植物原生質(zhì)體融合

1、第第1616章章 植物原生質(zhì)體融合技術(shù)植物原生質(zhì)體融合技術(shù) Plant Protoplast Fusion What 基本原理基本原理 Why 技術(shù)應(yīng)用技術(shù)應(yīng)用 How 技術(shù)方法技術(shù)方法 微微 絲絲 葉綠體葉綠體 線(xiàn)粒體線(xiàn)粒體 質(zhì)質(zhì) 膜膜 液液 泡泡 細(xì)胞核細(xì)胞核 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 微微 管管 細(xì)胞壁細(xì)胞壁 高爾基體高爾基體 細(xì)胞壁由三種主要成分構(gòu)成細(xì)胞壁由三種主要成分構(gòu)成 纖維素纖維素25-50%、半纖維素半纖維素53%和果膠和果膠5% What 基本原理基本原理 去除植物細(xì)胞壁以獲得大量的原生質(zhì)體去除植物細(xì)胞壁以獲得大量的原生質(zhì)體 誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合形成雜種細(xì)胞誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合形成雜種細(xì)胞 篩選

2、，培養(yǎng)，促進(jìn)雜種細(xì)胞分裂，分化篩選，培養(yǎng)，促進(jìn)雜種細(xì)胞分裂，分化 從細(xì)胞團(tuán)，愈傷組織到最后成株從細(xì)胞團(tuán)，愈傷組織到最后成株 Why 技術(shù)應(yīng)用技術(shù)應(yīng)用 植物原生質(zhì)體融合的意義： 克服種、屬以上植物有性雜交不親和 性障礙 為攜帶外源遺傳物質(zhì)的大分子滲入細(xì) 胞創(chuàng)造條件 How 技術(shù)方法技術(shù)方法 第第1616章章 植物原生質(zhì)體融合技術(shù)植物原生質(zhì)體融合技術(shù) Plant Protoplast Fusion 植物原生質(zhì)體的制備植物原生質(zhì)體的制備 植物原生質(zhì)體的培養(yǎng)植物原生質(zhì)體的培養(yǎng) 植物原生質(zhì)體的融合植物原生質(zhì)體的融合 一、植物原生質(zhì)體的制備一、植物原生質(zhì)體的制備 原生質(zhì)體的概念及培養(yǎng)的意義原生質(zhì)體的概念及

3、培養(yǎng)的意義 原生質(zhì)體材料來(lái)源原生質(zhì)體材料來(lái)源 原生質(zhì)體的分離原生質(zhì)體的分離 原生質(zhì)體的純化原生質(zhì)體的純化 1 1、原生質(zhì)體的概念及培養(yǎng)的意義、原生質(zhì)體的概念及培養(yǎng)的意義 概念：概念： 除去植物細(xì)胞壁的裸露細(xì)胞，稱(chēng)為原生質(zhì)體 意義：意義： （1）植物原生質(zhì)體，具有再生完整植株的力。 （2）為細(xì)胞融合研究提供了可能。有可能產(chǎn)生異源雜交新 品種。 （3）由于除去了細(xì)胞壁，降低了細(xì)胞的DNA酶活性，從而 有助于外源DNA的進(jìn)入。為再生成具有新性狀的植物體 提供有利條件。 （4）是開(kāi)展遺傳理論研究的材料。 融合產(chǎn)生體細(xì)胞雜種融合產(chǎn)生體細(xì)胞雜種 分離各種細(xì)胞器分離各種細(xì)胞器 引入各種細(xì)胞器引入各種細(xì)胞器

4、導(dǎo)入外源基因?qū)胪庠椿?誘發(fā)突變體誘發(fā)突變體 純化后的葉肉原生質(zhì)體純化后的葉肉原生質(zhì)體 2 2、原生質(zhì)體材料來(lái)源、原生質(zhì)體材料來(lái)源 植物葉片植物葉片 取材容易取材容易 比較容易用酶解法分離比較容易用酶解法分離 植物根尖組織植物根尖組織 可由各種植物的種子萌發(fā)后取得可由各種植物的種子萌發(fā)后取得 植物花粉植物花粉 產(chǎn)生單倍體原生質(zhì)體產(chǎn)生單倍體原生質(zhì)體 愈傷組織、懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞愈傷組織、懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞 細(xì)胞壁容易解離細(xì)胞壁容易解離 3 3、原生質(zhì)體的分離、原生質(zhì)體的分離 A、原生質(zhì)體的分離方法原生質(zhì)體的分離方法 機(jī)械分離法機(jī)械分離法 先將細(xì)胞放在高滲溶液中預(yù)處理，待細(xì)胞發(fā)生輕微質(zhì)壁分 離，原體質(zhì)體

