消毒滅菌,腸道致病菌分離培養(yǎng)和抗酸染色

1、實驗二,三. 抗酸染色,一. 消毒滅菌,二. 腸道致病菌的分離培養(yǎng),一、消毒滅菌,物理因素對細(xì)菌的影響 2. 化學(xué)因素對細(xì)菌的影響,一） 物理因素對細(xì)菌的影響,高壓蒸汽滅菌法 紫外線對細(xì)菌的影響,高壓蒸氣滅菌法,原理：蒸汽被限制在密閉容器內(nèi)，隨著熱力 的作用壓力不斷升高，蒸汽的溫度也 相應(yīng)升高，在103.4kPa蒸汽壓力下 時，溫度可達(dá)121.3。維持15-20分 鐘后可殺死細(xì)菌包括芽孢在內(nèi)的所有 微生物,高壓蒸氣滅菌器,1) 構(gòu)造 高壓蒸氣滅菌器是一個雙層的金屬圓筒，兩層之間盛水，外層堅厚，其上或前方有金屬厚蓋。蓋旁附有螺栓，借以緊閉蓋門，使蒸氣不能外溢。 高壓蒸氣滅菌器上裝有排氣閥、安全閥

2、，以調(diào)節(jié)器內(nèi)壓力，裝有的溫度計及壓力表以示內(nèi)部溫度和壓力。 器內(nèi)裝有帶孔的金屬擱板，用以放置欲滅菌對象,高壓蒸汽滅菌法,壓力：1.05kg/ 或103.425KPa 溫度: 121.3 時間：15-20min,完全殺滅細(xì)菌的繁殖體和芽孢,用途：適用于耐高溫、高壓，不怕潮濕的物品， 如敷料、 手術(shù)器械、藥品、細(xì)菌培養(yǎng)基等,2)使用方法 加水至鍋內(nèi)達(dá)規(guī)定的水平面，放入欲滅菌物品，把鍋蓋按對稱的螺旋先后對稱用力（切勿單個依次）扭緊，使鍋蓋確實均勻密閉。 用電爐加熱，同時打開排氣閥門，使器內(nèi)冷空氣逸出，待空氣全部排出后，關(guān)閉排氣閥。 繼續(xù)加熱并觀察壓力表，器內(nèi)壓力又逐漸升高，直到壓力表指在所需數(shù)字（例

3、如15磅）即調(diào)節(jié)熱源，維持2030min可完全殺死細(xì)菌的繁殖體和芽胞。 滅菌時間到達(dá)后，停止加熱，待壓力自行下降至零時方可徐徐開放排氣閥，排盡余氣，打開鍋蓋，取出滅菌物品,3)注意事項 檢查排氣活塞及安全閥門，特別是壓力表的性能是否正常，以免發(fā)生危險。 滅菌物品不應(yīng)放置過擠，妨礙蒸氣流通，影響滅菌效果。 滅菌開始時必須將器內(nèi)冷空氣完全排除，否則壓力表上所示壓力并非全部是蒸氣壓力，滅菌將不徹底。 滅菌過程中及滅菌完畢，滅菌后切不可排氣過急，突然打開排氣閥門放氣減壓，以免瓶內(nèi)液體外溢或者破裂,全自動高壓蒸汽滅菌鍋,臺式蒸汽滅菌器 BA-30,Systec D-200 2D 雙門高壓滅菌器,電熱臥式

4、圓形壓力蒸汽滅菌器(型號YXQ-WY21-600,全自動噴淋式高溫高壓調(diào)理殺菌鍋,電腦全自動水浴式串聯(lián)殺菌鍋,紫外線對細(xì)菌的影響,原理：紫外線主要作用于DNA，使一條DNA鏈上的兩個相鄰胸腺嘧啶以共價鍵結(jié)合成二聚體，從而干擾DNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致細(xì)菌變異或死亡。對病毒也有破壞作用,特點：紫外線殺菌作用強，而穿透能力弱。普通 玻璃、紙張、水蒸氣、塵埃等均能阻擋。 紫外線中波長為240-300nm者具有殺菌能 力，其中265-266nm的殺菌作用最強,用途：常用于消毒物體表面，手術(shù)室無菌實驗 室，傳染病房的空氣消毒及不耐熱物品消毒,紫外線對細(xì)菌的影響,方法：取一個平皿，用密涂法將細(xì)菌涂布于培養(yǎng)皿中

5、，然后按圖所示揭開平皿蓋，置于紫外線下照射30分鐘，然后蓋好蓋子，置37培養(yǎng)24h后取出觀察結(jié)果,濾紙片用后需要用火燒掉,每個實驗室4個平板,密涂接種,分三次接種，每次取一環(huán)。第一次密涂接種后旋轉(zhuǎn)60度二次密涂接種，然后同方向旋轉(zhuǎn)60度后再次密涂接種,1. 促進(jìn)菌體蛋白質(zhì)變性或凝固; 2. 干擾細(xì)菌酶系統(tǒng)和代謝; 3. 損傷細(xì)菌的細(xì)胞膜，影響細(xì)菌的化學(xué)組成， 物理結(jié)構(gòu)和生理活動。 有些化學(xué)藥品濃度高時能殺滅病原微生物，稱為化學(xué)消毒劑；濃度低時能抑制細(xì)菌生長，稱為防腐劑。（只能外用，對細(xì)菌的敏感性不同,二） 化學(xué)因素對細(xì)菌的影響,化學(xué)消毒劑分類,高效消毒劑：殺滅細(xì)菌芽孢在內(nèi)的所有微生物，適用于

