第三章基因工程常用技術(shù)

1、第三章 基因工程常用技術(shù),一、質(zhì)粒DNA的提取 二、核酸凝膠電泳技術(shù) 三、核酸分子雜交技術(shù) 四、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù) 五、DNA序列分析技術(shù),質(zhì)粒DNA的提取是基因工程操作中最基本的技術(shù)，最常用的是堿裂解法。,一、質(zhì)粒DNA的提取,在強(qiáng)堿性溶液中，DNA雙鏈的氫鍵斷裂變性；當(dāng)溶液恢復(fù)中性時(shí)，DNA雙鏈復(fù)性。,（一）堿裂解法提取質(zhì)粒DNA,1、原理,4,共價(jià)閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA：,5,線性染色體DNA：,2、堿裂解法質(zhì)粒DNA提取的步驟,1）溶菌,7,葡萄糖：,增加溶液粘度，維持滲透壓，防止DNA受機(jī)械力的作用而降解（震蕩）。,EDTA：,Mg2+、Ca2+螯合劑，抑制DNase活性，防止

2、DNA被降解。,8,溶菌酶：,為糖苷水解酶，能水解菌體細(xì)胞壁的主要化學(xué)成分-肽聚糖中的-1,4糖苷鍵，具有溶菌作用 。,2）變性,10,NaOH：,是強(qiáng)堿，提供pH12的堿性條件，使DNA雙鏈變性。,是離子型表面活性劑，溶解細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)蛋白，并結(jié)合成“蛋白質(zhì)-SDS”復(fù)合物，使蛋白質(zhì)（包括DNase）變性沉淀。,SDS：,11,3）中和,12,KAc：,用冰HAc把KAc溶液的pH調(diào)到4.8，以中和NaOH變性液，使DNA復(fù)性。,高濃度KAc有利于變性的大分子染色體DNA、RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物沉淀。,冰HAc ：,13,上清液中含有質(zhì)粒DNA。,4）離心去除沉淀,5）純化DNA,酚-

3、氯仿-異戊醇（25: 24: 1）抽提或柱層析。,15,酚：,比重大，能加速有機(jī)相與水相分層，減少殘留在水相中的酚。,蛋白變性劑，進(jìn)一步抽提DNA溶液中的蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)沉淀。,防止抽提時(shí)振蕩起泡。,氯仿：,異戊醇：,16,2倍體積的無(wú)水乙醇沉淀DNA。,6）沉淀DNA,DNA分子以水合狀態(tài)“溶于”水里，乙醇能奪去DNA分子的水環(huán)境。,17,70%乙醇洗滌DNA，干燥。,7）洗滌,8）貯存 用含RNaseA(20g/ml)的TE溶解DNA，貯存于-20。,18,TE：,由Tris-HCl緩沖液和EDTA配制。,EDTA抑制DNase，防止DNA被酶降解。,Tris-HCl不含金屬離子（不同于磷

4、酸或硼酸緩沖液），利于后續(xù)操作。,RNaseA：,降解殘留的RNA。,許多公司研制出商品化質(zhì)粒提取試劑盒，原理大多依照堿裂解法，但在純化步驟上采用柱層析。,20,3、影響質(zhì)粒DNA產(chǎn)量的因素,質(zhì)粒的產(chǎn)量受提取過(guò)程中各因素的影響，但最重要的是菌株的遺傳背景和質(zhì)粒自身的拷貝數(shù)。,一般使用endA基因突變的E.coli菌株，如DH5、JM109等。,1）受體菌株,endA基因編碼核酸內(nèi)切酶I，在Mg2+存在下，可將雙鏈DNA消化為7bp的寡核苷酸片斷。,22,常用質(zhì)粒的理論產(chǎn)量,質(zhì)粒 分子大小 拷貝數(shù) 質(zhì)粒產(chǎn)量 （kb） （g/ml）,（二）DNA的定量和純度測(cè)定,1、紫外光譜法,原理：基于DNA在

