魔芋離體形態(tài)發(fā)生機(jī)制及其繁殖技術(shù)

1、魔芋離體形態(tài)發(fā)生機(jī)制及其繁殖技術(shù)魔芋（ Konjac ）是植物界中迄今發(fā)現(xiàn)唯一能大量合成葡苷聚糖（Konjacglucomannan）的高等植物，屬天南星科（Araceae）魔芋屬（ AmrophophallusBlume），為多年生草本植物， 廣泛分布于我國(guó)西南山區(qū)，具有悠久的栽培和利用歷史。魔芋葡甘聚糖是魔芋地下球莖主要貯藏物質(zhì)，為一種高分子量碳水化合物，因具有良好的膠溶性、 凝膠性、增稠性、成膜性及與其它植物膠的優(yōu)良復(fù)配性等優(yōu)點(diǎn)而在食品、化工、醫(yī)藥保健、環(huán)保等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。因此，魔芋具有極高的市場(chǎng)開(kāi)發(fā)和利用價(jià)值。魔芋為單葉柄支撐的單葉植物，通常利用球莖著生的根狀莖進(jìn)行無(wú)性繁殖，其繁

2、殖系數(shù)極低， 且多年沿用無(wú)性繁殖造成病原菌的積累、種性的退化，進(jìn)而導(dǎo)致魔芋產(chǎn)量下降、品質(zhì)劣化。由于缺乏穩(wěn)定的良種繁育體系， 種芋的數(shù)量和質(zhì)量已經(jīng)成為魔芋生產(chǎn)發(fā)展的瓶頸。自上個(gè)世紀(jì)80 年代以來(lái)，許多研究者試圖利用組織培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)脫毒試管苗，以繁殖種芋， 但試管苗因移栽成活率低且對(duì)田間管理技術(shù)要求較高，不能實(shí)現(xiàn)周年供應(yīng)和長(zhǎng)距離運(yùn)輸?shù)热秉c(diǎn)，無(wú)法在實(shí)際生產(chǎn)中廣泛運(yùn)用。二十世紀(jì) 90 年代以來(lái)，隨著對(duì)植物變態(tài)器官發(fā)育機(jī)理認(rèn)識(shí)的不斷深入，人們?cè)谠嚬苤幸殉晒φT導(dǎo)出了塊莖、球莖、鱗莖等營(yíng)養(yǎng)繁殖器官， 其中馬鈴薯試管塊莖生產(chǎn)體系最為成熟， 已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了工廠化生產(chǎn)， 但有關(guān)魔芋試管球莖的研究國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。 本

3、研究以花魔芋（ Arivieri）和白魔芋（Aalbus ）為材料，對(duì)魔芋試管球莖的形成及魔芋組織培養(yǎng)繁殖方式開(kāi)展了系列研究，主要結(jié)果如下：1幼嫩葉柄是魔芋組織培養(yǎng)較好的外植體，愈傷組織形成率高，狀態(tài)好。MS+1.0mg L NAA+1.0mgL BA 適宜于愈傷組織誘導(dǎo)，而MS+0.5 mgLNAA+0.5 mgL BA 有利于愈傷組織增殖。愈傷組織在繼代培養(yǎng)過(guò)程中可形成3種不同的類型，即：水漬狀，半透明；：淡黃色，結(jié)構(gòu)疏松；：淺紅或綠色，呈瘤狀或球狀，結(jié)構(gòu)致密。在分化培養(yǎng)基上， 型愈傷組織不能分化出芽，型可分化出不定芽， 而型可通過(guò)擬球莖再生完整植株。 這三種類型愈傷組織在特定的培養(yǎng)條件下

4、可相互轉(zhuǎn)化。組織學(xué)觀察顯示， 三種類型的愈傷組織其組成細(xì)胞類型明顯不同，其中型愈傷組織由保守分裂型細(xì)胞組成，其細(xì)胞中含有淀粉和葡甘聚糖顆粒，是一種半組織化結(jié)構(gòu)。中等濃度（1.0 2.0 mg L）的細(xì)胞分裂素（ BA、KT、 ZT 和 TDZ）與低濃度（ 0.1 1.0mg L）的 NAA配合均能促使型愈傷組織再生植株。2魔芋離體形態(tài)建成以器官發(fā)生途徑為主，擬球莖和芽發(fā)生是主要形式。組織學(xué)觀察顯示， 魔芋葉柄無(wú)維管組織形成層， 維管束外層薄壁在培養(yǎng)過(guò)程首先啟動(dòng)脫分化，進(jìn)而形成愈傷組織。魔芋形態(tài)建成以器官發(fā)生途徑為主，在特定培養(yǎng)條件下也可形成體細(xì)胞胚，但頻率極低，且絕大部分體胚因高度畸形化而不能