5、收縮成球形式，再用機(jī)械法磨碎細(xì)胞，從傷 口處可以釋放出完整的原生質(zhì)體。 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：該方法可避免酶制劑對(duì)原生質(zhì)體的破壞作用。 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：獲得完整的原生質(zhì)體的數(shù)量比較少。 酶解分離法酶解分離法 常用的細(xì)胞壁降解酶種類(lèi)：纖維素酶、半纖維素酶、果膠 酶、果酸酶等 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：可以獲得大量的原生質(zhì)體，而且?guī)缀跛械闹参锘?它們的器官組織或細(xì)胞均可用酶解法獲得原生質(zhì)體。 缺點(diǎn)缺點(diǎn)：酶制劑中均含有核酸酶、蛋白酶、過(guò)氧化物酶以及 酚類(lèi)物質(zhì)。影響所獲原生質(zhì)體的活力。 B、影響原生質(zhì)體數(shù)量和活力的因素、影響原生質(zhì)體數(shù)量和活力的因素 1）不同種類(lèi)植物或不同組織和細(xì)胞，其細(xì)胞壁的組成和結(jié)構(gòu)細(xì)胞壁的組成和結(jié)構(gòu) 有差

6、異有差異 2）滲透壓穩(wěn)定劑：滲透壓穩(wěn)定劑：如甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、鹽類(lèi) （KCl,MgSO4.7H2O)等 3）質(zhì)膜穩(wěn)定劑：質(zhì)膜穩(wěn)定劑：如葡聚糖硫酸鉀、氯化鈣、磷酸二氫鉀等增 加對(duì)質(zhì)膜的穩(wěn)定性 4）酶液的酶液的pH值：值：一般在5.4-6.0 5）溫度因子溫度因子 6）植物材料的生理狀態(tài)：植物材料的生理狀態(tài)：如株齡、發(fā)育狀態(tài)、栽培條件等對(duì) 取材影響很大 C、分離原生質(zhì)體所用的酶液和穩(wěn)定劑、分離原生質(zhì)體所用的酶液和穩(wěn)定劑 煙草葉肉細(xì)胞：煙草葉肉細(xì)胞：0.5% Macerozyme R-10果膠酶+2% Onozuka R-10纖 維素酶，0.7M 甘露醇。 煙草懸浮細(xì)胞：煙草懸浮細(xì)胞：

7、2% Driselase纖維素酶+2% Cellusase纖維素酶+ 0.5% Macerozyme果膠酶；海水。 胡蘿卜懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞：胡蘿卜懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞：2% Onozuka纖維素酶+0.5% Driselase纖維 素酶+0.5% Rhoxyme半纖維素酶1% Pectinase果膠酶；0.35M甘露醇 + 0.35M 山梨醇 甘藍(lán)等的根細(xì)胞：甘藍(lán)等的根細(xì)胞：4% Maicelase纖維素酶+2% Rhozyme半纖維素酶 +0.3% Macerozyme果膠酶； 0.7M 甘露醇。 番茄無(wú)菌苗的子葉和葉肉細(xì)胞：番茄無(wú)菌苗的子葉和葉肉細(xì)胞：1.5% Cellulysin 纖維素酶+0.

8、3% Macerozyme果膠酶；102.6g/L 蔗糖。 水稻種子的愈傷組織的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞：水稻種子的愈傷組織的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞：2% Onozuka Rs 纖維素酶+1% Driselase 纖維素酶+2% Macerozyme R-10果膠酶+1% Pectolyase果 膠酶 ；0.3M 葡萄糖 4 4、原生質(zhì)體的純化、原生質(zhì)體的純化 去除破碎的原生質(zhì)體、末去壁的細(xì)胞、細(xì) 胞器及其他碎片等雜質(zhì) A、過(guò)濾法、過(guò)濾法 B、漂浮法、漂浮法 C、離心法、離心法 與分離試劑相與分離試劑相 同同 與分離試劑相同與分離試劑相同 FDA法的原理法的原理 vFDA本身不具有極性，不能發(fā)出熒光，可以本身不具有