5、260nm波長(zhǎng)處有特異的紫外吸收峰（蛋白質(zhì)在280nm處有吸收峰），用微量比色杯在紫外分光光度計(jì)直接測(cè)定。,在波長(zhǎng)260nm紫外光下，1OD值的吸光度相當(dāng)于雙鏈DNA濃度為50g/ml。,26,純DNA樣品：OD260/OD280 =1.8 OD260/OD230 2.0,OD260/OD230 2.0：有殘存的鹽和小分子雜質(zhì)， 如核苷酸、氨基酸、酚等。,OD260/OD280 1.6：有蛋白質(zhì)污染；,OD260/OD280 1.9：有RNA污染；,27,原理：利用溴化乙錠(EB)能插入DNA分子中，在紫外光照射下能發(fā)紅色熒光，將其熒光強(qiáng)度與已知濃度的DNA(如DNA marker)電泳條帶對(duì)

6、比，可估算出DNA含量。,2、瓊脂糖凝膠電泳估計(jì),（三）DNA分子量的估計(jì),通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳，與已知分子量的DNA marker對(duì)比得知。,二、核酸凝膠電泳技術(shù),（一）電泳的基本原理,生物大分子在一定pH條件下，通常帶電荷，將其置于電場(chǎng)中，會(huì)以一定的速度向與其電荷性質(zhì)相反的電極遷移，遷移速度稱電泳速率。,30,摩擦系數(shù)與分子的大小、構(gòu)型及介質(zhì)的粘度有關(guān)。,電泳速率與電場(chǎng)強(qiáng)度、分子所帶的凈電荷數(shù)成正比，與分子與介質(zhì)的摩擦系數(shù)成反比。,在生理?xiàng)l件下，DNA分子糖-磷酸骨架中的磷酸基團(tuán)呈離子化狀態(tài)，故DNA實(shí)際上呈多聚陰離子狀態(tài)，在電場(chǎng)中向 方向遷移。,糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上重復(fù)，故等量的雙鏈DNA

7、幾乎帶等量的凈電荷。,正極,32,如電場(chǎng)強(qiáng)度一定、電泳介質(zhì)相同，電泳速率就取決于核酸分子的大小和構(gòu)型。,構(gòu)型相似的分子：分子量越大、遷移越慢。,分子量相同的分子(如質(zhì)粒)： cccDNA遷移最快、L-DNA次之、ocDNA最慢。,33,固體支持介質(zhì)：,瓊脂糖(agarose) 聚丙烯酰胺(polyarylamide),固體支持介質(zhì)可形成復(fù)雜的網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)，DNA穿過(guò)這些網(wǎng)孔才能到達(dá)正極。,分子量小、結(jié)構(gòu)致密的DNA分子更易穿過(guò)網(wǎng)孔，泳動(dòng)速度也越快。,（二）瓊脂糖凝膠電泳,是一種線性多糖聚合物，從紅色海藻產(chǎn)物瓊脂中提取而來(lái)。,瓊脂糖：,37,瓊脂糖凝膠：,瓊脂糖在電泳液中加熱到沸點(diǎn)后溶解，冷卻后凝固

8、成均勻的膠體“胨”，成為很好的電泳介質(zhì)。,38,瓊脂糖濃度(%) 分離DNA的范圍(kb),0.3 5-60 0.6 1-20 0.7 0.8-10 0.9 0.5-7 1.2 0.4-6 1.5 0.2-4 2.0 0.1-3,瓊脂糖濃度的高低決定凝膠孔隙的大小，濃度越高、孔隙越小、分辨率越高。,（三）聚丙烯酰胺凝膠電泳,聚丙烯酰胺：,由丙烯酰胺和N,N-甲叉雙丙烯酰胺聚合而成。,40,在過(guò)硫酸銨和TEMED存在時(shí)，丙烯酰胺單體形成長(zhǎng)鏈，由N,N-甲叉雙丙烯酰胺的雙功能基團(tuán)和鏈末端的自由基團(tuán)反應(yīng)而發(fā)生交聯(lián)，形成聚丙烯酰胺。,為中樞神經(jīng)毒物，盡量避免接觸和吸入!,過(guò)硫酸銨：,催化過(guò)硫酸銨產(chǎn)生自

