海洋生物學專業(yè)畢業(yè)論文[精品論文]文昌魚legumain基因的克隆、表達和功能研究

1、海洋生物學專業(yè)畢業(yè)論文 精品論文 文昌魚legumain基因的克隆、表達和功能研究關鍵詞：文昌魚 legumain基因 基因克隆 半胱氨酸蛋白酶摘要：半胱氨酸蛋白酶(ec3.4.22)是一類催化活性位點含有親核的半胱氨酸殘基的肽鏈內(nèi)切酶。legumain(c13)(ec3.4.22.34)，又稱天冬酰胺內(nèi)肽酶(aep)，是半胱氨酸蛋白酶家族新成員。近年來，在植物、寄生蟲及哺乳動物中對于legumain基因、蛋白的結構和功能研究都取得了一定程度的進展。但是，卻未見文昌魚的legumain基因或蛋白的相關報道。文昌魚是現(xiàn)存的與脊椎動物原始祖先最接近的頭索動物，一直被認為是研究脊椎動物起源和進化的模

2、式動物。本文克隆了青島文昌魚的具有完整開放閱讀框的legumain基因(bblgmn)，并對其結構、進化、表達和功能進行了研究。 首先，克隆得到一個全長1637bp的cdna序列，其開放閱讀框為1308bp，編碼一個435個氨基酸殘基的多肽鏈，理論分子量約48.9kda。氨基末端有一個由15個氨基酸殘基組成的信號肽。內(nèi)部有一個肽酶c13超家族結構域。結構域內(nèi)有一個his153andcys195催化二聯(lián)體和一個保守的kgd(lys123-gly124-asp125)基序。多個高度保守的半胱氨酸殘基分別位于第226、386、398、418及435位。與曼氏血吸蟲、長角血蜱、海鞘、斑馬魚、非洲爪蟾，

3、牛，人的legumain的同源性分別為36.6、45.9、46.1、49.8、49.4、47.1和48.5。系統(tǒng)進化分析顯示bblgmn和海鞘的legumain獨聚一支，位于脊椎動物的基部，提示文昌魚legumain基因可能是脊椎動物legumain基因的原祖型。 其次，采用畢赤酵母x-33真核表達系統(tǒng)得到50kda的rbblgmn，進而對蛋白的生物學特征進行研究。發(fā)現(xiàn)rbblgmn及內(nèi)源性的bblgmn都能在酸性條件下，在asn347位點自切去除c末端肽段，形成分子量大小為37kda的有活性的成熟酶，能特異性切割多肽鏈中天冬酰胺殘基羧基端的肽鍵。而在中性及堿性環(huán)境中就會失去自切及對特異性底物

4、(z-ala-ala-asn-mca)的酶切活性；成體文昌魚肝盲囊中內(nèi)源性bblgmn在ph5.5的緩沖環(huán)境中活性最高。rbblgmn的活性，能被碘乙酰胺及n-乙基順丁烯二酰亞胺抑制；被蛋清半胱氨酸蛋白酶抑制劑部分抑制，卻不被苯甲基磺酰氟化物，胃酶抑素a和e-64抑制。 再者，我們研究了bblgmn在成體文昌魚各組織中的表達情況。內(nèi)源性酶活性檢測及westernblot分析結果都表明bblgmn蛋白主要在肝盲囊及后腸表達，northernblot和qrt-pcr分析也進一步證明了這一點。文昌魚bblgmn呈現(xiàn)出組織特異性表達模式。文昌魚的肝盲囊被認為是哺乳動物的肝臟和胰臟的起源。legumai

5、n在文昌魚消化道內(nèi)呈現(xiàn)的組織特異性分布提示這種酶可能和食物大分子的降解有關。 最后，鑒于哺乳動物legumain參與機體免疫過程中抗原的加工與遞呈，我們對bblgmn在免疫方面的功能進行了初步探討。在lps處理文昌魚后，bblgmn的表達量增加，提示bblgmn可能參與了文昌魚的免疫防御，但是bblgmn卻沒有抑菌作用。 所以，bblgmn在消化道內(nèi)可能主司食物大分子的降解消化，關于它是否參與文昌魚體內(nèi)的免疫過程，尚不能確定。正文內(nèi)容 半胱氨酸蛋白酶(ec3.4.22)是一類催化活性位點含有親核的半胱氨酸殘基的肽鏈內(nèi)切酶。legumain(c13)(ec3.4.22.34)，又稱天冬酰胺內(nèi)肽酶

