遺傳病的診斷

1、Diagnosis of Genetic DiseaseDiagnosis of Genetic Disease 教學要求 1 1遺傳病的臨床診斷：病史采集；癥狀和體征；系譜 分析。 2 2細胞遺傳學檢查：染色體檢查，F(xiàn)ISHFISH技術；性染色 質(zhì)檢查。 3 3生化檢查：代謝產(chǎn)物分析、酶和蛋白質(zhì)分析。 4 4基因診斷：基因診斷的定義和特點；基因診斷的方 法：限制性片段長度多態(tài)性分析、SouthernSouthern印跡雜交、 聚合酶鏈反應分析（已知點突變的檢測、未知點突變的 檢測、基因缺失的檢測、RCR-RFLPRCR-RFLP）、DNADNA測序、DNADNA芯 片、熒光原位雜交等的原理、

2、操作和應用。 產(chǎn)前診斷 (prenatal diagnosis) 植入前診斷 (preimplantation diagnosis) 癥狀前診斷 (presymptomatic diagnosis) 現(xiàn)癥病人診斷 (symptomatic diagnosis) 臨床診斷 實驗診斷 病史采集 癥狀和體征 遺傳病系譜分析 細胞遺傳學檢查 生化檢查 基因診斷 1 癥狀和體征 2 系譜分析 3 病史采集 一、病史采集 家族史：有無同種病史； 婚姻史：婚齡、婚次、配偶健康情況及是否近親 結(jié)婚； 生育史：生育年齡、生育子女數(shù)目及健康狀況， 有無流產(chǎn)、死產(chǎn)和早產(chǎn)史 。 除應了解一般病史外，還應著重采集與遺傳

3、病 家族聚集現(xiàn)象有關的以下項目： 二、癥狀和體征 遺傳病有和其它疾病相同的癥狀和體征，往往又有 其本身特異性癥侯群，為診斷提供初步線索。 二、癥狀和體征 白化病 并 指 多 指 軟骨發(fā)育不全 二、癥狀和體征 除了解現(xiàn)在的癥狀和體征外，還應注意了解身 體發(fā)育快慢、智力增進情況、性器官及第二性征發(fā) 育狀態(tài)等。皮膚紋理特征的檢查也可作為遺傳病的 輔助診斷指標。 三、系譜分析 記錄遺傳病家族史最好的方法是繪制系譜。 系譜分析的意義 有效記錄遺傳病家族史 確定遺傳病遺傳方式 遺傳咨詢中個體患病風險計算 基因定位中連鎖分析 v系統(tǒng)性、完整性和可靠性 v不規(guī)則顯性、延遲顯性、 從性顯性等特殊現(xiàn)象 v新的基因

4、突變 v顯性與隱性概念的相對性 注意問題 同一遺傳病采用的觀察指 標不同而得出不同的遺傳 方式，如鐮狀細胞貧血和 鐮狀細胞癥狀。 四、遺傳數(shù)據(jù)庫資源應用 OMIM(Online Mendelian Inheritance in Man ) 四、遺傳數(shù)據(jù)庫資源應用 OMIM(Online Mendelian Inheritance in Man ) 第二節(jié) 細胞遺傳學檢查 1 性染色質(zhì)檢查 2 染色體檢查 取材：視檢查對象和目的而有所不同，通常主要取自外周 血、皮膚、骨髓、胸、腹水、絨毛、羊水中胎兒脫落細胞 和臍血等各種組織。 體外細胞培養(yǎng) 制片：秋水仙素處理，收獲細胞、低滲、固定、滴片等過 程