9、由基，加速聚合。,丙烯酰胺和N,N-甲叉雙丙烯酰胺：,堿性條件下產(chǎn)生自由基。,TEMED(N,N,N,N-四甲基乙二銨)：,42,聚丙烯酰胺濃度(%) 分離DNA的范圍(bp),3.5 1000-2000 5.0 85-500 8.0 60-400 12.0 40-200 15.0 25-150 20.0 6-100,聚丙烯酰胺濃度的高低決定凝膠孔隙的大小，濃度越高、孔隙越小、分辨率越高。,43,0.3-2%瓊脂糖凝膠電泳分辨率：60,000-100bp；,3.5-20%聚丙烯酰胺凝膠電泳分辨率：2,000-6bp。,44,（四）電泳緩沖液,Tris-乙酸（TAE） Tris-硼酸（TBE）

10、Tris-磷酸（TPE）,TAE價(jià)格便宜，但緩沖容量低； TBE與TPE緩沖容量高，分離效果好，但TPE在DNA片段回收時(shí)含磷酸鹽濃度高，易使DNA沉淀。,45,EDTA可螯合二價(jià)陽(yáng)離子，抑制DNase活性，防止DNA被降解。,臨用時(shí)用水稀至0.5TBE（20倍稀釋）,10TBE緩沖液的配制： Tris堿 108g 硼酸Boric acid 55g EDTA 9.3g 加H2O至 1L（調(diào)PH為8.0-8.2）,46,（五）核酸電泳的指示劑與染色劑,1、指示劑：,常用溴酚蘭，在堿性液體中呈紫蘭色，在0.6%、1%、1.4%和2%瓊脂糖凝膠電泳中，遷移率分別與1kb、0.6kb、0.2kb和0.

11、15kb的雙鏈線性DNA片段大致相同。,47,使樣品呈色，便于加樣操作；,指示劑與蔗糖、甘油組成加樣緩沖液。,增加樣品比重，確保DNA均勻沉入加樣孔；,在電泳中形成肉眼可見(jiàn)的指示帶，可預(yù)測(cè)DNA電泳的速度和位置。,48,49,2、染色劑：,核酸電泳后，需經(jīng)染色才能顯出帶型。,溴化乙錠染色法 銀染色法,50,溴化乙錠(ethidium bromide, EB)能插入到DNA分子的相鄰堿基之間，并在300nm波長(zhǎng)的紫外光照射下發(fā)出紅色熒光。,1）溴化乙錠染色法：,51,可將EB直接加到凝膠介質(zhì)中（終濃度0.5g/ml）；也可在電泳后，將凝膠浸入該濃度的溶液中染色10-15min。,EB與DNA分子

12、結(jié)合，而不與凝膠結(jié)合，DNA分子吸收EB并發(fā)出熒光。,52,瓊脂糖凝膠EB染色后，在紫外光下觀察，可檢測(cè)出50ng的DNA。,在適當(dāng)染色條件下，熒光強(qiáng)度與DNA片段的數(shù)量成正比。,53,2、銀染色法：,Ag+可與核酸形成穩(wěn)定的復(fù)合物，用還原劑(如甲醛)使Ag+還原成銀顆粒，可將電泳條帶染成黑褐色，用于聚丙烯酰胺凝膠染色。,優(yōu)點(diǎn)：靈敏度比EB高200倍。,缺點(diǎn)：銀染色后，DNA不宜回收。,聚丙烯酰胺凝膠電泳的銀染結(jié)果,銀染10min,銀染15min,三、核酸分子雜交技術(shù),1968年，華盛頓卡內(nèi)基學(xué)院的Roy Britten及其同事發(fā)明。,依據(jù)：堿基互補(bǔ)、變性和復(fù)性,隨溫度逐漸降低，變性的兩條單鏈

