培養(yǎng)基篩選的利器試驗(yàn)設(shè)計(jì)DesignofExperimentDOE-Sartorius.doc

1、doe培養(yǎng)基篩選的利器實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(Design of Experiment DOE)f 20世紀(jì)初創(chuàng)以來,在產(chǎn)品設(shè)計(jì)、生產(chǎn)過程控制、質(zhì)量 優(yōu)化工程等方面得到了普遍的推廣籾應(yīng)用。隨著2005年.FDA燈質(zhì)最源于設(shè)計(jì)(Quality by Design. QbD)槪念的提出.越來越多的制藥過程不僅采用DOE提高實(shí)驗(yàn)效率，也通過其進(jìn) 行質(zhì)量和風(fēng)險(xiǎn)控制。本文中主要介紹了 DOE中的混料設(shè)計(jì)(Mixtuwgsign)在培養(yǎng)基混合篩選中的應(yīng)用.在傳統(tǒng)的培托基篩選中.往往是將細(xì)胞株分別培r3-10種培斥基.而后對目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn) 率.以及質(zhì)量進(jìn)行檢測，從而來篩選適合的培斥基。這種方法至今為止也是廣泛使用的，然 而

2、在某均情況卜未必能夠滿足生產(chǎn)要求。在培養(yǎng)基篩選過程中，往往會發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在某種培養(yǎng) 基中能夠達(dá)到很髙的細(xì)胞密度.然而PCD不禺.而另外一種培養(yǎng)基,PCD較高，細(xì)胞密度 較低?；蛘?，種培斥壟得到高產(chǎn)率，而列外種得到高質(zhì)量。在這樣的狀況培斥基混 合很可能會是一個簡單快捷的解決方案。從工藝放大的角度，我們建議盡量不要將大于3種培養(yǎng)基.且選擇同一品牌的培養(yǎng)基進(jìn)行 混合.原因是在工藝放大后，培養(yǎng)基混合會使得操作復(fù)雜化，而如果混合的培養(yǎng)基為同一 品牌.在大規(guī)模生產(chǎn)中.可以采用培養(yǎng)基定制來解決這一問題基本槪念DOE是用于幫助更有效地研究X和Y之何的關(guān)系,也即Y=/W，其中丫為是響應(yīng)值.也即實(shí)驗(yàn) 中的輸出值，在細(xì)

3、胞培養(yǎng)中町以是單細(xì)胞產(chǎn)率Pcd也可以足質(zhì)最或打是活細(xì)胞密度VCD。 X也就是因子,即可能會對結(jié)果產(chǎn)生影響的因素/()()模型，即是符合Y和)(關(guān)系的方程式?；炝显O(shè)計(jì)試驗(yàn)冷要通過試驗(yàn)得出各種成分比例與指標(biāo)的關(guān)系.例如某種不銹鋼由鐵、銀.銅、的4 種元索組成，我們想知道每種元素所占比例與抗拉強(qiáng)度的數(shù)最關(guān)系.對于該類問題.研究的 是在整個產(chǎn)品中并個成分所占的比率問題，顯然，這些比率的總和應(yīng)該為100%.研究這類 問題的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)稱為混料設(shè)計(jì).背景介紹在傳統(tǒng)的培養(yǎng)基篩選中，發(fā)現(xiàn) Sartorius/Lonza 提供的 PowerCHOl, PowerCHO2, ProCHO4 三種培養(yǎng)基能得到較高產(chǎn)率的

4、抗體，現(xiàn)采用混料設(shè)計(jì)來研究是否町以通過優(yōu)化三種培養(yǎng)基的 混合比率，來進(jìn)一步提高產(chǎn)率。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)本文中采用的DOE軟件為Umetrics的MODDE (vesion 10)第1步輸入x,分別為冷二 ProCHO4, x2= PowerCHO!.x3=PowerCHO2, HZ值范陽均為096-100%o敘Dxign naiiycKspmintiany it HFr SummitOrvitw0 E Radnai ObtorMooelDiagne& tntrprFtarioropt rue卜xtcrx xWorks Met Rxpomx Sunnmry of Fit P otNameAbbr.|Uni

5、tsType|Settings| Tramform -Vccisior |1ProCHOiCHO4FractonFomJanorOtc 1Noneao2.2PowerCHOlCHOIFractionrorrkJatiorOtc 1Ncre0.025PowerCMO2CHO2Fract-onFomvJanor0 te 1|Nere2J 0-025Double efek hereto oddc new factor輸入產(chǎn)率mg/mlDeikjn AnobiHSpccKkJt onaFit Scjmanr o(M mod停l of nt蚩醫(yī)臣E5 R U曰Overview Cocff cienb R

6、csidjoh Observed/s Corios Sweet Dcmot pfMikttd tpotOotmizcrOCl O Manure ddgmirip. M0:ResponsesMoreDesignWort 5heelAnaiyreedirtViewToolsOptlniUFactorsWorksheet XResp on ses2 |3|4| 567 |1 8 |xp NameRun Orderincl/exdPTOCNQ4PowerCHOlPowerCMOiYieldN1N2N3N41 Incl10 Incl6 Inclg Incl10 0 51011N58N67N73N85N9

