水解酶的催化多功能性及其串聯(lián)方法的研究碩士學(xué)位論文1

1、碩 士 學(xué) 位 論 文論文題目: 水解酶的催化多功能性及其串聯(lián)方法的研究作者姓名 陳 香 指導(dǎo)教師 林 賢 福 教 授 學(xué)科(專業(yè)) 應(yīng) 用 化 學(xué) 所在學(xué)院 理 學(xué) 院 提交日期 2011 年 1 月 碩士學(xué)位論文水解酶的催化多功能性及其串聯(lián)方法的研究作 者： 陳 香導(dǎo) 師：林賢福 教授二一一年一月中國(guó) 杭州m. s. dissertationstudy on the catalytic promiscuity of hydrolase and tandem reaction author: xiang chenadvisor: prof. xianfu lin chemistry depa

2、rtment, zhejiang universityjan 2011hangzhou china附件3：獨(dú)創(chuàng)性聲明與版權(quán)使用授權(quán)書(shū)獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的研究成果，也不包含為獲得 浙江大學(xué) 或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書(shū)而使用過(guò)的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說(shuō)明并表示謝意。 學(xué)位論文作者簽名： 簽字日期： 學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書(shū) 本學(xué)位論文作者完全了解 浙江大學(xué) 有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，有權(quán)保留并向國(guó)家有關(guān)部門(mén)

3、或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤(pán)，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán) 浙江大學(xué) 可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。 （保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)書(shū)） 學(xué)位論文作者簽名： 導(dǎo)師簽名： 簽字日期： 簽字日期： 學(xué)位論文作者畢業(yè)后去向： 工作單位： 電話： 通訊地址： 郵編：摘要酶催化有機(jī)合成方法的研究越來(lái)越受化學(xué)家關(guān)注，探索酶催化的新功能，調(diào)控酶促反應(yīng)，通過(guò)酶催化多功能性來(lái)設(shè)計(jì)串聯(lián)反應(yīng)新方法新途徑；為化學(xué)的綠色合成提供更有價(jià)值的新思路、新技術(shù)。論文研究了脂肪酶催化friedel-crafts烷基化反應(yīng)的新功能，考察了反應(yīng)條件，

4、包括反應(yīng)時(shí)間、酶源、溶劑、底物的比例、酶濃度、溫度、底物結(jié)構(gòu)對(duì)脂肪酶催化friedel-crafts烷基化反應(yīng)的影響，合成了15種吲哚衍生物。并通過(guò)無(wú)酶，bsa及失活的ppl來(lái)驗(yàn)證酶活性中心的催化作用，提出了可能的催化機(jī)理。論文研究了脂肪酶催化的親核加成-消去-michael加成串聯(lián)反應(yīng)的新功能，考察了酶源、反應(yīng)介質(zhì)、混合溶劑的比例、酶濃度、溫度、反應(yīng)時(shí)間、底物結(jié)構(gòu)對(duì)脂肪酶催化該串聯(lián)反應(yīng)的影響，結(jié)果表明：在水與二氧六環(huán)比例為4/1的混合溶劑中，脂肪酶ppl可以催化醛與吲哚的串聯(lián)反應(yīng)，合成了26種雙分子吲哚衍生物。論文研究了n-雜環(huán)化合物添加對(duì)酶促反應(yīng)的調(diào)控作用。發(fā)現(xiàn)當(dāng)酶與咪唑質(zhì)量比為2/1時(shí)，

5、酰化酶的催化claisen-schmidt活性顯著提高。并通過(guò)無(wú)酶無(wú)咪唑、bsa和咪唑、單酶及單咪唑催化來(lái)證實(shí)酶活性中心和咪唑的共同的催化作用，提出了可能的催化機(jī)理。同時(shí)考察了酶源、溶劑、添加劑、反應(yīng)時(shí)間、底物結(jié)構(gòu)對(duì)?；概c咪唑催化反應(yīng)的影響；并合成了18種, -不飽和羰基化合物。論文通過(guò)調(diào)控?；概c咪唑共同催化催化芳香醛與酮的aldol縮合-消去-michael加成-分子內(nèi)aldol縮合-消去串聯(lián)反應(yīng)活性，合成了15種新穎的環(huán)己烯酮衍生物?？疾炝朔磻?yīng)條件：酶源、溶劑、添加劑、酶與添加劑的比例、底物結(jié)構(gòu)對(duì)?；概c咪唑催化串聯(lián)aldol縮合-消去-michael加成-分子內(nèi)aldol縮合-消去反

6、應(yīng)的影響，并提出了可能的反應(yīng)機(jī)理。本論文總共合成了74種化合物，產(chǎn)物經(jīng)ir，1h-nmr, 13c-nmr，gc-ms，hrms等手段表征分析和驗(yàn)證。關(guān)鍵詞：脂肪酶、?；?、串聯(lián)反應(yīng)、多功能性、共同催化。abstractenzyme catalysis in organic synthesis had drawn an increasing number of chemists attention. explore new function of enzymes; regulate enzymatic reaction; design a new tandem reaction base on

7、 the promiscuity of enzym, providing more valuable, new ideas and new technologies for green chemistry.lipase was firstly found to catalyze the friedel-craft reaction in water. after screening the reaction time, enzyme sources, reaction media, the molar ratio of substrate, temperature and the struct

