實驗二-孚爾根核染色.ppt

1、醫(yī) 學 遺 傳 學 實 驗,實驗2 洋蔥根尖孚爾根染色法,實驗目的 實驗原理 實驗方法 注意事項 實驗作業(yè) 思考問題,實驗目的,掌握孚爾根核染色的方法。 了解孚爾根染色的原理。,實驗原理,Na2S2O3+ HCl亞硫酸根 亞硫酸根+堿性品紅無色的亞硫酸品紅Schiff試劑 DNA在60，1mol/L HCl作用下，核酸中的嘌呤堿很快完全除掉，脫氧核糖中潛在的的醛基獲得自由狀態(tài)，水解條件下形成半縮醛羥基，與Schiff試劑反應，形成紫紅色化合物。,孚爾根核染色法是Feulgen和Rossonbek于1924年提出的鑒定細胞中DNA的組織化學方法。其優(yōu)點是制片清潔、染色體清晰、組織軟化好，易于壓片

2、。但對小型染色體（如玉米、水稻）效果較差。,實驗方法,水洗：把已經固定好的洋蔥根尖用50乙醇和清水分別沖洗, 再把它放入室溫的1mol/L HCl中處理2-3min。 將根尖換入60預熱的HCl，置于恒溫水浴中，在600.5的條件下水解10min。 吸出熱HCl，換入室溫1mol/L HCl再處理2min，然后水洗2-3次。 吸凈水分，加入Schiff試劑，蓋上蓋子，黑暗條件下染色30min或過夜。,小心倒出Schiff試劑,然后用漂洗液洗3次。 漂洗液配置方法：取10ml10 %亞硫酸氫鈉母液，加200ml蒸餾水，再加10ml1NHCL，即成漂洗液，使用前配置。 蒸餾水漂洗后取根尖置于載玻片

3、上，只保留分生區(qū)，再加一滴45%的醋酸，壓片鏡檢。,固定與固定液,固定：將新鮮的活組織從生物體取下后，立即投入固定劑中，借助化學藥品的作用，使細胞保持原有形態(tài)結構的一種手段。,固定的目的,迅速防止細胞的死后變化，防止自溶、腐敗，盡量保持生長狀態(tài)結構。 使細胞中的蛋白質、脂肪、糖、酶等成分轉變?yōu)椴蝗苄晕镔|，以保持生前狀態(tài)。 使組織內各種物質成分產生不同的折射率，便于鑒定、觀察。 使不同組織成分對染料有不同的親和力，便于染色。 防止細胞過度收縮或膨脹，失去原有的形態(tài)結構。,預處理的目的及方法,目的：改變細胞質粘度，破壞和抑制紡錘體的形成，使染色體適度縮短和分散。 方法： 0.04-0.2%秋水仙素

4、溶液2-4小時。 對二氯苯飽和溶液3-5小時。 0.002M (或0.03%)8-羥基喹啉1.5-2小時以上，室溫。 低溫：1-4處理24小時。,HE XI UNIVERSITY,根冠,分生區(qū),伸長區(qū),成熟區(qū),根尖形態(tài)與結構,注意事項,Schiff試劑小心取放，及時清洗吸取Schiff試劑的吸管。 黑暗條件下染色。,實驗作業(yè),繪制你所觀察到的圖象，并說明是有絲分裂的哪一個時期，并注明放大倍數。,前期、中期、后期、末期,為什么要嚴格掌握DNA的水解條件？,溫度過低，時間過短：則DNA的水解不夠徹底，醛基暴露不充分，染色會過淺。 溫度過高，時間過長：則DNA過度水解，游離的核苷酸會漂移到細胞質中，造成染色淺或不均一 。,材料從60的鹽酸倒出后溫度還相當高，如果直接轉入Schiff試劑中，則會使Schiff試劑發(fā)生分解影響效果。所以我們首先要把材料轉入室溫的鹽酸溶液中，做一個緩沖以避免Schiff 試劑分解。,為什么要在實驗材料從60鹽酸中倒出后，再放入室溫的鹽酸中呢？,為什么RN