9、極性，不能發(fā)出熒光，可以 自由出入細(xì)胞膜自由出入細(xì)胞膜。 v在在活活細(xì)胞中，細(xì)胞中，F(xiàn)DA被酯酶被酯酶裂解裂解，釋放出有，釋放出有極極 性的熒光素性的熒光素。 v熒光素?zé)晒馑夭荒茏杂纱┰讲荒茏杂纱┰劫|(zhì)膜，在活細(xì)胞中積累。質(zhì)膜，在活細(xì)胞中積累。 v熒光素在熒光素在死細(xì)胞中不能積累死細(xì)胞中不能積累。 v在在UV照射下照射下，活細(xì)胞中的熒光素發(fā)出，活細(xì)胞中的熒光素發(fā)出綠色熒綠色熒 光光。 FDA 熒光素?zé)晒馑?活細(xì)胞活細(xì)胞 死細(xì)胞死細(xì)胞 請(qǐng)思考請(qǐng)思考 活細(xì)胞活細(xì)胞 死細(xì)胞死細(xì)胞 FDA先用丙酮配成先用丙酮配成0.5%的母液，終濃度為的母液，終濃度為0.01% 原生質(zhì)體分離純化流程圖原生質(zhì)體分離純化流

10、程圖 第第1616章章 植物原生質(zhì)體融合技術(shù)植物原生質(zhì)體融合技術(shù) Plant Protoplast Fusion 植物原生質(zhì)體的制備植物原生質(zhì)體的制備 植物原生質(zhì)體的培養(yǎng)植物原生質(zhì)體的培養(yǎng) 植物原生質(zhì)體的融合植物原生質(zhì)體的融合 二、植物原生質(zhì)體的培養(yǎng)二、植物原生質(zhì)體的培養(yǎng) 1 1、原生質(zhì)體的培養(yǎng)方法、原生質(zhì)體的培養(yǎng)方法 2 2、原生質(zhì)體培養(yǎng)程序、原生質(zhì)體培養(yǎng)程序 3 3、原生質(zhì)體培養(yǎng)成功的技術(shù)關(guān)鍵、原生質(zhì)體培養(yǎng)成功的技術(shù)關(guān)鍵 固體培養(yǎng)法固體培養(yǎng)法 原生質(zhì)體按照一定細(xì)胞起始密度，均勻分布于薄層固體培 養(yǎng)基中 此法優(yōu)點(diǎn)有利于對(duì)單個(gè)原生質(zhì)體的胞壁再生和對(duì)細(xì)胞團(tuán)形 成的全過(guò)程進(jìn)行定點(diǎn)觀(guān)察 淺層液體培養(yǎng)

11、法：淺層液體培養(yǎng)法： 在培養(yǎng)皿或三角瓶中注入34ml原生質(zhì)體培養(yǎng)液，然后將 純凈的原生質(zhì)體，按一定的細(xì)胞密度注入并進(jìn)行培養(yǎng) 雙層培養(yǎng)法雙層培養(yǎng)法 在固體培養(yǎng)基上，加入適宜原生質(zhì)體胞壁再生和細(xì)胞分裂 的液體培養(yǎng)基 1 1、原生質(zhì)體的培養(yǎng)方法、原生質(zhì)體的培養(yǎng)方法 2 2、原生質(zhì)體的培養(yǎng)程序、原生質(zhì)體的培養(yǎng)程序 細(xì)胞壁再生：細(xì)胞壁再生： 體積膨大，葉綠體重新排列，新的細(xì)胞壁開(kāi)始合成， 細(xì)胞由球形變成橢圓形。 細(xì)胞分裂形成細(xì)胞團(tuán)：細(xì)胞分裂形成細(xì)胞團(tuán)： 一般在培養(yǎng)2-3天后細(xì)胞質(zhì)增加，細(xì)胞器增殖，DNA、 蛋白質(zhì)等合成增加，細(xì)胞分裂，形成小的細(xì)胞團(tuán)，發(fā) 育成愈傷組織或胚狀體。 器官形成植株再生：器官形成