8、ure of substrates, lipase from porcine pancreas, type ii (ppl) catalyzed the friedel-craft reaction of indole derivative and , -unsaturated compounds. 15 fridel-craft adducts were synthesized. the control experiments proved that the active site of ppl were responsible for those enzymatic reaction. t

9、he mechanisms for the friedel-craft reaction and tandem reaction catalyzed by ppl were also proposed.we screening the ppl catalyze the tandem nucleophilic addition/dehydration /michael addition of aldehyde and indole. the enzyme sources, reaction media, temperature, the structure of substrate that a

10、ffects this tandem reaction were investigated systemly. in mixture solvent (water/dioxane=4/1), lipase (from porcine pancreas, type ii) can catalyze the tandem nucleophilic addition/dehydration /michael addition between aldehydes and indole derivatives. after the stepwise process were optimized, 26

11、bis(indolyl)alkanes were prepared in moderate to excellent yields by using ppl as catalyst.the influence of n-heterocyclic compounds on the enzymatic reaction was investigated. though investigating enzyme sources, solvent, additive, the ratio of imidazole and acylase, we found d-aminoacylase and imi

12、dazole can co-catalyze the claisen-schmidt reaction. when the ratio of d-aminoacylase and imidazole is 2/1, the activity of d-aminoacylase was improved obviously. and 18 tandems aldol condensation/dehydration adducts were obtained via this method. the control experiments demonstrated that the active

13、 site of d-aminoacylase was responsible for the enzymatic reaction. the mechanism for the claisen-schmidt reaction catalyzed by d-aminoacylase and imidazole was also proposed.a single enzyme can co-catalyze the cascade aldol condensation-elimination -michael-intromolecular aldol condensation-elimina

14、tion for synthesis of conjugate cyclohexanone-2-ene reaction with imidazole in octane. by investigating enzyme sources, solvent, additive, the ratio of imidazole and acylase, we found d-aminoacylase and imidazole can co-catalyze this tandem reaction. after the stepwise process was optimized, 15 conj

15、ugate cyclohexanone-2-enes were prepared. some control experiments were designed to prove that the enzyme can co-catalyze this cascade reaction with imidazole in octane. the mechanism for the tandem reaction catalyzed by d-aminoacylase and imidazole was also proposed.in this thesis, 74 compounds wer

16、e synthesized and these compounds were characterized by ir, 1h nmr, 13c nmr, gc-ms and hrms.keywords: lipase; acylase; tandem; multifunction; co-catalyze.目錄獨(dú)創(chuàng)性聲明i摘要iiabstractiii第一章 緒論11.1 酶催化多功能性的研究11.2 酶催化多組分串聯(lián)反應(yīng)11.3 小分子對(duì)酶促反應(yīng)的調(diào)控21.4 本論文的研究目的與內(nèi)容2第二章 酶催化多功能性與酶催化串聯(lián)方法研究進(jìn)展42.1 酶的催化多功能性42.1.1 脂肪酶的催化多功能性4

17、2.1.2 蛋白酶的催化多功能性72.1.3 ?；复呋映煞磻?yīng)72.1.4 酯酶催化氧化反應(yīng)92.1.5 轉(zhuǎn)氨酶的催化多功能性102.1.6 其他酶的催化多功能性102.2 酶促串聯(lián)反應(yīng)112.2.1單酶催化串聯(lián)反應(yīng)122.2.2 多酶催化串聯(lián)反應(yīng)142.2.3化學(xué)/酶促法催化串聯(lián)反應(yīng)182.3小分子對(duì)酶的催化的調(diào)控222.3.1小分子對(duì)酶促化學(xué)選擇性調(diào)控222.3.2小分子對(duì)酶的區(qū)域選擇性調(diào)控232.3.3小分子對(duì)酶的立體選擇性調(diào)控24第三章 水解酶催化friedel-craft反應(yīng)及其串聯(lián)反應(yīng)303.1 實(shí)驗(yàn)部分303.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑303.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與方法313.1.3 合成f

18、riedel-crafts產(chǎn)物的表征323.1.4 合成雙分子吲哚衍生物的表征353.2脂肪酶催化friedel-craft反應(yīng)393.2.1引言393.2.2 水解酶催化friedel-crafts烷基化反應(yīng)403.2.3 酶源對(duì)friedel-crafts烷基化反應(yīng)的影響413.2.4 脂肪酶催化friedel-crafts烷基化反應(yīng)的條件優(yōu)化423.2.5脂肪酶催化合成氮雜環(huán)衍生物443.2.6脂肪酶催化friedel-crafts烷基化反應(yīng)機(jī)理模型473.3 脂肪酶催化醛與吲哚衍生物的串聯(lián)反應(yīng)483.3.1引言483.3.2 水解酶催化雙分子吲哚與醛的串聯(lián)反應(yīng)483.3.3 酶源對(duì)吲哚

19、與對(duì)硝基苯甲醛串聯(lián)反應(yīng)的影響503.3.4 反應(yīng)條件對(duì)水解酶催化吲哚與醛串聯(lián)反應(yīng)的影響503.3.5脂肪酶催化合成氮雜環(huán)衍生物533.3.6脂肪酶催化合成氮雜環(huán)衍生物機(jī)理模型563.4 本章小結(jié)58第四章 d-氨基酰化酶與n-雜環(huán)催化claisen-schmidt反應(yīng)614.1引言614.2 實(shí)驗(yàn)部分624.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑624.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器與方法634.2.3 咪唑與d-氨基?；复呋痗laisen-schmidt反應(yīng)644.3酶源對(duì)claisen-schmid反應(yīng)的影響684.4?；概cn-雜環(huán)化合物催化claisen-schmidt反應(yīng)的條件優(yōu)化684.4.1 有機(jī)溶劑對(duì)clais

