《菊花的組織培養(yǎng)》課件

1、植物組織培 養(yǎng)技術 Plant Tissue Culture 2 二、相關知識 離體（in vitro)條件下利用人工培養(yǎng)條件 在無菌情況下培養(yǎng)、生長、發(fā)育再生出完整植 株的過程。 1958年，英國科學家Steward 等用胡蘿 卜根的愈傷組織細胞進行懸浮培養(yǎng)，成功誘導 出胚狀體并分化為完整的小植株，不但使細胞 全能性理論得到證實，而且為組織培養(yǎng)的技術 程序奠定了基礎。 3 應用領域 1、快速繁殖 運用組織培養(yǎng)的途徑，一個單株 一年可以繁殖幾萬到幾百萬個植株。例如一株蘭花 一年繁殖到400萬株。 2、種苗脫毒 針對病毒對農(nóng)作物造成的嚴重危 害，通過組織培養(yǎng)可以有效地培育出大量的無病毒 種苗。

2、3、遠緣雜交 利用組織培養(yǎng)可以使難度很大的 遠緣雜交取得成功，從而育成一些罕見的新物種。 二、相關知識 4 應用領域 4、突變育種 采用組織培養(yǎng)可以直接誘變和篩 選出具抗病、抗鹽、高賴氨酸、高蛋白等優(yōu)良性狀 的品種。 5、基因工程 基因工程主要研究DNA的轉導， 而基因轉導后必須通過組織培養(yǎng)途徑才能實現(xiàn)植株 再生。 6、生物制品 有些極其昂貴的生物制品，如抗 癌首選藥物-紫杉醇等，可通過組織培養(yǎng)方式生產(chǎn)。 二、相關知識 5 植物組織培養(yǎng)的分類 廣義的組織培養(yǎng)依外植體不同，可分為： 1) 器官培養(yǎng)（organ culture） 2)莖尖分生組織培養(yǎng)(shoot tip culture, apic

3、al meristem culture) 3)愈傷組織培養(yǎng)(calluse cultrue) 4)細胞培養(yǎng)(cell culture) 5)原生質(zhì)體培養(yǎng)(protoplast culture) 二、相關知識 元貝駕考 元貝駕考2016科目一 科目四 金手指考試 金手指駕駛員考試 7 外植體(explant)：由活體（in vivo)植物 體上提取下來的，接種在培養(yǎng)基上的無 菌細胞、組織、器官等。 愈傷組織(callus)：在人工培養(yǎng)基上由外 植體上形成的一團無序生長狀態(tài)的薄壁 細胞。 二、相關知識 8 二、相關知識 9 二、相關知識 10 二、相關知識 11 二、相關知識 12 二、相關知識

4、二、相關知識 14 植物組織培養(yǎng)特點 培養(yǎng)條件可以人為控制 生長周期短，繁殖率高 管理方便，利于工廠化生產(chǎn)和自動化 控制 二、相關知識 15 植物組織培養(yǎng)營養(yǎng)條件-培養(yǎng)基 (Culture Medium) 培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)的重要基質(zhì)。 培養(yǎng)基的成分主要可以分水、無機鹽、 有機物、天然復合物、培養(yǎng)體的支持材 料等五大類。 二、相關知識 16 國際上流行的培養(yǎng)基有幾十種，常 用的培養(yǎng)基有： MS培養(yǎng)基、B5培養(yǎng)基、White培養(yǎng)基、N6 培養(yǎng)基、KM-8P培養(yǎng)基 二、相關知識 17 常用培養(yǎng)基簡介-MS培養(yǎng)基 1962年由Murashige和Skoog為培養(yǎng)煙草細胞而 設計的。特點是無機鹽和離

5、子濃度較高，為較穩(wěn)定 的平衡溶液。其養(yǎng)分的數(shù)量和比例較合適，可滿足 植物的營養(yǎng)和生理需要。它的硝酸鹽含量較其他培 養(yǎng)基為高，廣泛地用于植物的器官、花藥、細胞和 原生質(zhì)體培養(yǎng)，效果良好。有些培養(yǎng)基是由它演變 而來的。 二、相關知識 18 常用培養(yǎng)基簡介-B5培養(yǎng)基 是1968年由Galmborg等為培養(yǎng)大豆根細胞而設 計的。其主要特點是含有較低的銨，這可能對不少 培養(yǎng)物的生長有抑制作用。從實踐得知有些植物在 B5培養(yǎng)基上生長更適宜，如雙子葉植物特別是木本 植物。 二、相關知識 19 常用培養(yǎng)基簡介-White培養(yǎng)基 是1943年由White為培養(yǎng)番茄根尖而設計的。 1963年又作了改良，稱作Wh

