[精品]間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)及鑒定

1、實驗四實驗四 間充質(zhì)干細胞間充質(zhì)干細胞 的培養(yǎng)及鑒定的培養(yǎng)及鑒定 一、實驗目的一、實驗目的 n1、 掌握大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞原代培養(yǎng)的方法。 n2、 熟練掌握間充質(zhì)干細胞的傳代、凍存和復蘇 的操作過程。 n3、 掌握間充質(zhì)干細胞表面抗原的鑒定方法。 n4、通過誘導間充質(zhì)干細胞成脂、成骨分化，鑒 定間充質(zhì)干細胞的多向分化潛能，并掌握其誘導 分化的方法。 二、實驗材料、試劑與器材二、實驗材料、試劑與器材 n1 材料：100-150 g sd大鼠。 n2 試劑：乙醚，75%酒精，l-dmem 低糖培養(yǎng)基，胎牛血清， 小牛血清，percoll細胞分離液，1.5m nacl溶液，0.25% 胰酶，fit

2、c標記的羊抗鼠cd29抗體，fitc標記的羊抗鼠 cd90抗體，fitc標記的羊抗鼠cd71抗體，pe標記的羊抗鼠 cd106抗體，fitc標記的羊抗cd45抗體，-甘油磷酸鈉， 地塞米松，維生素c，hoechst33258，油紅o，20 g/ l硝 酸鈷溶液，20 g/l硫化銨，50%甘油，多聚賴氨酸（pll）。 n3 儀器： n細胞培養(yǎng)箱，微量移液器，倒置相差顯微鏡，細胞培養(yǎng)皿， 熒光顯微鏡，電子天平，ph計，離心機，超凈工作臺，電 熱恒溫鼓風干燥箱，電熱恒溫水槽，超聲波清洗機，立式 壓力蒸汽滅菌器。 三、實驗原理三、實驗原理 間充質(zhì)干細胞最早發(fā)現(xiàn)于骨髓中，其具有高度增殖和自 我更新能力，

3、但骨髓中mscs的含量很低，約為0.01%。分離 間充質(zhì)干細胞的方法主要有三種：全骨髓貼壁培養(yǎng)法； 密度梯度離心法；根據(jù)間充質(zhì)干細胞的表面標志，利 用流式細胞儀進行分選。在本實驗中所用的是密度梯度離 心法，即利用percoll將大部分造血細胞和單個核細胞分離、 經(jīng)過體外貼壁培養(yǎng)換液去除懸浮生長的造血干細胞、分離 獲得msc的純度達到90%左右。 間充質(zhì)干細胞沒有特異性表面抗原，表達cd29、cd44、 cd71、cd90等基質(zhì)細胞和間質(zhì)細胞的特異性表面標志抗原。 本實驗選擇了cd29、cd44、cd90、cd71、cd106和cd45進行 檢測。 n 間充質(zhì)干細胞連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保 存后仍具

4、有多向分化能力，而且可保持正 常的核型和端粒酶活性，但并不能自發(fā)分 化，在體外特定條件下可分化為成骨細胞、 軟骨細胞，脂肪細胞等多種中胚層來源的 細胞，不僅如此，它還可跨胚層分化為神 經(jīng)元細胞，胰島細胞等。 （一）骨髓間充質(zhì)干細胞的原代培養(yǎng)（一）骨髓間充質(zhì)干細胞的原代培養(yǎng) 1.取體重100-150 g的大鼠，乙醚麻醉，頸椎脫臼處死，75% 的酒精浸泡消毒5 min。 2.將大鼠腹部朝上，四肢用注射器針頭固定于泡沫板，呈 “大”字形，用剪刀，鑷子將兩后肢皮膚剪開，換另一套 剪刀、鑷子分離肌肉、肌腱，將股骨、脛骨剝離出來，放 入裝有75% 酒精的燒杯中，移入超凈臺。 3.將脛骨、股骨取出放入培養(yǎng)皿

