DNA限制酶切反應(yīng)和限制酶譜繪制

1、第 四 節(jié) DNA限制酶切反應(yīng)和 限制酶譜繪制,一DNA的限制酶反應(yīng) 1. 酶單位定義: 使1g某種DNA在最適反應(yīng)條件下和1小時內(nèi)完全酶切所需的限制酶活性。 2. 酶切反應(yīng)類型 1) 完全酶切 SV40(5243bp) pBR322(4363bp) 2) 部分酶切 3. 酶切反應(yīng)最適條件 1) DNA分子的組成 i. 堿基組成與排列方式 ii. 識別位點兩側(cè)的堿基組成與排列方式，同一DNA分子中不同識別位點的酶切速度可相差10倍（如中的EcoRI位點） 2) 反應(yīng)條件 i. DNA溶液的純度和濃度（反應(yīng)濃度,依實驗?zāi)康亩?HpaI(C CGG) 1 26,ThaI (CG CG) 0 23

2、,ii. 限制酶的純度和穩(wěn)定性 i) 純度：盡可能保持廠家推薦的反應(yīng)條件 ii) 穩(wěn)定性：保存和反應(yīng) iii. 反應(yīng)緩沖液：常用三種核心緩沖液，即高（H），中（M），低（L）鹽緩沖液，不同溫度下的pH值 iv. 反應(yīng)溫度：大多數(shù)為37 v.雙酶切和多酶切反應(yīng) 同時酶切和分別酶切。前者要求兩種酶使用的緩沖液和反應(yīng)溫度必須相同，即使相同時，一旦發(fā)生部分酶切反應(yīng)，便無法判斷是何種酶造成的，因此最好采用后者-分別酶切。 i) 第一種酶切 電泳檢查 酚/氯仿純化 第二種酶切。 可不考慮酶切先后順序，但操作步驟多。 ii) 采用低濃度鹽緩沖液的限制酶切 電泳檢查 采用高濃度鹽緩沖液的限制酶切。操作簡單，但

3、要分先后。 假如兩酶切位點相距很近（如多克隆位點區(qū)），首先考慮的則是相互間的酶切是否有影響，兩種酶切順序不同時，其結(jié)果大不相同。 如SmaI-BamH(c), BamHI-SmaI(p,二、限制酶圖譜的繪制 1. 完全酶切作圖法 1）單酶切作圖法 一長度為5Kb的線狀DNA分子用兩種限制酶完全酶切的凝膠電泳結(jié)果和各位點的可能性排列。要確定其位置，可采用下述輔助方法之一。 i. 單酶部分酶切：部分酶切時，各種可能性均存在，但只有相鄰的兩個DNA片段才有可能出現(xiàn)在凝膠上,ii. 末端標(biāo)記完全酶切 DNA片段 末端標(biāo)記 完全酶切 凝膠電泳 EtBr染 色觀察 放射自顯影,2) 雙酶切作圖法 單酶切結(jié)

4、果只能確定一種酶的位點，要將兩種單酶切結(jié)果畫在一張圖上時則不行,分別作圖時，同一種酶的兩種作圖法都是對的，但當(dāng)作在一張圖上時，上述兩種可能性中只有一種是對的，因此必須進行雙酶切反應(yīng)，其結(jié)果見圖 根據(jù)上述的原理和步驟，前述的5 Kb片段酶I與酶II的定位結(jié)果可用兩種方法之一： i) 單酶切 分離DNA片段 第二種酶切 凝膠電泳 ii)單酶切 第二種酶切 凝膠電泳 *如果要同時將兩種限制酶定位在一條DNA上時，單酶完全酶切作圖就沒必要了,2. 末端標(biāo)記-部分酶切作圖法（Smith-Brinstiel法,DNA片段 末端標(biāo)記 酶1切 分離帶標(biāo)記 DNA片段 酶2部分酶切 電泳 EtBr染色照相 放射

5、自顯影 結(jié)果 單端標(biāo)記方法: 人工合成單端標(biāo)記法 限制酶切單端標(biāo)記法,單端標(biāo)記方法1 人工合成單端標(biāo)記法,單端標(biāo)記方法2 限制酶切單端標(biāo)記法,3. 末端標(biāo)記雙相作圖法 方法2仍存在兩個不足之處：酶1的選擇不能靠近DNA中央；需先分離DNA片段，該法可克服上述缺點。 現(xiàn)假設(shè)有一片段長10 Kb，其中RE1有三個切點，RE2有一個切點，其圖譜可能是,4. Bal31順序酶解作圖法 DNA片段 Bal31處理不同時間取樣終止反應(yīng) 限制酶切 凝膠電泳 染色觀察結(jié)果,5. 切口移位作圖法(可檢測出100bp片段) 雙鏈DNA 切口移位 限制酶切 電泳 放射自顯影,6. 大尺度限制酶作圖 1) 條件 i.

