巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng).ppt

1、巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng),報告人：彭平平,起源及背景,巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)表達系統(tǒng)是8O年代初被開發(fā)和研制的一種新型酵母表達系統(tǒng)。 30年前Koichi Ogata首次發(fā)現(xiàn)有些酵母可以利用甲醇為唯一的碳源和能源. 70年代Philips pertoleum公司就開發(fā)出高密度連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)畢赤酵母的工藝(細胞干重130g/L,80年代由Philips pertoleum公司合作開發(fā)畢赤酵母表達外源基因的研究。研究人員分離了醇氧化酶（AOX）的基因和啟動子，構(gòu)建了載體和菌株，開發(fā)了畢赤酵母基因操作的相關(guān)技術(shù)。 1993年P(guān)hilips pertoleum公司委托Invrti

2、gone公司代理畢赤酵母表達系統(tǒng)的產(chǎn)品,畢赤酵母與其它表達系統(tǒng)相比 有許多優(yōu)點 1、畢赤酵母是需氧酵母菌，在有氧條件下能高密度生長，因此有利于擴大生產(chǎn)獲得高濃度細胞，從而進行高效表達 2、通過質(zhì)粒整合到畢赤酵母基因組的外源基因結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不易丟失；且外源基因能以高拷貝數(shù)整合到畢赤酵母基因組中，能夠篩選到高表達菌株 3、畢赤酵母甲醇氧化酶(alcohol oxidase，AOX)基因的強啟動子特別適用于外源基因的調(diào)控表達,4、畢赤酵母自身分泌到培養(yǎng)基中蛋白很少，使得分 泌性的外源蛋白容易從培養(yǎng)基的基質(zhì)中分離 5、畢赤酵母對外源蛋白產(chǎn)物進行N一乙酰糖基化修飾的結(jié)構(gòu)為高甘露糖型，糖鏈平均為814個甘露

3、糖基，更接近于高等生物，且聚糖末端不含 1，3連接的甘露糖殘基(有強的免疫原性)，因而適用于臨床應(yīng)用 6、使用方便、簡單，而且成本較低,結(jié)構(gòu)特點,一、單細胞微生物 1、兼性厭氧菌，易于進行遺傳操作和培養(yǎng) 2、具有真核生物的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制，如蛋白酶加工、折疊、二硫鍵的形成和糖基化，可以獲得高產(chǎn)量的蛋白,二、微體（也稱過氧化物酶體） 1、 合成的蛋白質(zhì)貯存于微體中，可免受蛋白酶的降解，亦不會對細胞產(chǎn)生毒害 2、在微體中，有大量過氧化物酶合成，甲醇代謝的第一步就是在其中進行的，這樣可以避免甲醇在AOX催化下產(chǎn)的H202對細胞的毒害,醇氧化酶（AOX） 甲醇 AOX 甲醛 H2O2 微體 細胞,畢赤酵

4、母質(zhì)粒載體,幾個概念,同源基因重組 ：同源染 色體的非姐妹染色單體的 交叉互換引起的互換重組,穿梭質(zhì)粒：是指人工構(gòu)建的 具有兩種不同復(fù)制起點和選 擇標(biāo)記，可在兩種不同類群 宿主中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體,pPIC9k質(zhì)粒圖譜,AOX-醇氧化酶 S - 分泌信號 MCS 多克隆位點 TT-終止信號 HIS4-組氨醇脫氫酶 Kanamycin-抗卡拉霉素基因 pBR322-大腸桿菌的復(fù)制起始位點 Ampicillin-抗氨芐青霉素基因,外源蛋白的引入表達,菌株類型,Mut表型與甲醇利用率,選擇過程,HIS4缺陷培養(yǎng)基 G418酵母培養(yǎng)基 低 高 G418：是一種氨基糖苷類抗生素，Kanamycin抗性 基因能對抗G418對酵母的毒性,導(dǎo)入質(zhì)粒,發(fā)酵過程,一般分為三個階段： 成長期，該階段以甘油為碳源，主要目的是收獲一定的菌量，該階段一般采取分批補料的方式進行； 過渡期，隨成長期的結(jié)束酵母即進入過渡期，該期不加碳源，目的是消耗掉甘油，解除對AOX1啟動子阻遏； 誘導(dǎo)期，即當(dāng)甘油被消耗盡，過渡期結(jié)束時，在發(fā)酵液中流加甲醇誘導(dǎo)重組蛋白的表達,應(yīng)用舉例依森泰德（Exenatide）是首個合成腸促胰島素類似物，具有多種降血糖作用。HAS：人血清白蛋白,Exenatide,Twice a da