蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法課件

1、蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法課件 蛋白質(zhì)組學(xué)的研究進展 蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法課件 提提 綱綱 蛋白質(zhì)組學(xué)的產(chǎn)生蛋白質(zhì)組學(xué)的產(chǎn)生 蛋白質(zhì)組學(xué)研究意義蛋白質(zhì)組學(xué)研究意義 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的內(nèi)容和方法蛋白質(zhì)組學(xué)研究的內(nèi)容和方法 蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展趨勢蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展趨勢 我國蛋白質(zhì)組學(xué)研究的現(xiàn)狀我國蛋白質(zhì)組學(xué)研究的現(xiàn)狀 蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法課件 1995 流感嗜血桿菌流感嗜血桿菌 1830 Kb 1997 酵母酵母 12.7 Mb 1998 線蟲線蟲 9700 Kb 2002 水稻水稻 430 Mb 果蠅果蠅 蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法課件 從基因到蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法課件 蛋白質(zhì)組學(xué)的產(chǎn)生蛋白質(zhì)組學(xué)的產(chǎn)生 熒光染色的

2、細胞內(nèi)蛋白質(zhì)熒光染色的細胞內(nèi)蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法課件 人類基因組計劃完成之后，生物學(xué)人類基因組計劃完成之后，生物學(xué) 被重新劃分為前基因組和后基因組被重新劃分為前基因組和后基因組 兩部分。兩部分。 * 基因組和蛋白質(zhì)組到基因組和蛋白質(zhì)組到 底有什么聯(lián)系底有什么聯(lián)系？ 蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法課件 蛋白質(zhì)組研究的意義蛋白質(zhì)組研究的意義 蛋白質(zhì)組的研究能為眾多種疾病機理的闡明及蛋白質(zhì)組的研究能為眾多種疾病機理的闡明及 攻克提供理論根據(jù)和解決途徑。通過對正常個體及攻克提供理論根據(jù)和解決途徑。通過對正常個體及 病理個體間的蛋白質(zhì)組比較分析，我們可以找到某病理個體間的蛋白質(zhì)組比較分析，我們可以找到某 些些

3、“疾病特異性的蛋白質(zhì)分子疾病特異性的蛋白質(zhì)分子”，它們可成為新藥，它們可成為新藥 物設(shè)計的分子靶點，或者也會為疾病的早期診斷提物設(shè)計的分子靶點，或者也會為疾病的早期診斷提 供分子標(biāo)志。供分子標(biāo)志。 蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法課件 動物模型/細胞 蛋白質(zhì)組研究蛋白質(zhì)組研究 生物信息學(xué)分析 功能分析 人類疾病 蛋白質(zhì)組新技術(shù) 蛋白質(zhì)組研究的策略：平臺與整合 蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法課件 蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)路線蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)路線 蛋白質(zhì)樣品的制備蛋白質(zhì)樣品的制備 雙向電泳雙向電泳圖像分析圖像分析 轉(zhuǎn)印至膜上的蛋白轉(zhuǎn)印至膜上的蛋白凝膠中的蛋白凝膠中的蛋白溶液中的蛋白溶液中的蛋白 混合肽混合肽 蛋白質(zhì)質(zhì)量

4、蛋白質(zhì)質(zhì)量N端測序端測序肽序列質(zhì)譜數(shù)據(jù)肽序列質(zhì)譜數(shù)據(jù)肽指紋圖肽指紋圖 數(shù)據(jù)搜索數(shù)據(jù)搜索 新的或已知蛋白新的或已知蛋白 蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾的鑒定蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾的鑒定 蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法課件 Proteolytic digestion Proteolytic fragmentsPure protein2D electrophoresisSample MALDI-TOF Capillary Electrophoresis HPLC N- Amino acid sequencing Mass spectrum LC/MS/MS G C G Database searching 蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法課件 蛋白

5、質(zhì)組研究的支柱：蛋白質(zhì)組研究的支柱： 雙向電泳技術(shù)雙向電泳技術(shù) 生物質(zhì)譜生物質(zhì)譜 生物信息學(xué)生物信息學(xué) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法課件 雙向電泳技術(shù)雙向電泳技術(shù) 1.雙向電泳技術(shù)發(fā)展史雙向電泳技術(shù)發(fā)展史（two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE） OFarrell 1975年創(chuàng)建高分辨率的雙向凝膠電泳，對大腸桿年創(chuàng)建高分辨率的雙向凝膠電泳，對大腸桿 菌細胞抽提物雙向電泳，分離到菌細胞抽提物雙向電泳，分離到1100個蛋白組分。但載體兩個蛋白組分。但載體兩 性電解質(zhì)使得性電解質(zhì)使得pH不穩(wěn)定且重復(fù)性差。不穩(wěn)定且重復(fù)性差。 1982年年Bjellqvist 等引入固