5、中加入10 ml pbs緩沖液， 用潔凈的剪刀、鑷子進一步剝離骨頭上的肌肉、肌腱組織。 4.將剝離干凈的骨頭用少量pbs沖洗后，放入另一培養(yǎng)皿， 加入12 ml dmem完全培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中剪斷骨干兩端， 用2 ml注射器吸取培養(yǎng)基插入一頭斷端將骨髓從另一頭沖 出，反復吹打使骨髓分散，制成均勻的細胞懸液。 5.另取一干凈離心管a，加入10 ml percoll分離液。將吹打 均勻的細胞懸液沿傾斜30 o緩緩加入，切記不能沖破 percoll分離液面，用8 ml dmem完全培養(yǎng)基沖洗培養(yǎng)皿， 后用同樣的方法將其加入離心管a。 6.25003000 r/min，離心30 min后，可見離心管a

6、中液體基 本分三層，用吸管吸去上層紅色培養(yǎng)基層，將吸管伸至中 間白色絮狀層將其緩慢吸出，移至另一干凈離心管b，切 記吸取時不可用力過猛而將沉于管底的紅細胞吸上來。 7.將20 ml pbs加入離心管b，反復吹打混勻，1800 r/min離 心10 min。 8.棄上清，重復步驟7。 9.棄上清，加入5 ml完全培養(yǎng)基，吹打混勻，接種于培養(yǎng) 瓶中。 【實驗結(jié)果與分析】【實驗結(jié)果與分析】 每天注意觀察培養(yǎng)的原代細胞的形態(tài)，并 拍照記錄。 【思考題思考題 】 1 1、密度梯度離心法的原理是什么？、密度梯度離心法的原理是什么？ 2 2、間充質(zhì)干細胞的原代培養(yǎng)過程是什么，有哪些方、間充質(zhì)干細胞的原代培養(yǎng)

7、過程是什么，有哪些方 面是需要注意的？面是需要注意的？ ( (二二) ) 間充質(zhì)干細胞的傳代、凍存及復蘇間充質(zhì)干細胞的傳代、凍存及復蘇 1.當細胞融合度達到90%左右時，將培養(yǎng)液吸出，加入pbs沖 洗細胞兩次。 2.加入0.25%的胰酶2 ml，置于37培養(yǎng)箱中23 min，取出 在顯微鏡下觀察，當8090%的細胞回縮成圓形，振搖后脫 離瓶底時，移入超凈臺。 3.傳代：加入3 ml dmem完全培養(yǎng)基終止消化，用吸管反復 吹打瓶底，將細胞懸液移入離心管中，1200 r/min，離心 10 min。棄上清，加入10 ml培養(yǎng)基吹打混勻。接種于兩 個培養(yǎng)瓶中。 4.凍存：加入3 ml dmem完全

8、培養(yǎng)基終止消化，用吸管反 復吹打瓶底，將細胞懸液移入離心管中，1200 r/min，離 心10 min。棄上清，加入1 ml凍存液（fcs ：dmso：l- dmem=2：1：7）吹打混勻，置于凍存管中，4放置 3040 min，-20 放置1 h，-80過夜，再移入液氮罐中。 1. 復蘇： 1)將細胞從液氮中取出，37 輕微搖晃，使細胞快 速融化。 2)75酒精擦拭凍存管，將細胞轉(zhuǎn)移到離心管中， 加入5 ml培養(yǎng)基，1000 r/min 離心5 min。 3）棄上清，加入5 ml完全培養(yǎng)基混勻細胞，接種 于25 cm2培養(yǎng)瓶中。 【實驗結(jié)果與分析】【實驗結(jié)果與分析】 試述細胞傳代培養(yǎng)的、凍存

9、及復蘇的過程，以及 各環(huán)節(jié)的注意事項。 【思考題【思考題 】 1、細胞傳代培養(yǎng)的目的是什么？ 2、細胞凍存與復蘇的原則是什么，怎么操作？ 凍存液的成分以及作用是什么？ （三（三 ） bmscs鑒定鑒定 1 bmscs1 bmscs表面抗原鑒定：表面抗原鑒定： 1）2222 mm蓋玻片酸缸浸泡過夜，自來水沖洗10 次，三蒸水沖洗3次，浸泡于75%酒精中備用。 2）包被時取出75%酒精中的蓋玻片，在酒精燈上烘 干，放入35 mm2培養(yǎng)皿中，吸取0.5 ml濃度為50 g/ml的多聚賴氨酸滴加在蓋玻片上，37 放置1 h，回收多余的多聚賴氨酸。經(jīng)紫外線照射30 min, 后在超凈工作臺內(nèi)內(nèi)晾干。 3