5、形成再生植株。魔芋可通過(guò)不定芽器官發(fā)生途徑或擬球莖器官發(fā)生途徑形成植株，通過(guò)擬球莖形成的植株不需生根培養(yǎng)就具有完整的根系， 而不定芽在發(fā)育過(guò)程中不能直接生根且植株生長(zhǎng)勢(shì)弱。不定芽和擬球莖均起源于型愈傷組織的次表皮細(xì)胞，這類細(xì)胞在分化過(guò)程中首先形成擬分生組織團(tuán)。 擬分生組織團(tuán)在分化培養(yǎng)中既可直接形成芽原基，進(jìn)而發(fā)生不定芽， 可形成一種中間的球狀體，這種球狀體具頂芽分生組織，葉原基不明顯，它可進(jìn)一步發(fā)育成擬球莖，進(jìn)而形成完整植株。3內(nèi)源 GA3含量增加伴隨著不定芽發(fā)生，而JA 含量增加伴隨著擬球莖發(fā)生， 內(nèi)源激素平衡是器官發(fā)生方式的關(guān)鍵調(diào)空因素。魔芋葉柄薄壁細(xì)胞在脫分化形成愈傷組織過(guò)程中，其內(nèi)源激

6、素（IAA、GA3、 ABA和JA）含量發(fā)生了明顯的變化。內(nèi)源 IAA 含量培養(yǎng)初期緩慢下降，10d 后快速上升， 30d 后達(dá)到平穩(wěn)。內(nèi)源ABA含量在培養(yǎng) 20d 內(nèi)呈下降趨勢(shì)，之后迅速上升。內(nèi)源 GA3和 JA 含量則在整個(gè)愈傷組織誘導(dǎo)過(guò)程中迅速下降。研究發(fā)現(xiàn)，三種內(nèi)源激素（ GA3、ABA和 JA）在形成芽和擬球莖的愈傷組織中含量變化明顯不同。內(nèi)源 GA3水平在擬球莖發(fā)生過(guò)程中變動(dòng)不大，而在不定芽發(fā)生過(guò)程中快速上升， 其絕對(duì)含量也比前者高； 內(nèi)源 ABA在擬球莖發(fā)生過(guò)程中基本維持穩(wěn)定，而在不定芽發(fā)生過(guò)程中則迅速下降；內(nèi)源JA 含量在擬球莖形成過(guò)程中呈明顯上升趨勢(shì)， 而在不定芽發(fā)生過(guò)程中變

7、化不明顯。只有內(nèi)源 IAA 無(wú)論是擬球莖還是不定芽形成過(guò)程其含量均呈下降趨勢(shì)。內(nèi)源 GA3與 ABA和 JA 的平衡水平在兩種不同器官發(fā)生途徑中呈現(xiàn)出明顯的差異，但GA3JA 差異最為顯著，在兩種器官發(fā)生途徑中其變化趨勢(shì)完全相反。 上述結(jié)果說(shuō)明， 魔芋離體器官發(fā)生形式與內(nèi)源激素變化及平衡水平相關(guān)。4魔芋試管球莖（即擬球莖）的形成受培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的影響。中等濃度的 BA（1.0 2.0 mgL）與低濃度的 NAA（0.1 0.5 mgL）配合有利于型愈傷組織形成試管球莖，其中以MS+2.0 mgL BA+0.5 mg L NAA表現(xiàn)最佳。在一定范圍內(nèi)提高培養(yǎng)基中蔗糖濃度有利于白魔芋試管球莖形成

8、，其中 6（ w v）蔗糖效果最好。而花魔芋試管球莖形成所要求的蔗糖濃度較低（4）。光周期對(duì)試管球莖的發(fā)生影響不明顯，而培養(yǎng)溫度的影響則較大， 22條件下，花魔芋和白魔芋試管球莖形成率、形成個(gè)數(shù)和單球莖鮮重均達(dá)最大值。試管球莖在培養(yǎng)過(guò)程可產(chǎn)生次級(jí)小球莖以進(jìn)行增殖，但自然增殖率較低， 通過(guò)損傷主芽方法打破主芽頂端優(yōu)勢(shì)，可促使次級(jí)小球莖的發(fā)生。5選擇性培養(yǎng)魔芋愈傷組織有助于降低再生植株遺傳變異頻率。對(duì)魔芋型愈傷組織進(jìn)行選擇并于適宜培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，棄除狀態(tài)發(fā)生改變的愈傷組織類型，獲得不同培養(yǎng)時(shí)期的4 個(gè)再生植株群體G0（初代培養(yǎng)產(chǎn)生）、G2（繼代 3次產(chǎn)生）、G4（繼代 5 次產(chǎn)生）和 G7（繼代

9、 8 次產(chǎn)生）。經(jīng)兩種分子標(biāo)記技術(shù)（RAPD和 ISSR）分析顯示，G0群體變異頻率最高（ RAPD：15.6 ； ISSR： 18.0 ），G2、G4和 G7的變異頻率依次下降。四個(gè)群體中，G0再生植株的 RAPD差異位點(diǎn)數(shù)最多，而其它三個(gè)群體的植株差異位點(diǎn)數(shù)較少。ISSR技術(shù)檢測(cè)的差異位點(diǎn)數(shù)比RAPD技術(shù)檢測(cè)到的要高， 但在四個(gè)群體中分布差異不明顯。 上述結(jié)果表明， 通過(guò)對(duì)型愈傷組織選擇性培養(yǎng)不會(huì)導(dǎo)致變異頻率增加，魔芋組織培養(yǎng)中的不穩(wěn)定性主要發(fā)生于基因組中重復(fù)區(qū)域，造成植株性狀改變的可能性較小。6試管球莖是建立魔芋繁殖體系的適宜方式，魔芋試管球莖田間生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)比試管苗明顯。 將魔芋試管球莖和試管苗進(jìn)行田間種植，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，試管