6、相等引入固相pH梯度梯度IPG（Immobilized pH gradients)。解決了雙向電泳重復(fù)性差、陰極漂移、可比性差解決了雙向電泳重復(fù)性差、陰極漂移、可比性差 上樣量低等一系列問題。上樣量低等一系列問題。 1994年，年，Rabilloud 等用膠內(nèi)水化的方法進行雙向電泳，等用膠內(nèi)水化的方法進行雙向電泳， 進一步增加了樣品上樣量。進一步增加了樣品上樣量。 1998年，年，Islam等等 IPGphor等電聚焦等電聚焦系統(tǒng)的引入大大簡化系統(tǒng)的引入大大簡化 了了IPGIEF，聚焦水化同時進行。聚焦水化同時進行。 蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法課件 雙向凝膠電泳（雙向凝膠電泳（2 2DEDE）原理）原

7、理: : 先根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點不同在先根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點不同在pH梯度介質(zhì)梯度介質(zhì) 中進行第一次分離，即等電聚焦（中進行第一次分離，即等電聚焦（isoelectric focusing, IEF），然后根據(jù)蛋白質(zhì)分子量的不同），然后根據(jù)蛋白質(zhì)分子量的不同 進行第二次分離，即進行第二次分離，即SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 完整的實驗步驟包括：完整的實驗步驟包括： 樣品分離、等電聚焦、平衡、第二向分離、樣品分離、等電聚焦、平衡、第二向分離、 染色、成像、軟件分析、蛋白質(zhì)鑒定染色、成像、軟件分析、蛋白質(zhì)鑒定 蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法課件 1.樣品制備樣品制備 樣品的制備是實驗成敗的關(guān)鍵，需

8、樣品的制備是實驗成敗的關(guān)鍵，需 根據(jù)不同的研究目的來決定具體的根據(jù)不同的研究目的來決定具體的 實驗方法。實驗方法。 蛋白樣品的有效溶解是成功分離蛋蛋白樣品的有效溶解是成功分離蛋 白質(zhì)的最關(guān)鍵的因素之一。可以根白質(zhì)的最關(guān)鍵的因素之一?？梢愿?據(jù)樣品性質(zhì)的不同，選用具有單一據(jù)樣品性質(zhì)的不同，選用具有單一 的增溶作用的溶液，還可用含多種的增溶作用的溶液，還可用含多種 變性劑、去垢劑、還原劑的復(fù)雜混變性劑、去垢劑、還原劑的復(fù)雜混 合溶液，以使樣品中非共價結(jié)合的合溶液，以使樣品中非共價結(jié)合的 蛋白質(zhì)復(fù)合物和聚集體完全破壞。蛋白質(zhì)復(fù)合物和聚集體完全破壞。 蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法課件 可溶性樣品可溶性樣品 固體

9、組織樣品固體組織樣品 細胞細胞 不同樣品的基本處理方法不同樣品的基本處理方法 樣品的分級處理樣品的分級處理 通過采用亞細胞分級、液相電泳和選擇性沉淀等方法通過采用亞細胞分級、液相電泳和選擇性沉淀等方法 對蛋白質(zhì)樣品進行分級處理，可降低樣品的復(fù)雜性并對蛋白質(zhì)樣品進行分級處理，可降低樣品的復(fù)雜性并 富集低豐度蛋白質(zhì)。當(dāng)前最簡單有效的處理是采用分富集低豐度蛋白質(zhì)。當(dāng)前最簡單有效的處理是采用分 級抽提，按樣品溶解度不同進行分離。級抽提，按樣品溶解度不同進行分離。 蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法課件 2.第一向：等電聚焦凝膠電泳第一向：等電聚焦凝膠電泳 （isoelectric focusing gel elect

10、rophoresis, IEF） 等電聚焦是將蛋白質(zhì)樣品加載到等電聚焦是將蛋白質(zhì)樣品加載到pHpH梯度介質(zhì)梯度介質(zhì) 上進行電泳，在電場的作用下蛋白質(zhì)會向與其所上進行電泳，在電場的作用下蛋白質(zhì)會向與其所 帶的電荷相反的方向泳動，直到遷移到其等電點帶的電荷相反的方向泳動，直到遷移到其等電點 位置時，其凈電荷為零，在電場中不再移動。這位置時，其凈電荷為零，在電場中不再移動。這 樣根據(jù)各自不同的等電點，蛋白質(zhì)最終被聚焦到樣根據(jù)各自不同的等電點，蛋白質(zhì)最終被聚焦到 一個很窄的一個很窄的pHpH介質(zhì)區(qū)域內(nèi)而實現(xiàn)分離。介質(zhì)區(qū)域內(nèi)而實現(xiàn)分離。 蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法課件 + pH 3pH 7.5pH 10 + p