6、ite改良培養(yǎng)基，提高了 MgSO4的濃度和增加了硼素。其特點是無機機鹽數(shù)量 較低，適于生根培養(yǎng)。 二、相關知識 20 常用培養(yǎng)基簡介N6培養(yǎng)基 是1974年朱至清等為水稻等禾谷類作物花藥培 養(yǎng)而設計的。其特點是成分較簡單，KNO3和（NH4） 2SO4含量高。在國內(nèi)已廣泛應用于小麥、水稻及其 他植物的花藥培養(yǎng)和其他組織培養(yǎng)。 二、相關知識 21 常用培養(yǎng)基簡介KM-8P培養(yǎng)基 1962年由Murashige和Skoog為培養(yǎng)煙草細胞而 設計的。特點是無機鹽和離子濃度較高，為較穩(wěn)定 的平衡溶液。其養(yǎng)分的數(shù)量和比例較合適，可滿足 植物的營養(yǎng)和生理需要。它的硝酸鹽含量較其他培 養(yǎng)基為高，廣泛地用于

7、植物的器官、花藥、細胞和 原生質(zhì)體培養(yǎng)，效果良好。有些培養(yǎng)基是由它演變 而來的。 二、相關知識 22 不同營養(yǎng)條件對植物組織培養(yǎng)的影響 Growth medium is optimised for regeneration of plantlets No sucrose (0%) Sucrose reduced to 1% Sucrose increased to 5% T h e e x p l a n t i s completely covered with green shoots, and roots are developing on the lower surface Very

8、few shoots have developed on the explant. No roots and no callus. Shoots developed on edges of upper surface, a n d s o m e r o o t development has occured Shoots have developed over the surface of the explant, along with roots from the lower surface. The result is comparable with the control medium

9、 二、相關知識 No BAP BAP reduced to 0.1 mg. l-1 No NAA Poor shoot development and no roots. Extensive callus generation Poor shoot development and no roots NAA reduced to 0.1 mg. l-1 More balanced development of roots and shoots. However, undifferentiated callus is developing at the edges of the explant P

10、rofuse development of roots and a reduced number of shoots. Undifferentiated callus is developing at the edges of the explant 二、相關知識 NAA increased to 5.0 mg. l-1 Profuse development of roots over the explant upper and lower surface, and few shoots. Some callus No MS salts No sign of regeneration fro

11、m explant at all. MS salts reduced to 0.47 g. l-1 Some root growth but reduced development of shoots MS salts increased to 9.52 g. l-1 Shoots developed on upper surface of explant. No roots or callus. 二、相關知識 25 植物細胞的全能性 植物細胞具有該植物體全部遺傳的可能性，在一 定條件下具有發(fā)育成完整植物體的潛在能力。 差異:(1) 受精卵的全能性最高 (2) 受精卵分化后的細胞中，體細胞的全

12、能性比 生殖細胞的低。 潛在全能性的原因：基因表達的選擇性 科學研究表明，處于離體狀態(tài)的植物活細胞，在 一定的營養(yǎng)物質(zhì)、激素和其他外界條件的作用下，就 可能表現(xiàn)出全能性，發(fā)育成完整的植株。人工條件下 實現(xiàn)的這一過程，就是植物組織培養(yǎng)。 三、實驗原理 26 植物細胞全能性的表達 脫分化（dedifferentiation)：將來自已分化組 織的已停止分裂的細胞從植物體部分的抑制性 影響下解脫出來，恢復細胞的分裂活性。 再分化（redifferentiation):經(jīng)脫分化的組織或 細胞在一定的培養(yǎng)條件下可有轉變?yōu)楦鞣N不同 細胞類型的能力。 三、實驗原理 27 四、試劑和器材 1、材料 新鮮胡蘿卜

13、莖 2、試劑 MS培養(yǎng)基 10%亞硫酸溶液 28 MS培養(yǎng)基配制方法 四、試劑和器材 29 四、試劑和器材 3、儀器 高壓滅菌鍋、超凈工作臺、烘箱、培養(yǎng)箱 4、玻璃器皿 試劑瓶(50、100、1000ml)、三角瓶(100ml)、 刻度吸管(0.5、1、5、10ml)、培養(yǎng)皿 5、用具 鑷子、解剖刀、接種針、記號筆、封口膜 30 離體的植物 器官、組織、 細胞 脫分化 愈 傷 組 織 再分化 根 芽 植 物 體 五、操作步驟 切開胡蘿卜，在圓圈處取一塊組織 P-木質(zhì)部、C-形成層、X-韌皮部 五、操作步驟 形成層開始形成愈傷組織 C1-愈傷組織、C2-形成層 五、操作步驟 3-4周后完全形成愈