7、12N1027c1C0.50O.670.1666670.1666670.3333331112NilN1211 Incl 0.3333334 Ind0.3333330100.500.5C.166667G.666667C.166667C.333333C.333333C.3333330.50.50.166670.1666670.6666670.3333030.333333 j0.333333| Name |Abbr.Urits*rans4ormMoTorqet|1 1 I YloldVmg/mlNonert ddQbkk tt#rtTnvedkjtft.onModelDMjnoitlci & int

8、pfetatlanFdctori Wcnkwet Response X Sdrvriory of Fit Plot第3步選擇 MODDE 自動推薦的 Modified Simplex cCentroid 模型點(diǎn)擊 home 中的 design wizard 按 鈕產(chǎn)生工作表。在工作表中，第1列Exp No為默認(rèn)的實(shí)驗(yàn)編小 第2列Exp Name為實(shí)驗(yàn)幺 稱，可以默認(rèn)也可以自行命名;第3列Run Order為隨機(jī)化的實(shí)驗(yàn)順序:第4列Incl/excl町 以人為選檸是否需要這一組實(shí)驗(yàn).推薦默認(rèn).即全部為Inch第57列為Modified Simplex Centroid模型的實(shí)驗(yàn)組合，在本案例中也

9、鉞是不同的培養(yǎng)基比率的組合。其中，11-13行為 中心點(diǎn)的3個巫復(fù)，以評估整個實(shí)驗(yàn)的町巫復(fù)性。第8列為實(shí)矗輸出也即y根據(jù)以匕工作農(nóng)的組合以及順序(Run Order)行實(shí)驗(yàn)得出的Y值填入?yún)[作表的第8列。Worksheet X Factors ResponsesExp NameN1N3N5N810iF10N9N1011Nil13M27Run OrderInd/Exd ProCHO4PowerCMOlPowerCHO2第5步點(diǎn)擊Home中M Analysis Wizard按鈕,進(jìn)行模型評估。在DOE軟件中,臺大量的參數(shù)可以用 來評估或輔助評估模型.主要有 Results Variation . R

10、esponse Distribution Significance of Terms, Residuals Normal Probability Plot. Observed vs. Predicted Values 等特別要強(qiáng)調(diào)的是兩個，一個是方差分析(ANOVA)表： 1 1ckoRt40.29116400727909(US0Q26979810(Mod* error)11Pure error20.0450667002253M045011112(Replkte error)B14N 12Qi巴Cond. no. 7.432IS0F60.964aii67162箱M0.9M170.050.5列外

11、-個 JS Summary of Fit.X衣示模型可以解釋的變異占總變異的比例，因此完類的模型2為1,在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中需要 2接近于loQbo.l表小模型顯著.但燈于一個好的模型需要Q20.5；如果Model Validity 0.25.表示模型在顯著性匕出了問題：而對于口J靠的模型Reproducibility需要大于0.5。第6步在模型通過可靠性評估后.進(jìn)行結(jié)果分析。點(diǎn)擊Predict中的Contour按鈕,町以杳看等高 圖。Response Contour Plot Mixture design (comps3)在等高圖中,可以査 PowerCHOl. PowerCHO2, ProCHO4

12、 （三條邊）的組合對Y值 （產(chǎn)率）的影響.紅色區(qū)域是最佳的混合比率區(qū)。而點(diǎn)擊Predict中的0ptimizer按鈕，可以得到產(chǎn)量最高的預(yù)測值,也即Y為最大值,以及此時 PowerCHO!. PowerCHO2, ProCHO4 的比率。ObjMv Sleeted ettpoirt Alterrutiv* ccpcinKCriterionMaxmizeValue6.27872Graph| og(D) |DMO Cpk |1-inm112100 0375628FactorJ LGraph1 Factor contribution1ProCHO4free9A3306e-007 i52.4716PowerCHOl0x101145i2177733PowrCHQ2I 0-5983M23.7511實(shí)驗(yàn)結(jié)論由此對見，Y的預(yù)測赧人值為6.26mg/mL而此時的PowerCHOl, PowerCHO2. ProCHO4 分別為，40%, 60%和幾乎為0%,也即從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出,proCHOTM4在三種培養(yǎng)基混 合中對達(dá)到最高產(chǎn)率無顯苓作用,最佳的混合配比為PowerCHOl： PowerCHO2=4:6o需要強(qiáng)調(diào)的是.DOE只是在實(shí)驗(yàn)中輔助我們最優(yōu)化的設(shè)計(jì)實(shí)爍 模熨可鑲性垠終還是依賴于 根據(jù)匸作表進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否準(zhǔn)確可巫復(fù)。而畑后得到的結(jié)果也需要進(jìn)一步回歸到實(shí) 驗(yàn)中進(jìn)行檢驗(yàn)。DOE