11、H 3pH 7.5pH 10 + pH 3pH 7.5pH 10 + pH 3pH 7.5pH 10 蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法課件 PROTEAN IEF Cell等電聚焦電泳儀等電聚焦電泳儀 是是Bio-Rad公司公司1999年推出的一維高電壓等電聚焦電泳，年推出的一維高電壓等電聚焦電泳， 這款電泳的設(shè)計主要體現(xiàn)了蛋白質(zhì)組工作系統(tǒng)對一維電這款電泳的設(shè)計主要體現(xiàn)了蛋白質(zhì)組工作系統(tǒng)對一維電 泳高容量，高分辨率，重現(xiàn)性好等的要求。泳高容量，高分辨率，重現(xiàn)性好等的要求。 電壓范圍：電壓范圍：2510,000 V 電流范圍：電流范圍：2.4mA 溫控范圍：溫控范圍：10-25，內(nèi)置，內(nèi)置Peltier 半導(dǎo)

12、體制冷，精確控溫。半導(dǎo)體制冷，精確控溫。 膠條容量：容納膠條容量：容納24個個7cm膠條，膠條，12個個11、17、18、 24cm膠條膠條 聚聚 焦焦 槽：槽：7、11、17、18、24cm 蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法課件 蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法課件 蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法課件 IPG 膠條膠條 IPG膠條使用的介質(zhì)是一些具有弱酸或弱堿性質(zhì)的丙烯酰胺衍膠條使用的介質(zhì)是一些具有弱酸或弱堿性質(zhì)的丙烯酰胺衍 生物，并可制成任意的生物，并可制成任意的pH梯度。可根據(jù)不同的分離目的來選擇梯度。可根據(jù)不同的分離目的來選擇 不同的不同的pH梯度范圍。梯度范圍。 線性寬線性寬pH梯度膠條（梯度膠條（pH3-10）盡管可以在

13、同一塊凝膠上顯示）盡管可以在同一塊凝膠上顯示 樣品中絕大多數(shù)的蛋白質(zhì)，但多數(shù)蛋白質(zhì)都集中在膠條的中部，樣品中絕大多數(shù)的蛋白質(zhì)，但多數(shù)蛋白質(zhì)都集中在膠條的中部， 使得中間的分辨率較低。使得中間的分辨率較低。 非線性寬非線性寬pH范圍膠條（范圍膠條（pH3-10）是將）是將pH4-8之間的距離相對拉之間的距離相對拉 大，兩端大，兩端pH范圍的距離相對縮短，因此可以較好的分離大部分范圍的距離相對縮短，因此可以較好的分離大部分 PI 為為4-8的蛋白質(zhì)。的蛋白質(zhì)。 窄范圍重疊窄范圍重疊pH梯度膠條（梯度膠條（pH3-6, 5-8, 7-10）可以大大提高分）可以大大提高分 辨率和靈敏率。辨率和靈敏率。

14、 微范圍微范圍pH梯度膠條（梯度膠條（pH3.9-5.1，4.7-5.9，5.5-6.7，6.3-8.3） 能進一步提高凝膠的分辨率，尤其適合于低豐度蛋白的檢測。能進一步提高凝膠的分辨率，尤其適合于低豐度蛋白的檢測。 蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法課件 3.平衡平衡 從第一向電泳轉(zhuǎn)移到第二向電泳的過程包括兩步：從第一向電泳轉(zhuǎn)移到第二向電泳的過程包括兩步： 一是將已等電聚焦的一是將已等電聚焦的IPG膠條在含有膠條在含有SDS的緩沖液中平衡；的緩沖液中平衡； 二是膠條包埋在第二向凝膠的頂部。二是膠條包埋在第二向凝膠的頂部。 平衡的作用是保證蛋白質(zhì)完全被平衡的作用是保證蛋白質(zhì)完全被SDS包裹，半胱氨包裹，半胱氨

15、 酸被還原且被烷基化。平衡分為兩步：平衡液酸被還原且被烷基化。平衡分為兩步：平衡液1（尿素（尿素6M， SDS 2%, Tris/HCL 0.05M，甘油，甘油20%，DTT2%）作用是）作用是 還原蛋白的巰基，平衡液還原蛋白的巰基，平衡液2（尿素（尿素6M，SDS 2%, Tris/HCL 0.05M，甘油，甘油20%，碘乙酰胺，碘乙酰胺2.5%）作用是蛋）作用是蛋 白巰基烷基化。白巰基烷基化。 蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法課件 4.第二向：第二向：SDS-PAGE 雙向電泳第二向是將在雙向電泳第二向是將在IPG膠條中經(jīng)過第一向等電聚焦分膠條中經(jīng)過第一向等電聚焦分 離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到第二向離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移