13、重新 形成互補(bǔ)雙鏈。,在高溫下，核酸雙鏈解為兩條單鏈；,利用核酸雙鏈的堿基互補(bǔ)、變性和復(fù)性的原理，用已知堿基序列的單鏈核酸片段作為探針(probe)，與待測(cè)樣本中的單鏈核酸互補(bǔ)配對(duì)，以判斷有無(wú)互補(bǔ)同源核酸序列的存在。,（一）核酸探針,指一段帶有檢測(cè)標(biāo)記、與目的DNA片段特異互補(bǔ)、已知序列的核酸片段。,探針長(zhǎng)度一般以50-300bp為宜。,核酸探針的種類：,放射性探針 非放射性探針,寡核苷酸探針(oligonucleotide probe),根據(jù)生物體對(duì)簡(jiǎn)并密碼子的偏愛(ài)性，合成系列探針；,簡(jiǎn)并探針的設(shè)計(jì)依據(jù)：,參考生物體EST(expressed sequence tag)數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行傾向性簡(jiǎn)并

14、序列設(shè)計(jì)。,EST：對(duì)一個(gè)隨機(jī)選擇的cDNA克隆，進(jìn)行5端和3端單一次測(cè)序，獲得的cDNA部分序列，代表一個(gè)完整基因的一小部分，平均長(zhǎng)度360120 bp。,寡核酸探針的優(yōu)點(diǎn)：,序列短，雜交速度快、特異性強(qiáng)；,可在短時(shí)間內(nèi)大量制備；,可在合成中進(jìn)行標(biāo)記；,可合成單鏈探針，避免雙鏈探針在雜交中自我復(fù)性，提高雜交效率；,可檢測(cè)靶序列內(nèi)1個(gè)堿基的變化。,寡核苷酸探針的設(shè)計(jì)原則：,長(zhǎng)度18-50bp；,G+C含量40-60%；,避免同一堿基連續(xù)出現(xiàn)（不能多于4個(gè)） ；,與非靶序列70%以上同源性、或連續(xù)8個(gè)以上堿基序列相同，最好不用。,64,1、標(biāo)記物的種類：,前者更敏感，但后者保存時(shí)間較長(zhǎng)，無(wú)同位素

15、污染。,非放射性：生物素、地高辛、熒光素等。,放射性：32P、35S、125I等；,（二）核酸探針的標(biāo)記,缺刻平移法 隨機(jī)引物延伸法 反轉(zhuǎn)錄標(biāo)記法 末端標(biāo)記法,2、探針標(biāo)記方法：,1）放射性同位素標(biāo)記：,1）Klenow酶介導(dǎo)的3末端標(biāo)記法：,末端標(biāo)記法,67,2）TdT介導(dǎo)的3末端標(biāo)記法：,3）T4-PNP介導(dǎo)的5末端標(biāo)記法：,69,2）非放射性同位素標(biāo)記：,酶促反應(yīng)標(biāo)記法 化學(xué)修飾標(biāo)記法,將標(biāo)記物預(yù)先標(biāo)記在核苷酸分子上，再利用酶促反應(yīng)，將標(biāo)記的核苷酸摻入探針中。,酶促反應(yīng)標(biāo)記法,1）標(biāo)記物-dUTP的生成； （如Bio-11-dUTP、Dig-11-dUTP）,71,Bio-11-dUTP

16、：,生物素(Biotin),Biotin與dUTP之間連接臂的碳鏈長(zhǎng)度。,11：,Bio：,廣泛存在于各種組織中，若樣品本身含內(nèi)源性生物素，會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生干擾。,72,Dig-11-dUTP：,地高辛(digoxigenin)；,Dig：,洋地黃植物的花和葉是Dig在自然界中的唯一來(lái)源，抗Dig抗體不會(huì)與其他生物物質(zhì)結(jié)合，可滿足特異性標(biāo)記的需要。,從洋地黃植物中提取的類固醇物質(zhì)。,地高辛系統(tǒng)標(biāo)記：,化學(xué)修飾標(biāo)記法,利用標(biāo)記物分子上的活性基團(tuán)與探針?lè)肿由系幕鶊F(tuán)發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)，將標(biāo)記物直接結(jié)合到探針?lè)肿由稀?ABC熒光標(biāo)記：,ABC：Avidin Biotin Complex,ABC顯色酶標(biāo)記：,A