20、en-schmidt反應(yīng)的影響694.4.2 添加劑對(duì)claisen-schmidt反應(yīng)的影響694.4.3 添加劑與酶的比例對(duì)claisen-schmidt反應(yīng)的影響704.4.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)claisen-schmidt反應(yīng)的影響714.4.5 優(yōu)化后的?；复呋痗laisen-schmidt反應(yīng)條件724.5 n-雜環(huán)化合物調(diào)節(jié)?；复呋铣? -不飽和羰基化合物724.5.1受體結(jié)構(gòu)對(duì)claisen-schmidt反應(yīng)的影響724. 5.2供體結(jié)構(gòu)對(duì)于claisen-schmidt反應(yīng)的影響734.6 ?；概c咪唑催化claisen-schmidt反應(yīng)的機(jī)理744.6.1 酶活性中心催

21、化驗(yàn)證744.6.2 反應(yīng)機(jī)理754.7 本章小結(jié)76第五章 ?；复呋┩嗖酱?lián)合成環(huán)己烯酮衍生物785.1引言785.2 實(shí)驗(yàn)部分795.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑795.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器與方法805.2.3 d-氨基?；概c咪唑催化串聯(lián)反應(yīng)合成環(huán)己烯酮衍生物815.2.4 合成化合物的表征835.3 催化劑對(duì)醛酮串聯(lián)反應(yīng)的影響865.3.1酶源對(duì)醛酮串聯(lián)反應(yīng)的影響865.3.2 添加劑對(duì)醛酮串聯(lián)反應(yīng)的影響875.4 試驗(yàn)條件對(duì)該串聯(lián)反應(yīng)的影響875.4.1 有機(jī)溶劑對(duì)醛酮串聯(lián)反應(yīng)的影響875.4.2 丙酮的量對(duì)醛酮串聯(lián)反應(yīng)的影響885.4.3 添加劑與酶的比例對(duì)醛酮串聯(lián)反應(yīng)的影響885.4.4

22、優(yōu)化后的?；复呋┩?lián)反應(yīng)的條件895.5 n-雜環(huán)化合物調(diào)節(jié)酰化酶催化合成環(huán)己烯酮衍生物905.5.1受體結(jié)構(gòu)對(duì)醛酮串聯(lián)反應(yīng)的影響905. 5.2供體結(jié)構(gòu)對(duì)醛酮串聯(lián)反應(yīng)的影響915.6 ?；概c咪唑催化醛酮串聯(lián)反應(yīng)的機(jī)理假設(shè)925.6.1 酶活性中心催化驗(yàn)證925.6.2 反應(yīng)機(jī)理925.7 本章小結(jié)93第六章 總結(jié)95攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文97致 謝98第一章 緒論酶作為一種高效的、對(duì)環(huán)境友好的催化劑已經(jīng)越來(lái)越廣泛地應(yīng)用于有機(jī)合成1a-f。對(duì)酶促反應(yīng)的研究也逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槊复俚亩喙δ苄院驼{(diào)控酶促反應(yīng)。酶促一鍋法和酶促串聯(lián)反應(yīng)也逐漸成為研究的熱點(diǎn)。1.1 酶催化多功能性的研究酶的催化多功

23、能性在最近十年研究的新進(jìn)展，berglund和 gotor等人分別報(bào)道了脂肪酶cal-b具有催化碳-碳鍵2和碳-氮鍵michael3加成反應(yīng)新功能。kita、hult和余孝其課題組又發(fā)現(xiàn)水解酶除催化酯鍵或者酰胺鍵的合成與水解外，還可以催化胺解反應(yīng)4、羥醛縮合反應(yīng)5a-b、diels-alder6和mannich 7等；我們課題組也發(fā)現(xiàn)碳-氮鍵michael8a-b加成反應(yīng)可以被蛋白酶、d-氨基酸?；傅人饷复呋?、碳-碳michael9加成反應(yīng)也可以被d-氨基酸酰化酶催化、氮雜環(huán)與乙烯酯的markovnikov10a-c加成反應(yīng)可以被?；竝ga、d-氨基酸?；负蚢mano acylase催

24、化、醛與硝基烷烴的henry11反應(yīng)也可以由d-氨基酸?；复呋纫幌盗行卢F(xiàn)象。不斷研究探索酶催化多功能性的機(jī)理，深入認(rèn)識(shí)酶催化的性質(zhì)，這將大大促進(jìn)酶催化方法在綠色有機(jī)合成中應(yīng)用。1.2 酶催化多組分串聯(lián)反應(yīng)串聯(lián)反應(yīng)可以實(shí)現(xiàn)從簡(jiǎn)單的原料出發(fā)合成復(fù)雜的功能分子，酶聯(lián)合化學(xué)催化劑來(lái)催化串聯(lián)反應(yīng)是個(gè)非常具有挑戰(zhàn)性方法。kroutil12課題組利用金屬與酶的的組合來(lái)實(shí)現(xiàn)串聯(lián)的氧化與非對(duì)稱還原反應(yīng)。huerta課題組13報(bào)道了-羥基酯化合物的動(dòng)力學(xué)拆分可以通過(guò)脂肪酶pseudomonas cepacia和釕催化劑的組合來(lái)實(shí)現(xiàn)，得到較高的產(chǎn)率和ee值。酶促化學(xué)法即可以實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)動(dòng)力學(xué)拆分14a-c，又可以用