16、到第二向SDS-聚丙烯酰胺凝膠上，根據(jù)蛋聚丙烯酰胺凝膠上，根據(jù)蛋 白質(zhì)的分子量的不同與第一向垂直進行分離。白質(zhì)的分子量的不同與第一向垂直進行分離。 在二向中在二向中SDS-聚丙烯凝膠電泳中凝膠的組成可以是均一膠聚丙烯凝膠電泳中凝膠的組成可以是均一膠 （單一濃度的丙烯酰胺），也可以使用梯度膠（丙烯酰胺（單一濃度的丙烯酰胺），也可以使用梯度膠（丙烯酰胺 的濃度自上而下逐漸增高）。兩者各有優(yōu)缺點。其中均一的濃度自上而下逐漸增高）。兩者各有優(yōu)缺點。其中均一 膠可以很好的分離分子量范圍較窄的蛋白質(zhì)樣品。梯度膠膠可以很好的分離分子量范圍較窄的蛋白質(zhì)樣品。梯度膠 可以同時分析分子量范圍很寬的蛋白質(zhì)；同時隨著

17、凝膠濃可以同時分析分子量范圍很寬的蛋白質(zhì)；同時隨著凝膠濃 度梯度的升高凝膠孔徑的縮小，分離的蛋白質(zhì)點更為清晰。度梯度的升高凝膠孔徑的縮小，分離的蛋白質(zhì)點更為清晰。 蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法課件 + pH 3pH 7.5pH 10 蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法課件 蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法課件 蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法課件 5.染色染色 有機染料、銀染、有機染料、銀染、負染、膠體擴散染料、熒光染料、金屬負染、膠體擴散染料、熒光染料、金屬 螯合染料螯合染料 雙向電泳中蛋白質(zhì)的檢測通常是用普通染料或金屬染雙向電泳中蛋白質(zhì)的檢測通常是用普通染料或金屬染 料來檢測凝膠中的蛋白質(zhì)。染色的靈敏度與許多因素相關(guān)，料來檢測凝膠中的蛋白質(zhì)。

18、染色的靈敏度與許多因素相關(guān)， 包括與蛋白質(zhì)結(jié)合的染料數(shù)量；染色的強度；凝膠上的蛋包括與蛋白質(zhì)結(jié)合的染料數(shù)量；染色的強度；凝膠上的蛋 白質(zhì)與凝膠背景之間的染色差異等許多方面。其中考馬斯白質(zhì)與凝膠背景之間的染色差異等許多方面。其中考馬斯 亮藍染色是檢測蛋白質(zhì)最常用的方法，亮藍染色是檢測蛋白質(zhì)最常用的方法，Coomassie Brilliant Blue R-250 檢測的靈敏度為檢測的靈敏度為40ng。銀染方法也。銀染方法也 有許多種，盡管在化學(xué)作用上有一些差異，但卻具有相似有許多種，盡管在化學(xué)作用上有一些差異，但卻具有相似 的靈敏度，可以達到的靈敏度，可以達到1ng。 蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法課件 凝

19、膠的圖像處理分析凝膠的圖像處理分析 典型流程典型流程 凝膠圖像的掃描凝膠圖像的掃描 圖像加工圖像加工 斑點檢測和定量斑點檢測和定量 凝膠配比凝膠配比 數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)呈遞和解釋數(shù)據(jù)呈遞和解釋 2-DE數(shù)據(jù)庫的建立數(shù)據(jù)庫的建立 蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法課件 蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法課件 Bio-Rad公司推出的公司推出的PDQuest分析軟件分析軟件 含含5種功能：成像系統(tǒng)控制功能種功能：成像系統(tǒng)控制功能 + 二維凝膠分析功能二維凝膠分析功能 + 數(shù)數(shù) 據(jù)庫管理功能據(jù)庫管理功能 + Spot Cutter切膠系統(tǒng)控制功能切膠系統(tǒng)控制功能 + 質(zhì)譜質(zhì)譜 數(shù)據(jù)反饋功能。數(shù)據(jù)反饋功能。 蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法課

20、件 蛋白膠切取系統(tǒng)蛋白膠切取系統(tǒng) 蛋白切膠系統(tǒng)是一套自動切膠系統(tǒng)，通過蛋白切膠系統(tǒng)是一套自動切膠系統(tǒng)，通過CCD成像，并成像，并 調(diào)用分析軟件獲得的分析結(jié)果，自動準(zhǔn)確的從凝膠切獲調(diào)用分析軟件獲得的分析結(jié)果，自動準(zhǔn)確的從凝膠切獲 取蛋白點，并將之存放在取蛋白點，并將之存放在96孔板中，以便進行下一步研孔板中，以便進行下一步研 究工作究工作 蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法課件 生物質(zhì)譜（生物質(zhì)譜（mass spectrometrymass spectrometry）技術(shù)）技術(shù) 原理：在樣品離子化后，根據(jù)離子質(zhì)荷比的不同進行分離原理：在樣品離子化后，根據(jù)離子質(zhì)荷比的不同進行分離 并確定分子量，具有靈敏度高準(zhǔn)確度