6、 電泳方法-脈沖場凝膠電泳 ii. 樣品制備-原位DNA制備和酶解 iii.人工染色體構(gòu)建-pYAC載體構(gòu)建 iv.脊椎動物基因組中的CpG和植物基因組中的CpXpG序列存在 2) 一般作圖程序 原位DNA樣品制備 原位DNA限制酶切 脈沖場凝膠電泳 染色 觀察 3) 大尺度作圖用酶 i. 稀有識別序列內(nèi)切酶-I型內(nèi)含子內(nèi)切酶 (真菌細(xì)胞核和線粒體基因組,T4噬菌體,衣藻葉綠體和線粒體)；酵母HO內(nèi)切酶；大腸桿菌recA 雖然這些內(nèi)切酶識別的序列都很長：10-19 bp，但高等動植物基因組中含有這類位點卻極少，因而很少使用,ii.II型限制酶 人基因組有45,000個CpG島,一個長度約為1.

7、5 kb富含GC的DNA片段,其中只有25%的CpG島未被甲基化,這些CpG島常位于基因的5-端,未被甲基化的CpG島平均長約270 kb 可用于大尺度限制酶作圖的限制酶具有如下特征：識別8或6 bp序列；富含或只含GC序列；含有CpG序列 i) AscI-GGCGCGCC和NotI-GCGGCCGC ii) FseI-GGCCGGCC和SrFI-GCCCGGGC iii) SfiI-GGCCNNNNNGGCC iv) CpoI/CspI/RsrII-CGGA(T)CCG v) BssHI-GCGCGC,EagI-CGGCCG和SacII-CCGCGG vi) NaeI-GCCGGC,NarI

8、-GGCGGC,SmaI-CCCGGG vii) MluI-ACGCGT, NruI-TCGCGA, PvuI-CGATCG, SplI-CGTACG,三.限制酶圖譜的用途 1.基因工程中的應(yīng)用 1)克隆載體圖譜,便于DNA重組; 2)克隆片段圖譜可用于次克隆,體外突變,基因定位,核酸定序. 2.突變體檢測 遺傳學(xué)圖譜必須依賴各種突變體存在,因此必然發(fā)生了基因型和表型的變化. 限制酶圖譜不必依賴表型變化,酶譜的變化一定是基因型發(fā)生了變化,但不一定發(fā)生了表型變化,即表型的變化不一定會導(dǎo)致酶譜變化. 1)缺失突變體的檢測:某DNA片段消失,代之以一較小DNA片段. 2)插入突變體的檢測:某DNA片

9、段消失,代之以一較大DNA片段,缺失和插入突變體的檢測（I,I II,點突變的檢測（II,3）點突變的檢測: 某DNA片段消失,代之以兩較小的DNA片段.前者的長度等于后兩者長度之和(位點增加)；某兩DNA片段消失,代之以一較大DNA片段，前者的長度之和等于后者長度(位點消失). 3.重組頻率的測定 同一染色體座位上的等位基因可能具有不同的表型,從而構(gòu)成遺傳多型性.等位基因的限制酶譜也可能具有多型性,這就是限制酶片段長度多型性(Restriction fragment length polymorphism, RFLP,不同個體 總DNA 限制酶完全酶切 Southern印跡 雜交 結(jié)果分析,

10、當(dāng)不同個體交配時,除自由組合外,也可發(fā)生重組,如不同果蠅交配時,其后代的表型和限制酶譜可為: 表型 紅:白=1:1, 限制酶譜 30%個體已發(fā)生了重組,4.遺傳疾病的診斷 分析正常人與遺傳病患者的某些DNA片段的限制酶譜,便可發(fā)現(xiàn)其差異,并總結(jié)出各種遺傳疾病的限制酶長度多態(tài)性圖。臨床診斷時，將遺傳病可疑患者的限制酶譜與之比較,便可判斷其是否患有此病,第五節(jié) DNA 的 連 接,一. DNA的連接方法 兩種不同的DNA分子可以經(jīng)過下述的方法之一進行連接,而方法的選用則是根據(jù)其兩者末端的DNA結(jié)構(gòu). 1. 直接連結(jié)法-該法適用于: 1)同種限制酶作用不同DNA片段產(chǎn)生的相同粘性末端 重組DNA可用