12、植株再生： 從愈傷組織誘導(dǎo)發(fā)生 胚狀體發(fā)育 3 3、原生質(zhì)體培養(yǎng)成功的技術(shù)關(guān)鍵、原生質(zhì)體培養(yǎng)成功的技術(shù)關(guān)鍵 原生質(zhì)體的活力原生質(zhì)體的活力 影響因素：制備原生質(zhì)體的方法，滲透壓穩(wěn)定劑種類(lèi)、濃度， 質(zhì)膜穩(wěn)定劑種類(lèi)、濃度，溫度和保溫時(shí)間 原生質(zhì)體密度原生質(zhì)體密度 起始密度一般為104-105 個(gè)/mL 細(xì)胞壁再生速度細(xì)胞壁再生速度 植物種類(lèi)和取材的生理狀態(tài)；培養(yǎng)細(xì)胞所處的時(shí)期；酶解時(shí) 所用質(zhì)膜穩(wěn)定劑種類(lèi) 原生質(zhì)體培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境原生質(zhì)體培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境 培養(yǎng)基 原生質(zhì)體培養(yǎng)的環(huán)境：光照、溫度、濕度 第第1616章章 植物原生質(zhì)體融合技術(shù)植物原生質(zhì)體融合技術(shù) Plant Protoplast Fusi

13、on 植物原生質(zhì)體的制備植物原生質(zhì)體的制備 植物原生質(zhì)體的培養(yǎng)植物原生質(zhì)體的培養(yǎng) 植物原生質(zhì)體的融合植物原生質(zhì)體的融合 回顧：動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)簡(jiǎn)介回顧：動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)簡(jiǎn)介 親本的來(lái)源親本的來(lái)源 融合方法融合方法 融合細(xì)胞的篩選融合細(xì)胞的篩選 融合細(xì)胞的克隆融合細(xì)胞的克隆 融合細(xì)胞的鑒定融合細(xì)胞的鑒定 三、植物原生質(zhì)體的融合三、植物原生質(zhì)體的融合 1 1、植物細(xì)胞融合的概念和意義、植物細(xì)胞融合的概念和意義 2 2、植物細(xì)胞融合的程序、植物細(xì)胞融合的程序 3 3、誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法及融合劑、誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法及融合劑 4 4、細(xì)胞融合的影響因素、細(xì)胞融合的影響因素 5 5、細(xì)胞雜種的選擇和鑒定、

14、細(xì)胞雜種的選擇和鑒定 1 1、植物細(xì)胞融合的概念和意義、植物細(xì)胞融合的概念和意義 細(xì)胞融合細(xì)胞融合(cell fusion)(cell fusion)概念：概念： 又稱(chēng)細(xì)胞雜交(cell hybridizaion)：離體條件下用人工的方 法把不同的細(xì)胞通過(guò)無(wú)性方式融合成一個(gè)雜合細(xì)胞的技術(shù)。 細(xì)胞融合的意義：細(xì)胞融合的意義： 克服種、屬以上植物有性雜交不親和性障礙 為攜帶外源遺傳物質(zhì)的大分子滲入細(xì)胞創(chuàng)造條件 2 2、植物細(xì)胞融合的程序、植物細(xì)胞融合的程序 原生質(zhì)體分離的分離、純化原生質(zhì)體分離的分離、純化 融合方法選擇融合方法選擇 雜種細(xì)胞的篩選雜種細(xì)胞的篩選 愈傷組織形成器官分化植株再生愈傷組織

15、形成器官分化植株再生 雜種植物的鑒定雜種植物的鑒定 3 3、誘導(dǎo)、誘導(dǎo)原生質(zhì)體原生質(zhì)體融合的方法及融合劑融合的方法及融合劑 鹽類(lèi)融合法 高Ca2+和高pH值融合 聚乙二醇（PEG）融合法 PEG與高Ca2+和高pH值結(jié)合融合法 電融合法 回顧：誘導(dǎo)動(dòng)物細(xì)胞融合的方法回顧：誘導(dǎo)動(dòng)物細(xì)胞融合的方法 1 1、病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合、病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合 2 2、化學(xué)融合劑誘導(dǎo)細(xì)胞融合、化學(xué)融合劑誘導(dǎo)細(xì)胞融合 3 3、電融合法、電融合法 A. 鹽類(lèi)融合法鹽類(lèi)融合法 鹽類(lèi)融合劑種類(lèi)鹽類(lèi)融合劑種類(lèi) 硝酸鹽類(lèi)：NaNO3、KNO3、Ca(NO3) 2 氯化物類(lèi)：NaCl、CaCl 2 、Mg Cl 2 、 BaCl

