的菌株如BL21(DE3)就是最常用的表達(dá)菌株，構(gòu)建好的表達(dá)載體可以直接轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株中，誘導(dǎo)調(diào)控方式和lac一樣都是IPTG誘導(dǎo)。2.另一種策略是用不含T7 RNA聚合酶的宿主菌克隆目的基因，即可完全避免因目的蛋白對(duì)宿主細(xì)胞的潛在毒性而造成的質(zhì)粒不穩(wěn)定。然后用CE6噬菌體侵染宿主細(xì)胞CE6是lambda噬菌體含溫度敏感突變(cI857ts)和pL/pR啟動(dòng)子控制T7 R