11、同種酶再切開,但識別簡并序列的限制酶除外(如AraI) 2) 不同種限制酶作用不同DNA片段產(chǎn)生的相容性末端 i.重組DNA分子不能再為這兩種酶所作用,如:BamHI/BglII ii.重組DNA分子可為其中一種酶所作用,但為另一種酶作用的可能性較小,如MboI/BamHI 3) PCR產(chǎn)物與特定載體的連接 4) 限制酶和其他方式產(chǎn)生的平整末端,2.人工接頭連接法 1) 人工接頭（linker）的結(jié)構(gòu) i. 中軸對稱互補,可自行退火形成雙鏈.如: 5-CCGGAATTCCGG- 3 3-GGCCTTAAGGCC-5 ii. 至少有一特定的限制酶識別位點 iii. 某種限制酶的一套人工接頭可使插

12、入片段與表達(dá)載體保持同相.如: 八聚體 d(GGAATTCC) 十聚體 d(CGGAATTCCG) 十二聚體 d(CCGGAATTCCGG) 2) 用途 i. 平整末端的連接(各種結(jié)構(gòu)的DNA末端均可經(jīng)過修飾變成平整末端,2 X 5-CCGGAATTCCGG-3,退火,ii. 產(chǎn)生新的克隆位點 iii. 合成匹配接頭 3) 連接方法 人工接頭磷酸化 退火形成雙鏈 與目的DNA相連 限制 酶切 兩DNA分子相連 4) 適用范圍 人工接頭連接法適合于那些只有一種DNA片段需加人工接頭就可以與另一DNA分子相連的DNA分子.利用人工接頭也可使任意兩個平端的DNA分子相連.這種直接相連的辦法簡便,快速

13、,但最后連接起來的DNA可能具有不同的結(jié)構(gòu).為避免這些結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生,可先使一種DNA先加上人工接頭后,再與另一種DNA分子相連,3. 匹配接頭連接法 人工接頭雖然可連接兩個具不同末端的DNA分子,但這些末端在加入人工接頭前必須變?yōu)槠秸┒?然而,有時實驗不容許使用人工接頭或使用人工接頭不方便,此時,便可使用匹配接頭,它可用于直接連接各種具不同末端的DNA分子: i. 平端 + 突起末端(5-突起, 3-突起) ii.粘性末端 (5-突起 + 5-突起: EcoRI+HindIII 5-突起 + 3-突起: EcoRI+PstI 3-突起 + 3-突起: PstI+SacI) 1)匹配接頭的結(jié)構(gòu)特

14、點 i. 由兩個低聚核苷酸組成 ii. 部分區(qū)域可以互補 iii. 退火后的雙鏈低聚核苷酸可以形成兩個不同的末端 2)匹配接頭的種類,i. 預(yù)制匹配接頭(連接平端和粘性末端) 人工接頭 + 匹配接頭 預(yù)制匹配接頭 ii. 轉(zhuǎn)換匹配接頭(連接5-突起和3-突起末端) 二匹配接頭退火 轉(zhuǎn)換匹配接頭 二人工接頭 連接酶 雙酶切 轉(zhuǎn)換匹配接頭 iii. 單鏈匹配接頭(連接5-突起和3-突起末端) 4. 同聚物加尾連接法 在兩個不同的DNA分子末端各加上一個可互補的同聚物,即AT或GC. 5. 連接方法的選擇 方法選擇的依據(jù): 1) 兩DNA分子的末端結(jié)構(gòu) 2) DNA 分子的限制酶譜 3) 是否需要回

15、收DNA片段,連接方式的選擇 載體末端 外源DNA末端 常規(guī)連接 脫磷酸化 同聚物 平端連接 補齊,人工接頭 結(jié)構(gòu) 結(jié)構(gòu) 載體 加尾 外切酶 5-突起 相容5-突起 第二選擇 第一選擇 不能 不能 不能 5-突起 非相容5-突起 不能 結(jié)合使用接頭 不能 不能 第一選擇 3-突起 相容3-突起 唯一選擇 不能 不能 不能 不能 3-突起 非相容3-突起 不能 不能 第一選擇 不能 第二選擇 或平端 3-突起 5-端突起 不能 不能 第一選擇 不能 第二選擇 (補齊后) 平端 平端 不能 可能 可能 第一選擇 可能 平端 3-或5-突起 不能 不能 第一選擇 不能 第二選擇,二. DNA的連接反