25、于手性合成15a-b。利用酶具有催化多種反應(yīng)的功能，以多步串聯(lián)和一鍋轉(zhuǎn)化的方式來(lái)實(shí)現(xiàn)多種生物活性化合物合成，這對(duì)有機(jī)合成方法學(xué)具有重要的意義。余孝其課題組報(bào)道了水解酶可以催化mannich16反應(yīng)，脫羰基的aldol17反應(yīng)等。klaas18課題組報(bào)道了水解酶cal b可以催化脫保護(hù)，酰基化和環(huán)氧化的多步串聯(lián)反應(yīng)。我們課題組也利用單酶催化合成一系列含糖咪唑衍生物19及復(fù)雜的咪唑-糖類復(fù)合物。在利用串聯(lián)來(lái)合成碳水類方面，多酶已經(jīng)展現(xiàn)出很大的優(yōu)勢(shì)和潛力。ragauskas和witayakran20也報(bào)道了苯并呋喃衍生物可以通過(guò)雙酶體系來(lái)合成。wong21課題組與richter22課題組通過(guò)控制各步

26、反應(yīng)條件，利用多酶催化的功能來(lái)合成多種糖類衍生物。酶催化串聯(lián)反應(yīng)具有條件溫和，環(huán)境友好等優(yōu)勢(shì)。因而，利用單酶或多酶來(lái)探索新反應(yīng)的組合將會(huì)是一個(gè)新的領(lǐng)域。1.3 小分子對(duì)酶促反應(yīng)的調(diào)控酶的結(jié)構(gòu)決定了酶的催化功能，一些酶與小分子存在著特殊的作用，從而能引起蛋白構(gòu)象的變化，添加劑的使用能夠調(diào)節(jié)酶催化的功能23,例如：化學(xué)選擇性調(diào)控、立體選擇性調(diào)控和區(qū)域選擇性調(diào)控。利用添加劑調(diào)控酶促反應(yīng)，是基因工程之外新途徑，為推動(dòng)酶催化合成的應(yīng)用提供更加可行辦法。1.4 本論文的研究目的與內(nèi)容本論文的研究目的是：通過(guò)研究酶的催化多功能性，認(rèn)識(shí)酶催化本質(zhì)，實(shí)現(xiàn)調(diào)控酶促反應(yīng)，并應(yīng)用于有機(jī)合成。為此，論文將圍繞以下內(nèi)容開(kāi)

27、展研究。研究了脂肪酶催化friedel-crafts烷基化反應(yīng)的新功能，考察了反應(yīng)條件，包括反應(yīng)時(shí)間、酶源、溶劑、底物的比例、酶濃度、溫度、底物結(jié)構(gòu)對(duì)脂肪酶催化friedel-crafts烷基化反應(yīng)的影響。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)了脂肪酶具有催化串聯(lián)的親核加成-消去-michael加成反應(yīng)的新功能，考察了酶源、反應(yīng)介質(zhì)、混合溶劑的比例、酶濃度、溫度、反應(yīng)時(shí)間、底物結(jié)構(gòu)對(duì)脂肪酶催化該串聯(lián)反應(yīng)的影響。并通過(guò)無(wú)酶，bsa及失活的ppl來(lái)驗(yàn)證酶活性中心的催化作用，提出了可能的催化機(jī)理。研究n-雜環(huán)化合物對(duì)?；复呋喙δ苄缘恼{(diào)控作用，考察酶源、有機(jī)溶劑、各種n-雜環(huán)化合物、n-雜環(huán)化合物與?；傅谋壤⒋呋瘎┑牧?、

28、反應(yīng)時(shí)間等因素對(duì)酶催化功能的影響。建立添加劑與酶催化功能的關(guān)系，并將添加劑的調(diào)控作用應(yīng)用于?；复呋痗laisen-schmidt和串聯(lián)的aldol縮合-消去-michael加成-分子內(nèi)aldol縮合-消去反應(yīng)。通過(guò)控制實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證酶與添加劑共同起到催化作用，提出了反應(yīng)的機(jī)理。參考文獻(xiàn)1. (a) r. j kazlauskas, curr. opin. chem. biol., 2005, 9, 195; (b) p berglund and s park, curr. org. chem., 2005, 9, 325; (c) d. m. z schmidt, e. c mundorff,

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35、e burda, w hummel, h groger. angew. chem. int. ed. 2008, 47, 9551. 15. (a)f zheng, w c. yang, m c. ko, j j. liu, h cho, d q. gao, m. tong, h h. tai, j h. woods, c g. zhan. j. am. chem. soc. 2008, 130, 12148; (b)g j. williams, t. l woodhall, m farnsworth, a nelson, a berry. j. am. chem. soc. 2006, 12

36、8, 16238.16. k li, t he, ch li, x. w feng, n wang and x. q yu, green chem., 2009, 6, 777.17. x w. feng, ch li, n wang, k li, w w. zhang, x q. yu. green chem., 2009, 11, 1933.18. m. rusch gen klaas, m. kunz, s. warwel, j. mol. catal. b: enzym., 1999, 7, 283.19. s p. yao, d s. lu, q wu, y cai, s h. xu