17、BC：Avidin Biotin Complex,（三）核酸分子雜交的分類,待測(cè)核酸樣本先結(jié)合到固相支持物（硝硝酸纖維素膜、尼龍膜等）上，再與溶液中的特異性探針進(jìn)行雜交反應(yīng)。,待測(cè)核酸樣本與特異性探針同時(shí)溶于雜交液中進(jìn)行雜交反應(yīng)。,液相雜交：,固相雜交：,液相核酸分子雜交,固相核酸分子雜交,預(yù)雜交：消除膜對(duì)探針的非特異性結(jié)合，降低雜交背景。,Southern印跡雜交 Northern印跡雜交 斑點(diǎn)雜交/狹縫雜交 菌落雜交 夾心雜交 原位雜交,常用固相核酸雜交方法,1、Southern印跡雜交,是將DNA分子從電泳凝膠轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，進(jìn)行核酸雜交的一種實(shí)驗(yàn)方法。 1975年，由英國(guó)愛(ài)丁堡大

18、學(xué)的Edwen Southern創(chuàng)建，故稱Southern blot。,提取DNA樣本限制酶酶切瓊脂糖凝膠電泳分離NaOH變性DNA轉(zhuǎn)印至膜上預(yù)雜交標(biāo)記探針與之雜交放射自顯影或顯色反應(yīng)檢測(cè)雜交信號(hào)結(jié)果分析。,Southern blot的基本過(guò)程：,用DNA（或RNA）探針檢測(cè)DNA樣品。,83,水稻葉綠體DNA分別用Bgl II(A-C)、BamH I(D-F)、EcoR I(G-I)、Hind III(J-L)消化，瓊脂糖凝膠電泳分離，然后與32P標(biāo)記的玉米psbA探針Southern雜交，X光底片中顯現(xiàn)陽(yáng)性條帶，表明含玉米psbA基因序列。,2、Northern印跡雜交,1979年，J.C

19、.Alwine等人發(fā)展而來(lái)，是將RNA分子從電泳凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，進(jìn)行核酸雜交的一種實(shí)驗(yàn)方法。 方法與Southern blot類似，故稱Northern印跡雜交（ Northern blot）。,提取RNA樣本RNA變性瓊脂糖凝膠電泳分離轉(zhuǎn)印至膜上預(yù)雜交標(biāo)記探針與之雜交放射自顯影或顯色反應(yīng)檢測(cè)雜交信號(hào)結(jié)果分析。,Northern blotting的基本過(guò)程：,用DNA（或RNA）探針檢測(cè)RNA樣品。,87,3、斑點(diǎn)雜交/狹縫雜交 （spot/slot blot hybridization）,基本過(guò)程： 將變性的DNA或RNA直接點(diǎn)到膜上，或通過(guò)一個(gè)長(zhǎng)形狹縫轉(zhuǎn)印至膜上膜變性預(yù)雜交標(biāo)記探

20、針與之雜交放射自顯影或顯色反應(yīng)檢測(cè)雜交信號(hào)結(jié)果分析。,DNA樣品,90,簡(jiǎn)便、快速、靈敏、樣本用量少。,特異性不高，有一定比例的假陽(yáng)性。,優(yōu)點(diǎn)：,缺點(diǎn)：,需兩個(gè)靠近且不重疊的探針，一個(gè)作固相吸附探針，另一個(gè)作標(biāo)記檢測(cè)探針。,4、夾心雜交(sanwich hybridization),優(yōu)點(diǎn)：,樣品不需固定，對(duì)粗制樣品即能做出可靠的檢測(cè)。,特異性強(qiáng)，只有兩個(gè)探針都雜交時(shí)，才能產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)；,93,注意：,為避免產(chǎn)生高本底信號(hào)，兩探針必須分別克隆入兩個(gè)非同源載體內(nèi)，如一個(gè)克隆入PUC19，另一克隆入pBR322。,5、菌落雜交(colony hybridization),基本過(guò)程： 將菌落從平板