16、應(yīng) 1. 連接反應(yīng)理論 當(dāng)兩種DNA分子相連時,它們可能產(chǎn)生不同的結(jié)果,這些結(jié)果與以下因素有關(guān): 1)連接反應(yīng)系統(tǒng)中的總DNA濃度i 2)一個DNA分子靠近同一分子另一端的有效濃度j, 該值與DNA的長度成反比,即DNA分子越大,該分子的兩末端越不易相互作用(即自身環(huán)化) 3)兩種不同DNA分子的克分子濃度之比值. 2. 連接反應(yīng)條件 1)評估連接反應(yīng)結(jié)果的方法 i. 瓊脂糖凝膠電泳 ii.大腸桿菌轉(zhuǎn)化 2)反應(yīng)條件,i. 溫度 ii. ATP濃度 iii. 時間 iv. 連接酶濃度 v.克分子比率,第六節(jié) PCR 技 術(shù),一DNA 體外擴增技術(shù) 1.PCR反應(yīng)體系 1) 基本原理(PCRPo

17、lymerase Chain Reaction 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)) 一個DNA經(jīng)n次擴增后, 一個DNA分子可變?yōu)?n個分子DNA擴增需要對待擴增的DNA序列有所了解，至少要對其兩側(cè)的核苷酸序列為已知，以便合成寡核苷酸引物 2) 基本操作 待擴增的DNA片段+dNTP+TrisHCl緩沖液+兩引物 90變性30 50退火30 加入Taq DNA聚合酶 75 1 進入第二次循環(huán) 25-30次循環(huán),PCR原理示意圖,2. PCR產(chǎn)物的鑒定 1) PCR產(chǎn)物的大小和限制酶譜分析,2) 寡聚核苷酸限制性內(nèi)切酶片段分析（OR分析，Oligomer Restriction analysis） OR分析對于P

18、CR產(chǎn)物的限制酶位點上發(fā)生了點突變的檢測極其有用,PCR產(chǎn)物的OR鑒定,3) 分子雜交 適合于檢測PCR產(chǎn)物的非限制酶位點上堿基突變。它是利用兩條引物鏈間的特異性DNA片段作探針(常為人工合成的一段低聚核苷酸，約20 n.t.).當(dāng)這種探針的核苷酸序列與待測的DNA核苷酸序列完全互補時才能雜交。如果利用多種等位基因特異性寡核苷酸探針（allele-specific Oligonucleotide, ASO）與PCR產(chǎn)物進行雜交，可檢測出PCR產(chǎn)物的堿基突變。 可直接利用斑點雜交方法用于基因型分析,4) 核苷酸序列分析 DNA擴增產(chǎn)物 變性 與末端標(biāo)記的擴增引物或定序引物退火 雙脫氧核苷酸鏈終止

19、反應(yīng)，測定DNA序列,二Taq DNA聚合酶的特點 Taq DNA聚合酶是從一種極度嗜熱水生棲熱菌YT-1中分離純化而得。該酶的分子量為63-68 kD 1. 無磷酸單酯酶、磷酸二酯酶以及單鏈外切酶活性，無內(nèi)切酶活性，但具有依賴于聚合酶活性的5 3外切酶活性 2. 最適反應(yīng)溫度為80 3. 最適pH8.0和最佳反緩沖液TrisHCl 4. 最佳二價陽離子Mg2+ （10 mM） 5. 具良好的熱穩(wěn)定性：在90下連續(xù)反應(yīng)30分鐘仍有70%的酶活,Taq DNA聚合酶的特性,當(dāng)采用Taq DNA聚合酶進行DNA體外擴增時，必須考慮到以下五個參數(shù)： 1）熱穩(wěn)定性：在PCR循環(huán)中DNA的變性時間常為3

20、0-60，若循環(huán)30次，其累計加熱變性時間為15-30。Taq DNA聚合酶在90下保溫30仍具有70%酶活性，可大大減少操作步驟，易于實現(xiàn)自動化 *2）模板與引物的特異性：當(dāng)退火溫度和DNA鏈延伸時溫度偏低時，引物與模板配對的特異性大大降低，從而導(dǎo)致一些不需要的DNA片段被擴增。顯然，其產(chǎn)物的專一性大大降低，使結(jié)果無法分析。由于Taq DNA聚合酶最適反應(yīng)溫度為80，退火溫度可提高到55以上，由此大大減少了引物與模板的非專一性結(jié)合，使產(chǎn)物均一性大大增加 *3）合成產(chǎn)率：反應(yīng)底物和產(chǎn)物在DNA擴增中不斷發(fā)生變化，最終將會導(dǎo)致聚合反應(yīng)進入平臺期，平臺期出現(xiàn)的時間與聚合酶的特性有關(guān)。研究表明，利用