16、2 葡聚糖硫酸鹽類(lèi)：葡聚糖硫酸鉀、葡聚糖硫酸鈉 鹽類(lèi)融合的優(yōu)缺點(diǎn)鹽類(lèi)融合的優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)：鹽類(lèi)融合劑對(duì)原生質(zhì)體的活力破壞力小 缺點(diǎn)：融合頻率低，對(duì)液泡化發(fā)達(dá)的原生質(zhì)體不易誘發(fā) 融合 B. 高高Ca2+和高和高pH值融合值融合 Ca2+濃度 0.05 mol/L pH 9.5-10.5 具體做法具體做法( (以煙草為例以煙草為例) ) 取分離、純化好的兩種親本原生質(zhì)體以1:1的 比例混合; 加入0.05mol/LCaCl2.2H2O和0.4mol/L甘露醇; 再用甘氨酸鈉緩沖pH值到10.5，成為融合液， 同時(shí)在37下保溫0.5h; 用0.4mol/L甘露醇洗凈高CaCl2和高pH值； 兩種原生質(zhì)

17、體的融合率達(dá)到10%。 C. 聚乙二醇（聚乙二醇（PEG）融合法）融合法 Polyethylene glycol(PEG)是一種多聚化合物,分子式 H(OHCH2-CH2)nOH, 平均相對(duì)分子量200-20000之間 融合機(jī)制融合機(jī)制：可能是由于帶有大量負(fù)電荷的PEG分子和 原生質(zhì)體表面的負(fù)電荷間在鈣離子的連接下形成靜電 鍵，促使異源的原生質(zhì)體間的粘著結(jié)合 用相對(duì)分子質(zhì)量為1540的PEG處理40-50 min；再用 培養(yǎng)液緩慢稀釋PEG最后洗去PEG，得到10%的異核 體 D. PEG與高與高Ca2+和高和高pH值結(jié)合融合法值結(jié)合融合法 先用PEG處理30min；（PEG是相鄰原生質(zhì) 體表

18、面間的分子橋） 然后用高Ca2+和高pH值液，稀釋PEG； （引起原生質(zhì)體表面電荷的紊亂和再分布， 從而促進(jìn)了融合） 再用培養(yǎng)液洗去高Ca2+和高pH值 PEG誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合過(guò)程誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合過(guò)程 E. 電融合法電融合法 原理：原理： 改變?cè)|(zhì)體質(zhì)膜表面的電荷和氧化還原電位發(fā)生改變， 使異種原生質(zhì)體粘合并發(fā)生質(zhì)膜瞬間破裂，進(jìn)而質(zhì)膜開(kāi)始 連接，直到閉和成完整的膜形成融合體。 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： 對(duì)原生質(zhì)體的損害小，融合率高，重復(fù)性強(qiáng)；裝置精巧、 方便簡(jiǎn)單，可在顯微鏡下觀(guān)察或錄像融合過(guò)程，免去PEG 誘導(dǎo)后的洗滌過(guò)程，誘導(dǎo)過(guò)程可控性強(qiáng)。 電融合基本過(guò)程 將制備好的親本原生質(zhì)體均勻混合放入融合小室，

19、微電極型 只有一個(gè)小室，平行電極型有4個(gè)小室，兩電極間隔3mm， 整個(gè)裝置放在一個(gè)培養(yǎng)皿中 微電極型：用5-12微安的脈沖電流間斷刺激1-5毫秒，原生 質(zhì)體在幾秒到幾十秒鐘的時(shí)間內(nèi)會(huì)發(fā)生暫時(shí)性的收縮，兩層 膜之間形成小孔，連接成橋，形成一個(gè)個(gè)泡囊，經(jīng)點(diǎn)連接到 面連接，最后形成融合體,整個(gè)過(guò)程約10-30分 平行多電極融合裝置法：經(jīng)過(guò)1兆赫如150V/cm交流電場(chǎng)發(fā) 生雙向電脈沖，原生質(zhì)體在電場(chǎng)力的作用下，極化產(chǎn)生偶極 子，原生質(zhì)體緊密排開(kāi)成串珠狀。在適當(dāng)時(shí)間和強(qiáng)度的直流 電脈沖(50ms,1.2-2KV/cm)作用下，質(zhì)膜發(fā)生被擊穿，進(jìn)一 步形成融合體 細(xì)胞電融合過(guò)程細(xì)胞電融合過(guò)程 原生質(zhì)體的