37、, x f. lin. chem. commun. 2004, 2006. 20. s witayakran, a j. ragauskas. eur. j. org. chem. 2009, 3, 358. 21. d franke, t machajewski, c c. hsu, c h. wong. j. org. chem. 2003, 68, 6828. 22. w rmisch, w eisenreich, g richter, a bacher. j. org. chem. 2002, 67, 8890. 23. (a) t itoh, s h. han, y matsushi

38、ta, s hayase. green chem. 2004, 6, 437; (b) w y. lou, m h. zong, h. wu, r. xu, j f. wang. green chem. 2005, 7, 500.第二章 酶催化多功能性與酶催化串聯(lián)方法研究進(jìn)展生物催化合成方法是當(dāng)前備受關(guān)注的前沿領(lǐng)域1a-c。它具有選擇性高、條件溫和、反應(yīng)速度快等優(yōu)點(diǎn)，因而吸引了化學(xué)、化工、制藥、材料等眾多領(lǐng)域研究學(xué)者的興趣。酶一直被認(rèn)為是一種快速、專一且只對(duì)一定底物或一類反應(yīng)具有高度識(shí)別的生物催化劑。越來(lái)越多具有高立體選擇性的酶被廣泛應(yīng)用于多種有機(jī)化合物的合成中2a-c。最近的研究表明部分酶還

39、具有催化多功能性，即許多酶能夠在主反應(yīng)的活性位點(diǎn)催化第二種反應(yīng)，而且越來(lái)越多的研究表明催化多功能性普遍存在。串聯(lián)反應(yīng)可以由簡(jiǎn)單原料經(jīng)過(guò)多個(gè)化學(xué)鍵形成來(lái)得到目標(biāo)產(chǎn)物。該方法減少中間產(chǎn)物的分離步驟，簡(jiǎn)化反應(yīng)操作的過(guò)程。同時(shí)也能防止活潑或不穩(wěn)定中間產(chǎn)物在反應(yīng)體系中的累積，加快反應(yīng)速度，提高最終產(chǎn)物的得率，進(jìn)而得到一些常規(guī)方法難以合成的化合物。與分步反應(yīng)相比, 巧妙的串聯(lián)反應(yīng)不僅能提高反應(yīng)效率，具有高選擇性、原子經(jīng)濟(jì)性,大量減少浪費(fèi)，還能免去了各步后處理和分離帶來(lái)的消耗和污染。本章主要針對(duì)酶的催化多功能性研究、小分子調(diào)控酶促混亂性的研究以及單酶參與的串聯(lián)反應(yīng)在有機(jī)合成中的應(yīng)用及化學(xué)/酶促法催化串聯(lián)反應(yīng)

40、。2.1 酶的催化多功能性酶的催化多功能性是指酶在其活性位點(diǎn)能夠催化不同化學(xué)反應(yīng)的能力，這些化學(xué)反應(yīng)可能在兩點(diǎn)上有所不同：(1)參與的官能團(tuán)，即反應(yīng)過(guò)程中形成或斷裂的鍵不同；(2)可能的催化機(jī)理，即鍵形成或斷裂的過(guò)程不同。大多數(shù)催化多功能性的例子都包含以上兩點(diǎn)，酶的復(fù)雜結(jié)構(gòu)和進(jìn)化過(guò)程中的不完美控制都可能賦予酶的新催化功能。2.1.1 脂肪酶的催化多功能性脂肪酶是一類來(lái)源比較廣泛，商業(yè)上易得的生物催化劑，目前有些脂肪酶催化的有機(jī)反應(yīng)已經(jīng)成功應(yīng)用于工業(yè)化的生產(chǎn)中。因此，對(duì)于脂肪酶的研究也備受關(guān)注3a-c，從而脂肪酶催化多功能性也不斷被報(bào)道出來(lái)。首次報(bào)道了酶促c-c鍵michael加成反應(yīng)的是ber

41、glund4課題組。他們將cal b上105位的絲氨酸突變成丙氨酸，從而實(shí)現(xiàn)了cal b快速催化1,3-二羰基化合物與, -不飽和羰基化合物的michael加成反應(yīng)（如圖2-1）。由于突變?cè)鰪?qiáng)了組氨酸奪取質(zhì)子的能力，從而很大程度上提高cal b催化michael加成反應(yīng)的效率，所以該反應(yīng)可以在10分鐘內(nèi)完成。圖2-1 cal-b突變酶催化的1,3-二羰基化合物與,-不飽和羰基化合物的michael加成反應(yīng)我們課題組研究發(fā)現(xiàn)cal-b也可以催化c-s鍵的生成的新功能5。cal-b能夠催化乙烯酯與硫醇的加成反應(yīng)來(lái)合成硫醚類的化合物。非常有趣的是硫醇的加成位置可以通過(guò)反應(yīng)的溶劑來(lái)調(diào)控（如圖2-2）。