5、，制備染色體標本。 顯帶 核型分析 一、染色體檢查 不明原因的智力發(fā)育不全、生長遲緩者； 先天性畸形（包括兩性內(nèi)外生殖畸形）； 性征發(fā)育異常及生育異常： 原發(fā)性閉經(jīng)和女性不孕癥； 無精子癥和男性不育癥； 有反復多次早期流產(chǎn)史的婦女及其丈夫； 家族史：家族中有染色體異?；蛳忍旎蔚膫€體。 有較長時間、較大劑量射線或致畸致突變物質(zhì)接觸者； 惡性腫瘤，尤其是惡性血液病患者。 染色體檢查（核型分析）指征 二、性染色質(zhì)檢查 X染色質(zhì)和Y染色質(zhì) 適應癥：兩性畸形或性染色體數(shù)目異常疾病 的診斷，但仍需染色體檢查確認。 第三節(jié) 生物化學檢查 1、代謝產(chǎn)物分析 2、酶和蛋白質(zhì)分析 材料主要來源于血液和特定的組織

6、、細胞，如 肝細胞、皮膚成纖維細胞、腎、腸粘膜細胞等。 產(chǎn)前診斷中常采集絨毛、羊水、臍帶血和皮膚。 新生兒的篩查最常用的標本是和。 苯丙酮尿癥, PKU 酶活性檢查PAH肝臟 血液濾片苯丙氨酸 血 FeCl3顯色反應-綠色苯丙酮酸尿液 例： 19781978年，美國科學院院士美籍華裔科學家YW YW Kan(Kan(簡悅威 ) )和DozyDozy應用液相DNADNA分子雜交成功地 進行了鐮狀細胞貧血癥的基因診斷，標志著檢驗 診斷進入基因診斷時代。 第四節(jié) 基因診斷(gene diagnosis) 第四節(jié) 基因診斷(gene diagnosis) 基因診斷：利用分子生物學技術，從DNA/RNA

7、DNA/RNA水平 檢測分析致病基因的存在、變異和表達狀態(tài)從而對 疾病作出診斷的技術。 一、基因診斷定義和特點 A A、特異性強 B B、靈敏度高 特點 C C、應用范圍廣 D D、早期診斷 基因診斷概述 人類基因組計劃 基因結(jié)構(gòu) 后基因組計劃 基因功能 基因診斷的兩個支點： 基因診斷的一般流程 前提條件：先證者要有明確的臨床診斷 醫(yī)學遺傳咨詢門診 相關臨床科室 醫(yī)生診斷 簽署基因診斷知情同意書 抽取外周血2-3ml 基因檢測 咨詢臨床醫(yī)生 對基因檢測結(jié)果的理解 找到功能性突變：支持臨床診斷 未找到功能性突變：不否定臨床診斷 臨癥診斷家系先證者或患者 癥狀前診斷家系高危個體 產(chǎn)前診斷家系高危胎

8、兒 二、基因診斷基本方法 1Southern印跡雜交 |2聚合酶鏈反應分析 3DNA 測序 |5熒光原位雜交 4. DNA 芯片 分子印跡雜交(Southern blotting)(Southern blotting)的基本方法：DNADNA標本 用限制性內(nèi)切酶消化瓊脂糖凝膠電泳分離各酶解片段 DNADNA轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素濾膜標記探針雜交顯影確定 探針互補的每條DNADNA帶的位置，以確定在眾多酶解產(chǎn)物中含 某一特定序列的DNADNA片段的位置和大小。 1Southern印跡雜交 2聚合酶鏈反應分析 PCR原理示意圖 變性退火延伸 （1）產(chǎn)物探針檢測 ASO探針 等位特異性的寡核苷酸(alle

9、le- specific oligonucleotide，ASO)探 針: 當某一致病基因的突變位點的 性質(zhì)以及突變位點兩側(cè)的堿基 序列都明確的情形下，可以合 成ASOASO探針。 ASO探針檢測鐮狀細胞突變基因的示意圖 / /S S/S （2）產(chǎn)物構(gòu)象變化檢測- SSCP | DNADNA單鏈構(gòu)象多態(tài)性(single strand (single strand conformation polymorphisms,SSCP)conformation polymorphisms,SSCP)：相 同長度的單鏈DNADNA可因堿基序列不同 產(chǎn)生構(gòu)象差異，在非變性聚丙烯酰胺 凝膠電泳中表現(xiàn)為遷移率差