14、傷組織狀態(tài)（脫分化） 組織塊失去色素 五、操作步驟 把脫分化后的愈傷組織轉移到培養(yǎng)基上 五、操作步驟 兩周左右開始再分化，長出幼苗 五、操作步驟 將幼苗移植到外部條件下培養(yǎng)（順化） 五、操作步驟 順化一個月后的胡蘿卜植株 五、操作步驟 培養(yǎng)基配制(I)母液配制： 按照MS培養(yǎng)基成分表, 配制分別配制培養(yǎng)基的 母液。 1、大量元素母液(10倍液) 分別稱取10倍用量的各種大量無機鹽，依次溶 解于大約800ml熱的（60-80）蒸餾水中。（一 種成分完全溶解后再加入下一種，最后加水，定容 至1000ml后裝入試劑瓶中，冰箱內(nèi)貯存?zhèn)溆茫?五、操作步驟 2、微量元素母液(100倍液) 分別稱取100

15、倍用量的微量無機鹽，依次溶解 于800ml重蒸水中，加水定溶到1000ml。 3、鐵鹽母液（100倍液） 稱取100倍用量的Na2-EDTA(乙二胺四乙酸鈉) 和FeSO47H2O，溶于800ml重蒸水中，最后定容 到1000ml。 五、操作步驟 培養(yǎng)基配制(I )母液配制： 4、有機物質(zhì)母液(100倍數(shù)) 分別稱取50倍用量的各種有機物質(zhì)，依次溶解 于400ml重蒸水中，定容至1000ml，裝入棕色試劑 瓶中，貯存冰箱備用。 除上述四種母液外，培養(yǎng)基中經(jīng)常附加的各種 生物素和細胞分裂素也要配成母液貯存，臨用時按 濃度定量吸取加入。 五、操作步驟 培養(yǎng)基配制(I)母液配制： 5、生長素 如2,

16、4-D、IAA、NAA等。準確稱取20mg，先 用2ml95%乙醇溶解，然后加水，定容至20ml，濃 度為1mg/ml，再放置冰箱內(nèi)貯存?zhèn)溆谩?6、細胞分裂素 如激動素(Kt)、6-芐基嘌呤(6-BA)。準確稱取 20mg，先用2ml的1mol/ml HCL或NaOH溶解，然 后加水，定容至20ml，濃度為1mg/ml，再放置冰 箱內(nèi)貯存?zhèn)溆谩?五、操作步驟 培養(yǎng)基配制(I)母液配制： 取1000ml燒杯一只，加大量元素10倍母液 100ml，微量元素100倍母液10ml，鐵鹽100倍母液 10ml,有機物質(zhì)100倍母液10ml。此外,根據(jù)培養(yǎng)材 料和實驗目的還要附加一定量的生長素,細胞分裂

17、素及蔗糖等,然后加水至1000ml,待蔗糖充分溶解后 用1mol/L 的NaOH或HCl調(diào)酸堿度為pH5.8,最后加 入瓊脂粉6.5g,如用瓊脂條,則要加8g。 五、操作步驟 培養(yǎng)基配制(II)配制與分裝： 將盛有培養(yǎng)基的燒杯在電磁爐上，煮至瓊脂完 全融化，補加蒸餾水至1000ml。 將配制好的培養(yǎng)基分裝到培養(yǎng)用三角瓶中，每 只100ml三角瓶約裝40ml培養(yǎng)基。 分裝時要避免把培養(yǎng)基倒在瓶口上，否則培養(yǎng) 時容易引起雜菌污染。 五、操作步驟 培養(yǎng)基配制(II)配制與分裝： 1、把裝好的培養(yǎng)基的三角瓶放入高壓滅菌鍋中， 蓋好鍋蓋。 2、設置滅菌參數(shù)為121，20min，開始滅菌。 五、操作步驟 培養(yǎng)基配制(III)滅菌： 1、取新鮮胡蘿卜莖，用去離子水洗凈。 2、在胡蘿卜莖上切一塊含有形成層的組織，放入 磨口三角瓶中，倒入適量10%亞硫酸溶液，輕輕搖 動15