酶切位點保護(hù)堿基表

1、精品文檔的切位點保護(hù)堿基-pcr引物設(shè)計用于限制性內(nèi)切的 前切反應(yīng)來源：easylabs 發(fā)布時間：2009-11-08 查看次數(shù)：12704本文給出了分子克隆中常用限制性內(nèi)切酶的保護(hù)堿基序列，如acci , afliii , asci , aval , bamhi, bglll , bsshii , bsteii , bstxi , clal , eco ri , haeiii , hindiii , kpni , mlui , ncoi , ndei , nhei, noti , nsii , pa ci , pmei, psti , pvui , saci , sacii , sali

2、, scai , smai, spei , sphi , stui , xbai , xhoi , xmai,為什么要添加保護(hù)堿基？在分子克隆實驗中，有時我們會在待擴(kuò)增的目的基因片段兩端加上特定 的酶切位點，用于后續(xù)的酶切和連接反應(yīng)。由于直接暴露在末端的酶切位 點不容易直接被限制性核酸內(nèi)切酶切開，因此在設(shè)計pcr引物時，人為的在酶切位點序列的5端外側(cè)添加額外的堿基序列，即保護(hù)堿基，用來提高將來酶切時的活性。其次，在分子克隆實驗中選擇載體的酶切位點時，相臨的兩個酶切位點 往往不能同時使用，因為一個位點切割后留下的堿基過少以至于影響旁邊 的酶切位點切割。該如何添加保護(hù)堿基？添加保護(hù)堿基時，最關(guān)心的

3、應(yīng)該是保護(hù)堿基的數(shù)目，而不是種類。什么樣的酶切位點，添加幾個保護(hù)堿基，是有數(shù)據(jù)可以參考的。添加什么保護(hù)堿基，如果嚴(yán)格點，是根據(jù)兩條引物的tm值和各引物的堿基分布及 gc含量。如果某條引物 tm值偏小，gc喉低，添加時多加 g或 c,反之亦反。為了解不同內(nèi)切酶對識別位點以外最少保護(hù)堿基數(shù)目的要求，neb采用了一系列含識別序列的短雙鏈寡核甘酸作為酶切底物進(jìn)行實驗。實驗結(jié)果 對于確定雙酶切順序?qū)袔椭ū热缭诙嘟宇^上切割位點很接近時）， 或者當(dāng)切割位點靠近 dna末端時也很有用。在本表中沒有列出的酶，則通 常需在識別位點兩端至少加上6個保護(hù)堿基，以確保酶切反應(yīng)的進(jìn)行。實驗方法：用 丫- 32pat

4、p在t4多聚核甘酸激酶的作用下標(biāo)記0.1a 260單位的寡核甘酸。取 1聞已標(biāo)記了的寡核甘酸與20單位的內(nèi)切酶，在 20 c條件下分別反應(yīng) 2小時和20小時。反應(yīng)緩沖液含70mm tris-hcl （ph 7.6）, 10 mm mgcl 2,5 mmdtt及適量的nacl或kcl （視酶的具體要求而定）。20%勺page（7m尿素）凝膠電泳分析，經(jīng)放射自顯影確定酶切百分率。本實驗采用自連接的寡核甘酸作為對照。若底物有較長的回文結(jié)構(gòu)，切割效率則可能因為出現(xiàn)發(fā)火結(jié)構(gòu)而降低酶寡核甘酸序列切割率%2 hr20 hracc iggtcgacc00cggtcgaccg00ccggtcgaccgg00af

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