42、在異丙醚中，該反應(yīng)可以得到馬氏（markovnikov）加成產(chǎn)物。然而當(dāng)該反應(yīng)在dmf中進(jìn)行時(shí)，cal-b可以催化二者發(fā)生反馬氏（anti-markovnikov）加成反應(yīng)。圖2-2 脂肪酶催化硫醇與乙烯酯的反應(yīng)berglund課題組還cal b進(jìn)行深入的研究，他們提出了, -不飽和羰基化合物與硫醇michael加成反應(yīng)的中間體6（圖2-3）。中間體為：氧穴可以結(jié)合底物中的羰基，組氨酸與天冬氨酸協(xié)同奪取質(zhì)子。通過(guò)化學(xué)計(jì)算表明絲氨酸會(huì)與組氨酸形成氫鍵，因而絲氨酸的存在會(huì)降低組氨酸與天冬氨酸協(xié)同奪取質(zhì)子的能力。根據(jù)這一理論，他們采取突變的方法來(lái)提高酶的催化效率。他們將催化中心的絲氨酸突變成丙氨酸，

43、實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示突變酶催化活性提高了60多倍。圖2-3 甲基硫醇與丙烯醛的michael 加成反應(yīng)中計(jì)算的模型。gotor課題組在對(duì)水解酶研究中，發(fā)現(xiàn)水解酶chirazyme l-27可以催化二級(jí)胺與丙烯腈的michael加成反應(yīng)（圖2-4）。更有趣的是他們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)環(huán)戊胺的活性要大于環(huán)己胺，而環(huán)己胺的活性要大于二乙胺的活性。圖2-4 水解酶催化二級(jí)胺與丙烯腈的michael加成反應(yīng)。berglund課題組還發(fā)現(xiàn)正己醛的羥醛縮合8反應(yīng)可以由cal b催化發(fā)生（圖2-5）。雖然這個(gè)反應(yīng)沒(méi)有立體選擇性，但它的非對(duì)映體選擇性與自發(fā)的反應(yīng)有很大的區(qū)別。實(shí)驗(yàn)事實(shí)證明，用丙氨酸代替絲氨酸后羥醛縮合反應(yīng)活性大

44、約增加了2倍。這個(gè)反應(yīng)的機(jī)理與michael加成類似，都是通過(guò)形成烯醇式中間體進(jìn)行的。圖2-5 水解酶催化正己醛的aldol反應(yīng)。berglund 和brinck都報(bào)道了己醛或丙醛的aldol反應(yīng)可以用cal b在環(huán)己烷中催化進(jìn)行 9a-b。將酶中丙氨酸突變?yōu)榻z氨酸后，反應(yīng)的活性提高了4倍，但是這個(gè)反應(yīng)并沒(méi)有立體選擇性。針對(duì)脂肪酶催化aldol反應(yīng)立體選擇性的問(wèn)題，余孝其課題組10在水相中研究了7 種脂肪酶催化含芳香醛與丙酮反應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在豬胰脂肪酶ppl的催化下，該反應(yīng)可以得到一定手性的產(chǎn)物，其ee值為43%（圖2-6）。圖 2-6 水相中脂肪酶催化的羥醛縮合反應(yīng)我們課題組報(bào)道了在dmso溶

45、劑中，嘧啶類化合物與丙烯酰氧基丙酸乙烯酯的碳氮鍵michael加成反應(yīng)可以利用amano lipase m11來(lái)催化，合成了一系列的含有嘧啶乙烯酯衍生物（圖2-7）。gotor12a-b課題組發(fā)現(xiàn)仲胺與丙烯腈反應(yīng)可以用cal b在甲苯中催化進(jìn)行，結(jié)果顯示cal b具有很好的michael加成活性。根據(jù)催化三聯(lián)體理論，他們提出了催化機(jī)理。酶中的組氨酸殘基和天冬氨酸殘基協(xié)同負(fù)責(zé)質(zhì)子的轉(zhuǎn)移，催化中心的陰離子穴可以結(jié)合腈基用于穩(wěn)定過(guò)渡態(tài)。圖 2-7 脂肪酶催化嘧啶與丙烯酰氧基丙酸乙烯酯的michael加成反應(yīng) 2.1.2 蛋白酶的催化多功能性lee13報(bào)道了在水相中糜蛋白酶可以先催化三甲氧基硅烷的水解

46、，然后催化產(chǎn)物的縮合得到硅醚（圖 2-8）。圖 2-8 青霉素g ?；复呋膭e嘌醇與乙烯酯的markovnikov 加成反應(yīng)我們課題組14a-c研究非水介質(zhì)酶促反應(yīng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)在有機(jī)溶劑中，咪唑與丙烯酸甲酯的michael加成反應(yīng)可以用枯草桿菌蛋白酶進(jìn)行催化（圖 2-9）。研究表明，該蛋白酶具有廣泛的底物適應(yīng)性和結(jié)構(gòu)復(fù)雜性，如嘧啶類和嘌呤類，都能做為加成反應(yīng)的供體。在疏水性溶劑中，底物可以完全轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物。圖 2-9 蛋白酶催化咪唑、嘧啶、嘌呤的 michael加成反應(yīng) 2.1.3 ?；复呋映煞磻?yīng)我們課題組15在研究中發(fā)現(xiàn)別嘌醇與羧酸乙烯酯的反應(yīng)可以用青霉素 g ?；竵?lái)催化，得到markov