21、高易于實現(xiàn)自動化等并確定分子量，具有靈敏度高準(zhǔn)確度高易于實現(xiàn)自動化等 優(yōu)點。優(yōu)點。 在在80年代早期出現(xiàn)了兩種新的離子化技術(shù)，使質(zhì)譜從僅能年代早期出現(xiàn)了兩種新的離子化技術(shù)，使質(zhì)譜從僅能 分析小分子揮發(fā)物到可以研究生物大分子分析小分子揮發(fā)物到可以研究生物大分子 *基質(zhì)輔助激光解析離子化（基質(zhì)輔助激光解析離子化（MALDI） *電噴霧離子化（電噴霧離子化（ESI） 這些技術(shù)能非?？焖俸蜏?zhǔn)確的測定大分子物質(zhì)，結(jié)合這些技術(shù)能非?？焖俸蜏?zhǔn)確的測定大分子物質(zhì)，結(jié)合 各種質(zhì)譜技術(shù)后，可以在各種水平上研究蛋白質(zhì)，為蛋白各種質(zhì)譜技術(shù)后，可以在各種水平上研究蛋白質(zhì)，為蛋白 質(zhì)的研究開辟新道路。質(zhì)的研究開辟新道路。

22、 蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法課件 質(zhì)譜技術(shù)進行蛋白質(zhì)鑒定的基本流程質(zhì)譜技術(shù)進行蛋白質(zhì)鑒定的基本流程 樣品制備樣品制備 與與IPG膠條水化膠條水化 IPG電泳電泳 與上樣緩沖液浸潤與上樣緩沖液浸潤 SDS-PAGE 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)PVDF膜膜 膠內(nèi)直接染色膠內(nèi)直接染色 染色染色 取出蛋白點取出蛋白點 胰酶等消化胰酶等消化 濃縮于多孔吸附柱上濃縮于多孔吸附柱上 MALDI-MS肽指紋圖肽指紋圖 數(shù)據(jù)庫查詢數(shù)據(jù)庫查詢 蛋白質(zhì)鑒定蛋白質(zhì)鑒定 已知已知 反向反向HPLC分離分離 MALDI-MS， PSD片段分析片段分析 未知未知 ESI-MS-MS、微測序、微測序 蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法課件 質(zhì)譜法測序 1.1.肽段質(zhì)量指

23、紋圖譜肽段質(zhì)量指紋圖譜（PMF） 步驟：蛋白被蛋白酶專一步驟：蛋白被蛋白酶專一 性酶解后，用質(zhì)譜檢測生性酶解后，用質(zhì)譜檢測生 成的肽段，形成由各肽段成的肽段，形成由各肽段 質(zhì)量組成的質(zhì)譜圖，將得質(zhì)量組成的質(zhì)譜圖，將得 到的質(zhì)量譜圖與數(shù)據(jù)庫中到的質(zhì)量譜圖與數(shù)據(jù)庫中 通過計算得到的理論譜圖通過計算得到的理論譜圖 進行比較，進行鑒定。進行比較，進行鑒定。 代表方法：代表方法： 2DPAGE-MALDI-TOF Proteomics 2004, 4, 619-626. J. Biotechnol. 2003, 106, 147-156. J. Mass Spectrom. 1998, 33, 1-19

24、 蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法課件 2.2.多肽片段指紋圖譜（多肽片段指紋圖譜（PFFPFF） 步驟：用酶專一性酶解蛋步驟：用酶專一性酶解蛋 白質(zhì)，經(jīng)過分離，得到的白質(zhì)，經(jīng)過分離，得到的 肽段在質(zhì)譜中被選擇和破肽段在質(zhì)譜中被選擇和破 碎后得到碎后得到MS/MSMS/MS譜圖，與數(shù)譜圖，與數(shù) 據(jù)庫中的譜圖比較進行鑒據(jù)庫中的譜圖比較進行鑒 定定 代表方法：代表方法： LC-ESI-MS/MS 2D-LC-MS/MS（shotgun） Proteomics 2004, 4, 619-626. J. Biotechnol. 2003, 106, 147-156. J. Mass Spectrom. 1998,