10、）將預先經(jīng)過滅菌處理并包被多聚賴氨酸的蓋玻片 置于35 mm2培養(yǎng)皿中，將第5代bmscs用0.25%胰酶 消化，按1105/ml密度接種，37、5% co2條件 下培養(yǎng)。 4）待細胞70%匯合時細胞去除培養(yǎng)基，進行免疫熒 光染色鑒定其表面抗原cd29、cd34、cd45、cd71、 cd90、cd106的表達。用pbs清洗，加入4%多聚甲 醛固定，4過夜。pbs洗3次后，分別滴加用 pbs+nan3(0.02%)+bsa(3%)+ tritonx-100(0.2%) 稀釋 的單克隆抗體孵育，室溫90 min。pbs洗3次。細 胞核用hoechst 33258染色，室溫放置5 min并沖洗。

11、用50%甘油緩沖液封片，熒光顯微鏡觀察拍照。 【實驗結(jié)果與分析】【實驗結(jié)果與分析】 觀察表面抗原的免疫熒光染色結(jié)果：觀察表面抗原的免疫熒光染色結(jié)果： 【思考題【思考題 】 1、免疫熒光染色的步驟是什么，需要注意什么？免疫熒光染色的步驟是什么，需要注意什么？ 2 2、怎樣用熒光顯微鏡拍攝熒光照片？、怎樣用熒光顯微鏡拍攝熒光照片？ a. 第五代骨髓間充質(zhì)干細胞的形態(tài)學特征： 長梭形（黑色箭頭）和扁平形（紅色箭頭），bar= 50 m b-h.第五代bmscs的免疫熒光鑒定結(jié)果（藍色為hoechst 33258染色，顯示細胞核） 2 2、bmscsbmscs的誘導分化的誘導分化 1)成脂誘導：將骨髓

12、間充質(zhì)干細胞以4103/cm2的 接種密度培養(yǎng)在35 mm培養(yǎng)皿里，待細胞融合后 將含10% ncs的低糖dmem生長培養(yǎng)液換為成脂肪 分化誘導液（高糖dmem+10%血清+10 g/ml胰島 素+1 m地塞米松+100 m吲哚美辛+0.5 mm 3- isobutyl-1-methylxanthine）培養(yǎng)，每隔3 d換誘導 液一次，持續(xù)誘導培養(yǎng)6 d。 然后用維持液（高糖 dmem+10%胰島素）繼續(xù)培養(yǎng)細胞3 d。各組細胞 用pbs沖洗3次，4%多聚甲醛固定10 min，油紅o 工作液浸染10 min，60%異丙醇洗去多余染液， pbs沖洗3次，蘇木精復染3-5 min，pbs漂洗10

13、min。 鏡下觀察并攝影。 2)成骨誘導：將骨髓間充質(zhì)干細胞以4103/cm2 的接種密度培養(yǎng)在35 mm培養(yǎng)皿里，12 h后將含 10% ncs的低糖dmem生長培養(yǎng)液換為成骨誘導液 培養(yǎng)，每隔3 d換誘導液一次，持續(xù)誘導培養(yǎng)30 d 后用鈣鈷染色鑒定成骨細胞。取成骨誘導30 d的 bmscs，棄培養(yǎng)基，pbs洗3次，置95%乙醇固定液 中固定10 min涼干。置基質(zhì)液中，37 孵育46 h（防止水分蒸發(fā)）。取出放入20 g/l 硝酸鈷溶液 中5 min，流水沖洗，加入20 g/l 硫化銨（新鮮配 制）溶液中作用5 min。流水沖洗，伊紅復染5 min， 沖洗、晾干鏡檢。 【實驗結(jié)果與分析】

14、【實驗結(jié)果與分析】 a.bmscs成骨誘導后的鈣鈷染色結(jié)果，bar= 50 m；b.bmscs成脂肪誘導后的油紅染色結(jié)果， bar= 50 m 【思考題【思考題 】 n1、試述間充質(zhì)干細胞成脂誘導、成骨誘導的方 法。 2、成脂、成骨誘導分化后，怎樣進行染色鑒定？ 0vmjsu436&jztxduwh8gngkvlvyptyl2pavxx9lnarfs6(ijjdq0ryhkcdmxknhkr$0qi&mtz8&ccbvk(r&tde3nkkcl&j3v6jkqx%&9wgnusfjebwg9im18np(wmjmbjpuez*hhfakfjm3mxuxfhcl!ecbp7(sc+gn+ida(

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