47、nikov加成產(chǎn)物（圖 2-10），利用該酶能夠高效地催化別嘌醇和一系列不同結(jié)構(gòu)的乙烯酯發(fā)生markovnikov加成反應(yīng)，我們還研究了乙烯酯結(jié)構(gòu)對(duì)酶促markovnikov加成反應(yīng)的影響。接著通過(guò)考察空白、失活酶、牛血清蛋白等催化對(duì)照實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證青霉素 g ?；傅幕钚灾行钠鸬酱呋饔谩５橇钊烁械揭馔獾氖?，酶催化反應(yīng)并沒(méi)有立體選擇性。圖 2-10 青霉素 g?；复呋膭e嘌醇與乙烯酯的 markovnikov 加成反應(yīng)我們還針對(duì)其他的酰化酶展開(kāi)了研究，發(fā)現(xiàn)了碳-氮鍵的markovnikov加成反應(yīng)可以用活性中心含有兩種鋅離子的d-氨基?；复呋M(jìn)行16a-b。嘧啶類、唑類、嘌呤類等氮雜環(huán)化合

48、物都可以做該反應(yīng)底物，潛在生物活性的氮雜環(huán)衍生物可以利用d-氨基?；复呋铣傻玫健Ｎ覀兺瑯油ㄟ^(guò)無(wú)酶、失活酶、牛血清蛋白催化及活性位點(diǎn)抑制的對(duì)照實(shí)驗(yàn)證明了markovnikov加成是酶催化過(guò)程。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們提出了?；复呋痬arkovnikov加成反應(yīng)可能的催化機(jī)理（圖 2-11）。首先，酶活性中心的一個(gè)鋅離子起到氧陰離子穴的作用，與乙烯酯中的羰基進(jìn)行配位，從而影響乙烯酯的碳碳雙鍵的電荷分布，進(jìn)而使得與氧相連的碳帶部分正電荷，羰基就被活化了，而這種正電荷更易于被親核進(jìn)攻；其次，酶催化中心的天冬氨酸殘基奪取氮原子上的質(zhì)子，形成親核試劑，再加成到乙烯酯的-碳上。這個(gè)機(jī)理中-碳上的負(fù)電荷被活性

49、中心的鋅離子穩(wěn)定，天冬氨酸又作為質(zhì)子傳遞媒介完成反應(yīng)。圖 2-11 d-氨基?；复呋?markovnikov 加成反應(yīng)的推測(cè)機(jī)理 我們還針對(duì)d-氨基?；刚归_(kāi)了進(jìn)一步的研究，發(fā)現(xiàn)了d-氨基?；敢材艽呋?碳鍵的henry反應(yīng)17。一系列的硝基烷烴和醛可以做為該反應(yīng)底物，利用d-氨基?；复呋铣梢幌盗芯哂袧撛谏锘钚缘南趸衔?。我們同樣通過(guò)無(wú)酶、失活酶和牛血清蛋白催化的對(duì)照實(shí)驗(yàn)證明了henry反應(yīng)是酶催化過(guò)程（圖 2-12）。圖 2-12 d-氨基?；复呋?-硝基苯甲醛與硝基乙烷的 henry反應(yīng)依據(jù)d-氨基?；复呋痬arkovnikov加成反應(yīng)的機(jī)理，我們課題組推測(cè)鋅離子依賴型的

50、酰化酶還應(yīng)該具有催化michael加成的功能。我們進(jìn)而設(shè)計(jì)了一些試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)結(jié)果正與我們的推測(cè)一致，氮雜環(huán)化合物與丙烯酸酯的碳-氮鍵的michael加成反應(yīng)18可以利用d-氨基酸酰化酶做催化劑來(lái)實(shí)現(xiàn)，以及1,3-二羰基化合物與共軛稀醛或稀酮的碳-碳鍵的michael加成（圖 2-13）。圖 2-13 d-氨基酸?；复呋?1,3-二羰基化合物與 ,-不飽和化合物的 michael 加成 2.1.4 酯酶催化氧化反應(yīng)altenbuchner19和shimizu20兩個(gè)課題組發(fā)現(xiàn)，當(dāng)反應(yīng)體系中含有過(guò)氧化氫或過(guò)氧酸時(shí)，一些酯酶可以顯示出氧化酶的活性，即催化過(guò)氧化反應(yīng)。研究表明，由于?；磻?yīng)與過(guò)氧

51、化反應(yīng)具有相同過(guò)渡態(tài)和酶-酰基復(fù)合物中間體，從而導(dǎo)致了酯酶的催化多功能性（圖 2-14）。圖 2-14 非血紅素過(guò)氧化酶催化的酯水解反應(yīng)和過(guò)氧化反應(yīng)機(jī)理。2.1.5 轉(zhuǎn)氨酶的催化多功能性西南大學(xué)的he課題組針對(duì)轉(zhuǎn)氨酶進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，發(fā)現(xiàn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶可以催化硝基烷烴與醛的henry反應(yīng)21，得到了henry反應(yīng)產(chǎn)物（圖 2-15），利用該酶能夠高效地催化硝基烷烴和一系列不同結(jié)構(gòu)的芳香醛發(fā)生henry反應(yīng)， 且研究了醛的結(jié)構(gòu)對(duì)酶促henry反應(yīng)的影響。接著通過(guò)考察空白、失活酶、牛血清蛋白等催化對(duì)照實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證了谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的活性中心起到催化作用。圖 2-15 酶催化4-硝基苯甲醛與硝基甲烷的h