25、33, 1-19 蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法課件 生物信息學(xué)在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的作用 J. Biotechnol. 2003, 106, 147-156. 蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法課件 生物信息學(xué)在蛋白組研究中的應(yīng)用 1. 1. 編碼的編碼的DNADNA序列的尋找與分析（分析研究對象）；序列的尋找與分析（分析研究對象）； 2. 2. 蛋白質(zhì)序列信息的獲取（搜索與測序）；蛋白質(zhì)序列信息的獲取（搜索與測序）； 3. 3. 蛋白質(zhì)鑒定和性質(zhì)預(yù)測蛋白質(zhì)鑒定和性質(zhì)預(yù)測; ; 4. 4. 蛋白質(zhì)序列分析；蛋白質(zhì)序列分析； 5. 5. 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測；蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測； 6. 6. 數(shù)據(jù)的分析與整合：大范圍基因

26、表達分析；蛋白數(shù)據(jù)的分析與整合：大范圍基因表達分析；蛋白- - 蛋白相互作用；蛋白在細胞內(nèi)的定位；構(gòu)建通路和蛋白相互作用；蛋白在細胞內(nèi)的定位；構(gòu)建通路和 細胞系統(tǒng)；預(yù)測和發(fā)現(xiàn)新的知識。細胞系統(tǒng)；預(yù)測和發(fā)現(xiàn)新的知識。 蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法課件 蛋白質(zhì)鑒定和性質(zhì)預(yù)測 蛋白質(zhì)鑒定：蛋白質(zhì)鑒定： 1.1.檢索工具和算法：檢索工具和算法： PMFMS-Fit（Prospector的一部分）、的一部分）、ProFound、 Mascot； PFFMascot、SEQUEST、Emowse（EMBOSS軟件包）。軟件包）。 2. 網(wǎng)絡(luò)鑒定工具網(wǎng)絡(luò)鑒定工具: AAComldent工具工具 PeptideMass

27、工具工具 3. 3. 數(shù)據(jù)庫資源：數(shù)據(jù)庫資源： PIR-PSD： SWISS-PROT： 蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法課件 編碼的DNA序列的尋找與分析 找尋找尋DNA的開放閱讀框翻譯編碼區(qū)的開放閱讀框翻譯編碼區(qū) 工具：美國國家生物技術(shù)信息中心（工具：美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）提供的）提供的“ORF Finder” 歐洲生物信息研究所（歐洲生物信息研究所（EBI）提供的）提供的Protein machine 其它資源其它資源 1）美國國家生物技術(shù)信息中心（）美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）：）： GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫核酸序列數(shù)據(jù)庫, ； 2）歐洲生物信息研究所（）歐洲生物信息研究所

28、（EBI）：）： 歐洲分析生物學(xué)實驗室核酸數(shù)據(jù)庫（歐洲分析生物學(xué)實驗室核酸數(shù)據(jù)庫（EMBL）, ； 3）日本國立遺傳學(xué)研究所：）日本國立遺傳學(xué)研究所： 日本日本DNA數(shù)據(jù)庫（數(shù)據(jù)庫（DDBJ）, 。 蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法課件 雙向電泳的局限性 a.低拷貝蛋白的鑒定：目前的技術(shù)還不能檢測出拷貝數(shù)低于低拷貝蛋白的鑒定：目前的技術(shù)還不能檢測出拷貝數(shù)低于 1000的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì) b.極端酸性和極端堿性的蛋白極端酸性和極端堿性的蛋白 c.分子量過大（大于分子量過大（大于100KD）或過?。ㄐ∮冢┗蜻^小（小于10KD）的蛋白）的蛋白 質(zhì)不適合用這一方法質(zhì)不適合用這一方法 d.一些疏水性蛋白，由于不能溶于提

29、取液而不適合一些疏水性蛋白，由于不能溶于提取液而不適合2-DE c.目前不能實現(xiàn)自動化處理，得到高質(zhì)量的雙向電泳圖需要目前不能實現(xiàn)自動化處理，得到高質(zhì)量的雙向電泳圖需要 精湛的技術(shù)精湛的技術(shù) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法課件 我國蛋白質(zhì)組學(xué)的現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢 國內(nèi)在國內(nèi)在19971997年開始開展蛋白質(zhì)組研究年開始開展蛋白質(zhì)組研究 20002000年中科院上海生化所發(fā)表了我國第一篇蛋白質(zhì)組研年中科院上海生化所發(fā)表了我國第一篇蛋白質(zhì)組研 究論文，并建立了我國第一個大型的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫并究論文，并建立了我國第一個大型的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫并 實現(xiàn)了網(wǎng)絡(luò)共享實現(xiàn)了網(wǎng)絡(luò)共享 20012001年軍科院和湖南師大相繼發(fā)表了