10、別。 | 提取DNADNAPCRPCR擴增產(chǎn)物變性電泳 | 根據(jù)單鏈條帶位置的改變判斷該個體 是否存在突變。 | 并不是所有的堿基突變都會導致SSCPSSCP， 因此該方法不能鑒別所有突變。 SSCP電泳檢測示意圖 基因缺失時可導致靶DNADNA模板的缺失，使用特異性 引物擴增時得不到相應的擴增產(chǎn)物，因此可以直 接檢測缺失。 （3）PCR產(chǎn)物有無檢測 RFLP連鎖分析法 （restriction fragment length polymorphism，RFLP） 由于堿基變異可能導致限制酶切點消失或新的酶切 位點出現(xiàn)，引起不同個體DNA在用同一限制酶切 割時，產(chǎn)生不同長度的DNA片段，稱 R

11、FLP。 （4）產(chǎn)物酶切檢測-RFLP nRFLPRFLP的主要步驟: : DNADNA酶切SouthernSouthern印記雜交分析 DNAPCR DNAPCR 酶切電泳分析 n RFLPRFLP主要有以下兩種類型： 點多態(tài)性 序列多態(tài)性 正常人（HbAHbA）和鐮狀細胞貧血患者 （HbSHbS）珠蛋白基因的結(jié)構(gòu)差異 正常人（HbAHbA）和鐮狀細胞細胞 貧血患者（HbSHbS）珠蛋白基因 DdeDde限制酶切點示意圖 珠蛋白基因DdeDde限制酶切片段電泳結(jié)果 1 2 1 5 16p13.2-pter 人類珠蛋白基因簇 a地中海貧血缺失基因檢測 PCR-RFLP檢測基因缺失和插入的示意圖

12、 案例9-2基因診斷分析(P99) 地貧的基因缺失的RFLP基因診斷 正常對照 3DNA 測序 DNA測序即測定DNA的一級結(jié)構(gòu)中堿基的順序。 包含特定位點的PCR產(chǎn)物再作DNA測序，比較正 ?；蚺c突變的序列，可檢測出突變的堿基類型 和位點。 DNA自動測序儀生成的序列 DNA自動測序儀采用4種不同顏色的熒光分別標記4種雙脫 氧核苷酸，基本實現(xiàn)了測序自動化。 概念：基因芯片技術是DNADNA雜交探針與半導體工業(yè)技術相結(jié) 合的產(chǎn)物。將各種探針固定于支持物上后與帶有熒光標記的 DNADNA樣品分子進行雜交，通過檢測每個探針分子的雜交信號， 進而獲取被測樣品中DNADNA分子的數(shù)量和序列信息。該技

13、術可用 于大規(guī)模篩查由基因突變引起的疾病。 4. DNA 芯片 檢測原理和步驟： （1 1）制作芯片：根據(jù)疾病基因中的 突變位點區(qū)域的核苷酸序列，合成2020 個核苷酸長的探針，將其固定于芯片 上，芯片上可固定成千上萬個探針。 （2 2）從被測對象的細胞中提取DNADNA， 用酶切成較小的片段，對DNADNA作熒光標 記，并熔解成單鏈。 （3 3）將樣品滴加到芯片上并與芯片上 的探針雜交，凡是與探針互補的酶切 片段會固定于特定位置上，不能互補 的片段會被洗脫掉。 （4 4）對芯片上的熒光作掃描和分析。 Gene screening using a DNA microarray. 非放射性原位雜交方法 用特殊熒光素標記DNADNA探針，在染色體、細胞和組織切片標 本上進行DNADNA雜交，檢測細胞內(nèi)DNADNA或RNARNA的特定序列存在與 否。 6熒光原位雜交（FISH） 案例19-1 羅xx xx ，女，3434歲，曾生育過一個智力低下患兒，現(xiàn)再次