52、enry 反應(yīng)2.1.6 其他酶的催化多功能性早在1921 年neuberg和hirsch22a-c這兩位科學(xué)家就發(fā)現(xiàn)酵母全細(xì)胞能夠催化額外的反應(yīng)（圖2-16）。接著ohta課題組23報(bào)道了芳基丙二酸酯脫羧酶可以催化aldol反應(yīng)，他們?cè)谠囼?yàn)中發(fā)現(xiàn)酶的催化新功能與天然活性都經(jīng)歷一個(gè)烯醇負(fù)離子的中間體。而酵母丙酮酸酯脫羧酶能夠催化乙醛和苯甲醛的aldol反應(yīng)，生成(r)-苯基乙酰基甲醇。gerlt研究組24a-b發(fā)現(xiàn)n-?；被嵯妇哂写呋撍磻?yīng)的功能（圖 2-17）。圖2-16 丙酮酸脫羧酶催化乙醛和苯甲醛的立體選擇性縮和反應(yīng)。 圖2-17 n-?；被嵯复呋撍磻?yīng) jansse

53、n課題組25報(bào)道了負(fù)離子親核試劑與環(huán)氧化合物的立體選擇性開(kāi)環(huán)反應(yīng)可以由鹵代醇脫鹵酶（agrobacterium radiobacter ad1）催化發(fā)生，產(chǎn)物 ee 值范圍在90%99%。研究發(fā)現(xiàn) br-, cl-, i-, cn-, no2-, n3-, ocn-, scn-和 hcoo-等9個(gè)負(fù)離子都可以作為親核試劑，而含硫化合物、二價(jià)的負(fù)離子和非離子的伯醇和氨類則不能反應(yīng)，這表明酶只能接受線型的一價(jià)負(fù)離子作為底物（圖 2-18）圖 2-18 鹵代醇脫鹵酶催化的環(huán)氧開(kāi)環(huán)反應(yīng) griengl 課題組報(bào)道了第一個(gè)生物催化的不對(duì)稱henry反應(yīng)26，他們發(fā)現(xiàn)硝基甲烷和苯甲醛的不對(duì)稱henry反應(yīng)

54、可以被醇腈裂合酶(來(lái)源于 hevea brasiliensis)催化，在室溫條件下及pbs 緩沖液和tbme 混合溶液中反應(yīng) 48 小時(shí)，產(chǎn)率可以達(dá)到 63%，ee值為 92%（圖 2-19）圖2-19 hbhnl催化硝基甲烷與醛的加成反應(yīng)許多課題組在研究中發(fā)現(xiàn)9-硫代和10-硫代硬脂酸酯類化合物的磺化氧化反應(yīng) 27和9-氟代硬脂酸酯類化合物的羥基化反應(yīng)28可以通過(guò)去飽和酶催化得到。而來(lái)自于兩種細(xì)菌的異構(gòu)酶在ph=6.8的磷酸緩沖溶液中可以催化水和3e-鹵代丙烯酸酯的 michael加成反應(yīng)29等，酶的催化多功能性不但拓寬了生物催化劑在有機(jī)合成中的應(yīng)用，豐富了有機(jī)合成方法學(xué)，而且為生命體系中復(fù)

55、雜分子的合成提供了一種高效、綠色的途徑。對(duì)現(xiàn)有酶活性位點(diǎn)進(jìn)行一定程度的人工修飾，能夠得到新的多功能性酶或者創(chuàng)造出以多功能性為主要活性的酶。隨著蛋白質(zhì)工程和酶促多功能性研究的不斷深化，酶在不對(duì)稱合成及生命體系中必定會(huì)取得更大突破。2.2 酶促串聯(lián)反應(yīng)串聯(lián)反應(yīng)因其高效、多樣的合成優(yōu)勢(shì)備受化學(xué)家青睞。而酶具有催化多種反應(yīng)的功能，所以將酶催化的多種反應(yīng)的功能加以組合，并以多步串聯(lián)和一鍋轉(zhuǎn)化的方式來(lái)實(shí)現(xiàn)多種生物活性化合物合成，這對(duì)有機(jī)合成方法學(xué)具有重要的意義。2.2.1單酶催化串聯(lián)反應(yīng)在研究中發(fā)現(xiàn)絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶30能夠催化三種非天然的反應(yīng)， 包括氨基丙二酸酯的脫羧反應(yīng)、蘇氨酸的逆羥醛縮合反應(yīng)以及丙氨

56、酸的消旋化反應(yīng)。頭孢菌素 c 合成酶31能催化五元環(huán)到六元環(huán)的擴(kuò)環(huán)反應(yīng)和甲基上的羥基化反應(yīng)（圖 2-20）圖2-20 eukaryotes中一種頭孢菌素c合成酶催化兩種不同的反應(yīng) 雙環(huán)【2，2，2】辛烯二酮是非常重要的有機(jī)合成中間體，muller等人32發(fā)現(xiàn)了在氯仿中，固定化酪氨酸酶可以利用“一鍋法”催化苯酚串聯(lián)羥基化-氧化-diels-alder反應(yīng)生成雙環(huán)【2，2，2】辛烯二酮（圖 2-21）。首先，是由酪氨酸酶催化苯酚羥基化生成鄰苯二酚。其次，鄰苯二酚在酪氨酸酶的作用下進(jìn)一步被氧化成鄰位苯醌。最后，苯醌與烯烴化合物發(fā)生diels-alder反應(yīng)得到最終產(chǎn)物。圖 2-21 單酶催化羥基化-氧化-diels-alder的串聯(lián)反應(yīng) beifuss課題組33在研究漆酶時(shí)發(fā)現(xiàn)：漆酶可以催化串聯(lián)的氧化-michael加成-氧化-michael加成反應(yīng)生成一系列苯并