30、蛋白質(zhì)組研究論文年軍科院和湖南師大相繼發(fā)表了蛋白質(zhì)組研究論文 20022002年年1111月，在法國凡爾賽召開的首屆人類蛋白質(zhì)組國月，在法國凡爾賽召開的首屆人類蛋白質(zhì)組國 際大會上，賀福初院士當(dāng)選為際大會上，賀福初院士當(dāng)選為“人類肝臟蛋白質(zhì)組研究人類肝臟蛋白質(zhì)組研究 計劃計劃”執(zhí)行主席，這是我國領(lǐng)導(dǎo)的一項重大國際合作計執(zhí)行主席，這是我國領(lǐng)導(dǎo)的一項重大國際合作計 劃，也是第一個人類組織器官的蛋白質(zhì)計劃，具有重要劃，也是第一個人類組織器官的蛋白質(zhì)計劃，具有重要 的現(xiàn)實意義與重大的戰(zhàn)略意義。的現(xiàn)實意義與重大的戰(zhàn)略意義。 蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法課件 實實 例例 樣品：結(jié)核桿菌樣品：結(jié)核桿菌 1.菌體蛋白的

31、制備菌體蛋白的制備 菌體在含有菌體在含有1mM PMSF和和10mM EDTA的的MilliQ中重懸中重懸 超聲破碎裂解菌體超聲破碎裂解菌體15分鐘，功率為分鐘，功率為200瓦，超瓦，超1秒停秒停2秒秒 向超聲裂解物中加入尿素、二硫蘇糖醇、辛葡糖酐、兩向超聲裂解物中加入尿素、二硫蘇糖醇、辛葡糖酐、兩 性電解質(zhì)終濃度分別為性電解質(zhì)終濃度分別為9M、70mM、2%和和0.2%。 室溫放置室溫放置30分鐘，分鐘，10000g，15分鐘。分鐘。 蛋白濃度的測定，分裝凍存。蛋白濃度的測定，分裝凍存。 蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法課件 2.等電聚焦程序（等電聚焦程序（17cm膠條）膠條） 水化水化 主動水化主動水化

32、 50V 12h S1 除鹽除鹽 快速快速 250V 1.5h S2 除鹽除鹽 快速快速 1000V 2.5h S3 升壓升壓 線性線性 8000V 5h S4 聚焦聚焦 快速快速 8000V 80000Vh S5 保持保持 快速快速 500V 任意時間任意時間 3.SDS-PAGE 膠濃度為膠濃度為12%，上樣量為，上樣量為100ug。電泳時保持恒流狀態(tài)。電泳時保持恒流狀態(tài)。 4.銀染銀染 固定、水洗、敏化、水洗、染色、顯色、終止固定、水洗、敏化、水洗、染色、顯色、終止 5.掃描和軟件分析掃描和軟件分析 蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法課件 蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法課件 蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法課件 蛋白質(zhì)組學(xué)研究方

33、法課件 蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法課件 展展 望望 蛋白質(zhì)組學(xué)是針對蛋白質(zhì)組研究的一門新興學(xué)科蛋白質(zhì)組學(xué)是針對蛋白質(zhì)組研究的一門新興學(xué)科,是人是人 類基因組計劃完成后生命科學(xué)最活躍的領(lǐng)域之一類基因組計劃完成后生命科學(xué)最活躍的領(lǐng)域之一,近年來近年來 發(fā)展迅速發(fā)展迅速,其相應(yīng)的方法學(xué)也取得了巨大的進步。雙向電其相應(yīng)的方法學(xué)也取得了巨大的進步。雙向電 泳泳-質(zhì)譜技術(shù)雖然一直是蛋白質(zhì)組學(xué)的核心技術(shù)質(zhì)譜技術(shù)雖然一直是蛋白質(zhì)組學(xué)的核心技術(shù),但是近年但是近年 來一系列新技術(shù)新思想融入了蓬勃發(fā)展的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)來一系列新技術(shù)新思想融入了蓬勃發(fā)展的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù) 當(dāng)中當(dāng)中,極大的促進了這門新興學(xué)科在生命科學(xué)各個領(lǐng)域的極

34、大的促進了這門新興學(xué)科在生命科學(xué)各個領(lǐng)域的 應(yīng)用。應(yīng)用。 蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法課件 1、質(zhì)譜顯像、質(zhì)譜顯像(Mass Spectrometry Imaging ,MSI)技術(shù)技術(shù) 質(zhì)譜顯像技術(shù)是利用基質(zhì)輔助激光解吸質(zhì)譜顯像技術(shù)是利用基質(zhì)輔助激光解吸/ 離子化質(zhì)譜離子化質(zhì)譜, 直接確定新鮮冰凍組織切片的多肽或蛋白的新技術(shù)直接確定新鮮冰凍組織切片的多肽或蛋白的新技術(shù),也被也被 稱為原位蛋白質(zhì)組學(xué)。稱為原位蛋白質(zhì)組學(xué)。 通常該技術(shù)可以在組織的任意位置檢出通常該技術(shù)可以在組織的任意位置檢出400 個以上的個以上的 蛋白信號。蛋白信號。MALDI 質(zhì)譜顯像既有質(zhì)譜設(shè)備的高敏感性全質(zhì)譜顯像既有質(zhì)譜設(shè)備的高敏