21、Klenow片段進行20次擴增后進入平臺期，累積產(chǎn)物拷貝數(shù)為2105，當(dāng)采用Taq DNA聚合酶時，擴增25次后才進入平臺期，拷貝數(shù)可大4106 *4）延伸長度：有時為了獲取較長DNA片段的擴增，這就要求DNA聚合酶具有較強的延伸能力。當(dāng)擴增片段大于250 bp時，Klenow片段和T4聚合酶擴增產(chǎn)率大大降低。利用T7 DNA聚合酶，可使擴增片段達(dá)2 Kb。當(dāng)利用Taq DNA聚合酶時，最長延伸長度為4.4 Kb,經(jīng)改造的Taq DNA聚合酶可擴增出40 kb的DNA 片段. 5）擴增產(chǎn)物的可靠性：評估DNA聚合酶的一個重要指標(biāo)是它復(fù)制DNA的可靠性，即摻入錯誤堿基的頻率。這對于PCR技術(shù)的可

22、靠性是至關(guān)重要的。Klenow片段的錯誤摻入率為10-4，Taq DNA聚合酶的錯誤摻入率為510-3 ，而T4聚合酶的錯誤摻入率為10-7。 *注：1）退火溫度常與引物的長度和堿基組成有直接相關(guān)關(guān)系，引物越長或GC含量較高，退火的溫度可以高些，反之則低些。退火溫度越高，引物與模板（即擴增的DNA）結(jié)合的特異性越高，這可大大減少非特異性DNA片段的擴增。 引物的長度常為20-28聚體，其中有50%以上的GC含量，無自身互補序列，特別是3末端不應(yīng)有內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)，引物加量為每100l l20pmol. *2)出現(xiàn)平臺期的原因可能有：后期循環(huán)酶濃度或聚合時間不足；引物耗盡；dNTP耗盡；產(chǎn)物濃度過高

23、，以致ds-DNA解鏈后又迅速退火，不能與引物結(jié)合。 *3）鏈延伸長度與延伸時間有關(guān)，對于Taq DNA聚合酶，每分鐘可形成2000 n.t.或更多。如果要擴增3-4 Kb的DNA，在72下需將酶延伸時間增至3-4分鐘,三PCR方法 1. 強化PCR（Boosted PCR） 將PCR分為兩個階段： 1）引物與模板之比為107，擴增20個周期 2）引物與模板之比為1012 1013，再擴增10個周期 該法適合于待擴增DNA濃度較低時。 2.混合寡核苷酸引物PCR（mixed oligonucleotide primed amplification of cDNA,MOPAC） 根據(jù)各氨基酸最常

24、用的密碼子合成一系列引物，對某一特定cDNA進行擴增。 3. 錨定PCR(Anchored PCR，A-PCR,4. 連結(jié)PCR(ligation mediated PCR) 該法可用于核苷酸序列測定,DNA足跡分析技術(shù)和測定甲基化作用,5. 不對稱PCR(Asymmetrical PCR) 采用不同引物濃度比率，如50：1，100：1，可得大量拷貝的ssDNA用于測序,6. GC串PCR (GC clamp PCR) 應(yīng)用變性劑梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)可檢測出DNA片段中一對堿基的變化，在DNA分子一端加上一G

25、C串（約40 n.t.）利用它的高解鏈溫度特性，在梯度變性膠上可檢測出原DNA鏈中最高解鏈區(qū)內(nèi)的點突變,7.競爭引物PCR (competitive oligonucieotide primer PCR,COP-PCR) 有一個堿基變化的兩種引物在較寬松的復(fù)性條件下競爭DNA模板，其中只有完全互補的引物才能大量配對。該法可用于測定某一DNA片段上是否帶有某一已知堿基置換,8.等位基因?qū)Ｒ籔CR(Allele specific PCR,ASPCR) 該法可用于檢測點突變。如用于檢測鐮刀形貧血癥,9.反轉(zhuǎn)PCR(inverserar inverted PCR) 該法可用于擴增已知 序列兩側(cè)的未知序列,10.反向PCR(reverse transcription PCR, RT-PCR) 主要用于mRNA的PCR擴增,11.加端PCR(Add-on PCR) 在合成引物時加上研究者所需要的核苷酸序列，如某種限制酶的識別序列，某一基因的調(diào)控或其它必需序列 12.錯配PCR（mismatched