20、融合過(guò)程包括原生質(zhì)體的融合過(guò)程包括3 3個(gè)主要階段個(gè)主要階段： 1)兩個(gè)或多個(gè)原生質(zhì)體的質(zhì)膜彼此靠近；兩個(gè)或多個(gè)原生質(zhì)體的質(zhì)膜彼此靠近； 2)2)局部區(qū)域質(zhì)膜緊密粘連，彼此融合；局部區(qū)域質(zhì)膜緊密粘連，彼此融合； 3)3)融合完成，形成球形的異核體或同核體。融合完成，形成球形的異核體或同核體。 4 4、細(xì)胞融合的影響因素、細(xì)胞融合的影響因素 PEGPEG誘導(dǎo)法：誘導(dǎo)法： PEG規(guī)格、純度，作用時(shí)間 電誘導(dǎo)法：電誘導(dǎo)法： 原生質(zhì)體密度 交流電壓 交變電場(chǎng)的振幅頻率 交變電場(chǎng)的處理時(shí)間 直流高頻電壓 脈沖寬度 脈沖次數(shù) 5 5、雜種細(xì)胞的選擇和鑒定、雜種細(xì)胞的選擇和鑒定 A、融合體的類(lèi)型、融合體的類(lèi)

21、型 B、雜種細(xì)胞選擇的方法、雜種細(xì)胞選擇的方法 C、細(xì)胞雜種的鑒定、細(xì)胞雜種的鑒定 A、融合體的類(lèi)型、融合體的類(lèi)型 自體融合：自體融合：發(fā)生在親本原生質(zhì)體自身 異體融合異體融合 諧和的細(xì)胞雜種諧和的細(xì)胞雜種：具有雙親全套染色體組的異源兩倍體 部分諧和的細(xì)胞雜種部分諧和的細(xì)胞雜種：雙親的染色體經(jīng)逐步排斥，便發(fā) 生少量染色體的重組，然后進(jìn)入同步分裂，最后形成帶 有部分重組染色體的植株 異胞質(zhì)體細(xì)胞雜種異胞質(zhì)體細(xì)胞雜種：親本的染色體全部被排斥，但胞質(zhì) 是雙親的 嵌合細(xì)胞雜種嵌合細(xì)胞雜種：不同種的雙親原生質(zhì)體，發(fā)生了膜融合 和胞質(zhì)融合，尚未發(fā)生核融合。雙親的細(xì)胞核各自發(fā)生 核分裂，接著形成細(xì)胞壁，最終

22、形成嵌合體植物 B、雜種細(xì)胞選擇的方法、雜種細(xì)胞選擇的方法 互補(bǔ)選擇法互補(bǔ)選擇法( (遺傳或抗性遺傳或抗性) )： 選擇一個(gè)葉綠體缺失突變體，這一突變體在限定培養(yǎng)基上， 能分裂、分化形成植株。具有正常葉綠素的植株，在上述限 定培養(yǎng)基上，則不能分裂形成大細(xì)胞團(tuán)（愈傷組織） 可見(jiàn)標(biāo)記法：可見(jiàn)標(biāo)記法： 凹穴培養(yǎng)皿分離法：根據(jù)融合后異核體和親本原生質(zhì)體的形 態(tài)特征之區(qū)別 微吸管分離法：用一種向吸管根據(jù)可見(jiàn)標(biāo)記吸取異核體，進(jìn) 行“看護(hù)培養(yǎng)”，以獲得雜種植物 生長(zhǎng)特性選擇法：生長(zhǎng)特性選擇法： 利用原生質(zhì)體對(duì)培養(yǎng)基成分要求與反應(yīng)的差異選擇雜 種細(xì)胞。 物理特性選擇法：物理特性選擇法： 利用親本原生質(zhì)體大小、顏色、漂浮密度及電脈差異 率等差異選擇雜種。 其他方法：其他方法： 如采用顯微操作技術(shù)也能把單個(gè)異核體分離出來(lái)進(jìn)行 培養(yǎng)。 異硫氰酸熒光素（異硫氰酸熒光素（FITC） 和和 異硫氰酸羅丹明（異硫氰酸羅丹明（RITC） 分別發(fā)出分別發(fā)出綠色綠色和和紅色紅色 熒光染料法熒光染料法 兩個(gè)親本原生質(zhì)體在融合前用能發(fā)不同顏色熒光兩個(gè)親本原生質(zhì)體在融合前用能發(fā)不同顏色熒光 的熒光染料進(jìn)行染色。的熒光染料進(jìn)行染色。 細(xì)