35、感性全 部優(yōu)點部優(yōu)點,又具有同時檢測混合物中多種成分的能力又具有同時檢測混合物中多種成分的能力,基本無基本無 需考慮化學(xué)性質(zhì)和分子質(zhì)量。需考慮化學(xué)性質(zhì)和分子質(zhì)量。 質(zhì)譜成像技術(shù)正在快速應(yīng)用于許多領(lǐng)域。質(zhì)譜成像技術(shù)正在快速應(yīng)用于許多領(lǐng)域。 蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法課件 2 多維液相色譜多維液相色譜(Multiple Dimension Liquid Chromatography , MDLC) 將蛋白抽提物變性將蛋白抽提物變性 酸化酸化 強陽離子交換柱強陽離子交換柱 根據(jù)根據(jù) 各肽段的電荷差異進行分離各肽段的電荷差異進行分離 反相層析柱反相層析柱 電噴霧離子電噴霧離子 化質(zhì)譜儀化質(zhì)譜儀(ESI-MS)

36、 這一過程反復(fù)進行這一過程反復(fù)進行,從而得到由樣品產(chǎn)生的多肽混合物從而得到由樣品產(chǎn)生的多肽混合物 中各肽段的肽指紋圖譜中各肽段的肽指紋圖譜,結(jié)合數(shù)據(jù)庫搜索即可得到樣品的結(jié)合數(shù)據(jù)庫搜索即可得到樣品的 蛋白組成。感興趣的肽段還可以在通過源后裂解或碰撞裂蛋白組成。感興趣的肽段還可以在通過源后裂解或碰撞裂 解直接得出序列信息解直接得出序列信息,實現(xiàn)分離和鑒定一次完成實現(xiàn)分離和鑒定一次完成,達到對復(fù)達到對復(fù) 雜多肽和蛋白樣本的有效分析和在線檢測。雜多肽和蛋白樣本的有效分析和在線檢測。 蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法課件 3 核素標(biāo)簽色譜核素標(biāo)簽色譜 核素標(biāo)簽色譜是液相色譜核素標(biāo)簽色譜是液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)與核素示蹤技

37、術(shù)相質(zhì)譜技術(shù)與核素示蹤技術(shù)相 結(jié)合的分離方法結(jié)合的分離方法,主要用于定量分析差異表達蛋白。廣泛主要用于定量分析差異表達蛋白。廣泛 應(yīng)用的是同位素親和標(biāo)簽應(yīng)用的是同位素親和標(biāo)簽( Isotopic-code affinity tag , ICAT) 。 此法敏感度高此法敏感度高,低表達蛋白分析準(zhǔn)確性好。低表達蛋白分析準(zhǔn)確性好。ICAT 是一種是一種 人工合成的有機分子人工合成的有機分子,一端是起親和標(biāo)簽作用的生物素一端是起親和標(biāo)簽作用的生物素,另另 一端為可與半胱氨酸發(fā)生特異性反應(yīng)的活性基團。一端為可與半胱氨酸發(fā)生特異性反應(yīng)的活性基團。 ICAT 技術(shù)利用巰基標(biāo)記技術(shù)利用巰基標(biāo)記,所以只能對含半胱氨酸殘基的蛋所以只能對含半胱氨酸殘基的蛋 白質(zhì)進行分析是其不足之處。目前白質(zhì)進行分析是其不足之處。目前ICAT方法又衍生了多方法又衍生了多 種新的方法種新的方法,如定量研究蛋白質(zhì)磷酸化的磷酸化蛋白親和如定量研究蛋白質(zhì)磷酸化的磷酸化蛋白親和 標(biāo)簽、大規(guī)模研究標(biāo)簽、大規(guī)模研究N-末端糖基化的糖基化定點標(biāo)簽、分析末端糖基化的糖基化定點標(biāo)簽、分析 蛋白質(zhì)豐度的串聯(lián)質(zhì)量標(biāo)簽等。蛋白質(zhì)豐度的串聯(lián)質(zhì)量標(biāo)簽等。 蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法課件 蛋白質(zhì)芯片技術(shù)蛋白質(zhì)芯片技術(shù) 蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片( Protein chips) 技術(shù)是一類高通技術(shù)是一類高通 量、微型化分析蛋白質(zhì)表達和蛋白功能的新型分離量