6、不耐熱力滅菌但要進(jìn)入人體內(nèi)部的物品，如內(nèi)窺鏡等。 如：次氯酸鈉、過氧化氫、甲醛、環(huán)氧乙烷等 中效消毒劑：不能殺滅芽孢，但能殺滅繁殖體（包括結(jié) 核桿菌），真菌和大多病毒，適用于喉鏡，麻醉器材等。 如：碘酊、乙醇等 低效消毒劑：能殺滅大多細(xì)菌繁殖體，但不能殺滅芽 孢，結(jié)核桿菌及某些抵抗力強的真菌和病毒。 如：新潔爾滅、洗必泰、高錳酸鉀等,化學(xué)消毒劑對細(xì)菌的影響,方法：取一普通平皿培養(yǎng)基，一部分寫上“前”，另一部分寫上“后”，然后將手指在寫有“前”的部分沾一下，再將手指用酒精、碘酒或新潔爾滅進(jìn)行消毒，在寫有“后”的部分沾一下。放入37溫箱培養(yǎng)24小時后觀察,每個實驗室4個平皿,二、腸道致病菌的分離培

7、養(yǎng),腸道致病菌的生物學(xué)性狀 SS培養(yǎng)基的特性及用途 分離培養(yǎng)方法,腸道桿菌的生物學(xué)性狀,埃希菌屬：大腸埃希菌 沙門菌屬：傷寒沙門菌 甲型、乙型副傷寒沙門菌 志賀菌屬：痢疾志賀菌,腸桿菌科重要菌屬及代表菌種,1、相似的形態(tài)染色從形態(tài)上無法區(qū)別,中等大小的G-桿菌,多有鞭毛、菌毛,腸道桿菌的生物學(xué)性狀,2、活潑的生化反應(yīng),腸道桿菌的生物學(xué)性狀,乳糖發(fā)酵試驗,腸道桿菌的生物學(xué)性狀,2、活潑的生化反應(yīng),SS培養(yǎng)基的特性（Salmonella -Shigella Medium,膽鹽抑制G+,枸櫞酸鈉和煌綠能部分抑制大腸桿菌,致病的沙門菌和志賀菌能大量生長。 中性紅指示劑和乳糖,中性紅遇酸變粉紅。 常用于

8、培養(yǎng)腸道致病菌,牛肉浸粉 蛋白胨 乳糖 硫代硫酸鈉 枸櫞酸鈉 煌綠 膽鹽 中性紅 瓊脂,Salmonella -Shigella Medium,主要成分 基礎(chǔ)營養(yǎng) 乳糖 指示劑 抑制劑,分解乳糖,不分解乳糖,產(chǎn)酸,PH下降,指示劑變紅色,紅色大菌落,大腸桿菌等,無明顯變化,無色半透明小菌落,志賀菌、沙門菌,大腸桿菌,痢疾桿菌,SS平板 大腸桿菌 粉紅色大菌落 痢疾桿菌 無色細(xì)小 半透明菌落 傷寒桿菌 無色細(xì)小 半透明菌落,SS培養(yǎng)基的特性及用途,將糞便標(biāo)本以分區(qū)劃線法接種到SS培養(yǎng)基。 (每個實驗室8個平板，接種好后，做好標(biāo)記，用膠布按班綁好） 注：每個平板只可操作一次，不可重復(fù)操作 放入37

9、溫箱中培養(yǎng)24小時。取出放4冰箱中保存?zhèn)溆?腸道致病菌的分離培養(yǎng)方法,實驗?zāi)康摹?1. 掌握分枝桿菌抗酸染色的操作方法和意義。 2. 熟悉抗酸染色的原理,三、抗酸染色（Acid fast stain,分枝桿菌的細(xì)胞壁內(nèi)含有大量的脂質(zhì)，主要是分枝菌酸，它包圍在肽聚糖的外面，所以分枝桿菌一般不易著色，要經(jīng)過加熱和延長染色時間來促使其著色。但分枝桿菌中的分枝菌酸與染料結(jié)合后，就很難被酸性脫色劑脫色，故名抗酸染色。 齊-尼氏抗酸染色法是在加熱條件下使分枝菌酸與石炭酸復(fù)紅牢固結(jié)合成復(fù)合物，用3%鹽酸酒精處理也不脫色。當(dāng)再加堿性美蘭復(fù)染后，分枝桿菌仍然為紅色，而其他細(xì)菌及背景中的物質(zhì)為藍(lán)色,實驗原理,細(xì)菌

10、：卡介苗 （Bacillus Calmette-Guerin， BCG） 染液：石炭酸復(fù)紅液、3%鹽酸酒精、堿性美蘭溶液 其它：接種環(huán)、酒精燈、載玻片、玻片夾等,實驗材料,1.細(xì)菌涂片的制備 涂片 干燥 固定 2.染色 1）初染：用玻片夾夾持涂片標(biāo)本，滴加石炭酸復(fù)紅2-3 滴，在火焰高處（2-10cm）徐徐加熱，切勿沸騰，出現(xiàn)蒸汽即暫時離開，加熱35min，若染液蒸發(fā)減少，應(yīng)再加染液，以免干涸，待標(biāo)本冷卻后用水沖洗。 2）脫色： 3%鹽酸酒精脫色30s1min；用水沖洗。 3）復(fù)染：用堿性美蘭溶液復(fù)染1min；用水沖洗后用吸水紙吸干。 3. 用油鏡觀察,方法與步驟】（與革蘭染色的差別,實驗結(jié)果,結(jié)核桿菌呈紅色，常堆積成團(tuán)，排列無序，偶呈分枝狀生長。背景及非抗酸性細(xì)菌呈藍(lán)色,注意事項,1. 無菌操作 2. 染色時間要充分 3. 初染時掌握好加熱的溫度，勿沸騰、干涸 4. 初