電鏡切片樣品制作步驟

1、_掃描電鏡樣品的準(zhǔn)備a 懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞、細(xì)菌、血細(xì)胞、精子等；細(xì)胞使用 pbs 或無血清培養(yǎng)基離心漂洗12 次以去除血清， 離心轉(zhuǎn)速依據(jù)不同離心機(jī)、不同樣品自定，總時(shí)間控制在5min 內(nèi)；細(xì)胞團(tuán)根據(jù)預(yù)設(shè)濃度在適量2.5% 戊二醛吹懸，滴加在預(yù)先置入青霉素小瓶中的托盤，4 靜置沉降23 天，在托盤周圍加入pbs ，以防止樣品干燥。b 貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞：在培養(yǎng)皿中預(yù)先加入蓋玻片，使細(xì)胞貼附于蓋玻片上；pbs或無需請培養(yǎng)基漂洗后，放置在培養(yǎng)板室溫固定1h，4 3 h ，注意放置干燥， 自行轉(zhuǎn)入青霉素小瓶中，加滿 pbs 送檢。sem 標(biāo)本處理必須使用玻璃容器，需明確所用蓋玻片尺寸可以放入青霉素瓶。c

2、組織取材樣品觀察表面可達(dá)810mm 2 ,高度小于5mm 左右；樣品表面在固定前必須清潔：使用生理鹽水或pbs 沖洗掉表面的灰塵以及不需要觀察的蛋白、粘液等。能夠明確標(biāo)識標(biāo)本的觀察面。消化道、呼吸道、血管、生殖器官、泌尿等官腔內(nèi)表面，尤其要注意先清洗再固定。如需要觀察臟器內(nèi)結(jié)構(gòu)，應(yīng)依照不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康模瑳Q定目的臟器是否需要灌注清洗；固定 2.5% 戊二醛浸沒標(biāo)本，室溫1h， 4 固定 3h 以上，換pbs 送檢。精品資料_附： 2.5% 戊二醛的配制step 1:0.2m 磷酸緩沖液的配制：-磷酸二氫鈉（ nah2po4.h2o）2.6 克磷酸氫二鈉 (na2hpo4.12h2o)29 克雙蒸餾

3、水加至 500 毫升ph 調(diào)至 7.4step 2:戊二醛固定液的配制：-25%戊二醛1ml雙蒸餾水4ml0.2mol/l磷酸緩沖液5ml戊二醛最終濃度2.5%ph 值 7.3-7.4透射電鏡樣品的制備精品資料_一、培養(yǎng)細(xì)胞本方法適用于貼壁、懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞；細(xì)菌；精子；血細(xì)胞等。1.細(xì)胞數(shù)量： 10 6 或 6 孔板一孔的細(xì)胞達(dá)到生長面積的80% 或以上。2. 離心收集： 消化或用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞。 如細(xì)胞狀態(tài)一般或漂浮物較多， 建議更換新培養(yǎng)基；如觀察自噬，建議刮下細(xì)胞。3.離心速度、時(shí)間依據(jù)不同離心機(jī)、不同樣本自行定義，時(shí)間在5min 內(nèi)；4. 細(xì)胞團(tuán)大?。杭?xì)胞最厚處約0.51.5mm, 或

4、者參照 1 元硬幣的厚度；5.細(xì)胞離心成團(tuán)后去除上清，加 2.5% 電鏡用戊二醛500 l 固定，切勿吹懸， 室溫 1h ，4 3 h 后，去除戊二醛加滿pbs 后 4 放置或送檢。注意：固定細(xì)胞不需要吹懸，細(xì)胞不宜過多， 過多會導(dǎo)致固定液無法迅速滲透到底部細(xì)胞；二、生物組織迅速剪下 /切下相應(yīng)位置，在2.5% 戊二醛中，依據(jù)不同組織和實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，用刀片修?mm 3的小塊或 _mm 22mm 長條或薄片狀。在2.5% 戊二醛室溫1h ， 4 3 h ，去除戊二醛加滿pbs ， 4放置或送檢。標(biāo)本固定時(shí)， 盡量修飾成合適的形狀，對于需要定位的標(biāo)本，離開實(shí)驗(yàn)室者后比較難以確認(rèn)所需要的位置。使用2m

5、l 圓底或尖底的ep 管，勿用500 l 以下的 ep 管。塊狀標(biāo)本基本包含的組織類型：腦、腎、肝、肺、心肌；長條狀、薄片狀標(biāo)本基本包括：骨骼肌、平滑?。杭±w維方向與標(biāo)本長軸平行或垂直（送樣時(shí)說明方向）皮膚、毛囊：皮膚角質(zhì)層與長軸平行；精品資料_神經(jīng)、直徑在2mm 內(nèi)的小血管：其長軸與標(biāo)本塊長軸平行的長條消化道、大血管：長條片狀，一側(cè)是上皮、內(nèi)皮細(xì)胞面，或依據(jù)目的去除無用的分層腦皮質(zhì)、 海馬、耳蝸等： 具有方向性或需橫切或縱切面或需要組織中某一特定位置的標(biāo)本；具體到某些組織，可能會有不同的要求，如觀察海馬ca1 區(qū)，建議標(biāo)本取片狀或近似三角形的片狀或梯形（比較好）。直觀的說，小塊直徑約為1 元硬幣厚度；長度的短軸