21、轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上裂解菌落、釋放DNA將DNA烘干固定于膜上標(biāo)記的探針與之雜交放射自顯影檢測(cè)雜交信號(hào)與平板上的菌落對(duì)位。,用于從大量菌落中篩選含特異DNA序列的目的重組子。,6、原位雜交(in situ hybridization, ISH),是一種可在細(xì)胞涂片、組織切片以及分裂中期染色體帶中檢測(cè)DNA或RNA的技術(shù)，可對(duì)組織細(xì)胞原位的待測(cè)核酸分子進(jìn)行定性、定量及定位分析。,97,優(yōu)點(diǎn)： 不需提取核酸，可完整保持組織或細(xì)胞的形態(tài)，更準(zhǔn)確地反映組織細(xì)胞的功能狀態(tài)。,FISH檢測(cè)HER-2基因在 乳腺癌組織中的表達(dá),FISH檢測(cè)慢性粒細(xì)胞白血病的 費(fèi)城染色體(22和9號(hào)染色體異位),是利用耐熱D

22、NA聚合酶的反復(fù)作用，通過(guò)變性-退火-延伸的循環(huán)操作，在體外迅速將DNA模板擴(kuò)增數(shù)百萬(wàn)倍的一種操作技術(shù)。,四、聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù) （polymerase chain reaction, PCR）,1、模板:,（一）PCR反應(yīng)系統(tǒng)的組成,無(wú)論哪種DNA，都要有較高的純度。,可以是DNA或RNA。,mRNA cDNA PCR，稱為RT-PCR。,逆轉(zhuǎn)錄,RNA作為模板時(shí)，需要：,RT-PCR：Reverse Transcription PCR,2、Taq DNA聚合酶,引物設(shè)計(jì)的原則：,長(zhǎng)度適宜，一般15-30bp；,G+C含量40-60；,4種堿基應(yīng)隨機(jī)分布；,內(nèi)部不應(yīng)存在互補(bǔ)序列；,兩條引物之間

23、不應(yīng)有多于4個(gè)堿基的互補(bǔ)；,3端不應(yīng)有任何修飾；,5端可修飾，如32P、生物素、熒光素。,上游引物5端： 起始密碼子ATG；,注意：,下游引物5端： 終止密碼子TAA、TAG或TGA；,上、下游引物5端： 限制酶識(shí)別序列及其保護(hù)堿基。,104,5 GGAATTCCCTATGACCCAG 3,不同限制酶需保護(hù)堿基的數(shù)量不同，如： EcoR I 1 Hind III 3 BamH I 2-3 Pst I 4,保護(hù)堿基數(shù)量不合適，會(huì)影響限制酶酶切。,保護(hù)堿基,4、dNTPs,終濃度：50mol/L，4種dNTPs濃度應(yīng)相等。,注意：不穩(wěn)定，保存時(shí)間長(zhǎng)會(huì)失效.,1）不同的酶需不同Mg2+：,5、Mg2

24、+：,107,EDTA鰲合Mg2+； 選擇低濃度TE(10mM Tris, 1mM EDTA)；,如擴(kuò)增效率不理想，注意調(diào)整Mg2+濃度！,2）外界影響：,DNA模板、引物、dNTPs的磷酸基團(tuán)均可結(jié)合Mg2+。,模板DNA 0.1-2 g 引物 各10-100 pmol Taq酶 2.5 U 4種dNTP混合物 各200 mol/L Mg2+ 1.5 mmol/L ddH2O,標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系：,100 L,1、變性溫度：,（二）PCR參數(shù),94-95，一般30-45 sec。,模板DNA完全變性對(duì)RCR能否成功至關(guān)重要。,可95加熱3-5min預(yù)變性。,110,2、退火溫度：,退火溫度