6、(aep)，是半胱氨酸蛋白酶家族新成員。近年來，在植物、寄生蟲及哺乳動物中對于legumain基因、蛋白的結構和功能研究都取得了一定程度的進展。但是，卻未見文昌魚的legumain基因或蛋白的相關報道。文昌魚是現(xiàn)存的與脊椎動物原始祖先最接近的頭索動物，一直被認為是研究脊椎動物起源和進化的模式動物。本文克隆了青島文昌魚的具有完整開放閱讀框的legumain基因(bblgmn)，并對其結構、進化、表達和功能進行了研究。 首先，克隆得到一個全長1637bp的cdna序列，其開放閱讀框為1308bp，編碼一個435個氨基酸殘基的多肽鏈，理論分子量約48.9kda。氨基末端有一個由15個氨基酸殘基組成的

7、信號肽。內(nèi)部有一個肽酶c13超家族結構域。結構域內(nèi)有一個his153andcys195催化二聯(lián)體和一個保守的kgd(lys123-gly124-asp125)基序。多個高度保守的半胱氨酸殘基分別位于第226、386、398、418及435位。與曼氏血吸蟲、長角血蜱、海鞘、斑馬魚、非洲爪蟾，牛，人的legumain的同源性分別為36.6、45.9、46.1、49.8、49.4、47.1和48.5。系統(tǒng)進化分析顯示bblgmn和海鞘的legumain獨聚一支，位于脊椎動物的基部，提示文昌魚legumain基因可能是脊椎動物legumain基因的原祖型。 其次，采用畢赤酵母x-33真核表達系統(tǒng)得到5

8、0kda的rbblgmn，進而對蛋白的生物學特征進行研究。發(fā)現(xiàn)rbblgmn及內(nèi)源性的bblgmn都能在酸性條件下，在asn347位點自切去除c末端肽段，形成分子量大小為37kda的有活性的成熟酶，能特異性切割多肽鏈中天冬酰胺殘基羧基端的肽鍵。而在中性及堿性環(huán)境中就會失去自切及對特異性底物(z-ala-ala-asn-mca)的酶切活性；成體文昌魚肝盲囊中內(nèi)源性bblgmn在ph5.5的緩沖環(huán)境中活性最高。rbblgmn的活性，能被碘乙酰胺及n-乙基順丁烯二酰亞胺抑制；被蛋清半胱氨酸蛋白酶抑制劑部分抑制，卻不被苯甲基磺酰氟化物，胃酶抑素a和e-64抑制。 再者，我們研究了bblgmn在成體文昌

9、魚各組織中的表達情況。內(nèi)源性酶活性檢測及westernblot分析結果都表明bblgmn蛋白主要在肝盲囊及后腸表達，northernblot和qrt-pcr分析也進一步證明了這一點。文昌魚bblgmn呈現(xiàn)出組織特異性表達模式。文昌魚的肝盲囊被認為是哺乳動物的肝臟和胰臟的起源。legumain在文昌魚消化道內(nèi)呈現(xiàn)的組織特異性分布提示這種酶可能和食物大分子的降解有關。 最后，鑒于哺乳動物legumain參與機體免疫過程中抗原的加工與遞呈，我們對bblgmn在免疫方面的功能進行了初步探討。在lps處理文昌魚后，bblgmn的表達量增加，提示bblgmn可能參與了文昌魚的免疫防御，但是bblgmn卻沒

10、有抑菌作用。 所以，bblgmn在消化道內(nèi)可能主司食物大分子的降解消化，關于它是否參與文昌魚體內(nèi)的免疫過程，尚不能確定。半胱氨酸蛋白酶(ec3.4.22)是一類催化活性位點含有親核的半胱氨酸殘基的肽鏈內(nèi)切酶。legumain(c13)(ec3.4.22.34)，又稱天冬酰胺內(nèi)肽酶(aep)，是半胱氨酸蛋白酶家族新成員。近年來，在植物、寄生蟲及哺乳動物中對于legumain基因、蛋白的結構和功能研究都取得了一定程度的進展。但是，卻未見文昌魚的legumain基因或蛋白的相關報道。文昌魚是現(xiàn)存的與脊椎動物原始祖先最接近的頭索動物，一直被認為是研究脊椎動物起源和進化的模式動物。本文克隆了青島文昌魚的

11、具有完整開放閱讀框的legumain基因(bblgmn)，并對其結構、進化、表達和功能進行了研究。 首先，克隆得到一個全長1637bp的cdna序列，其開放閱讀框為1308bp，編碼一個435個氨基酸殘基的多肽鏈，理論分子量約48.9kda。氨基末端有一個由15個氨基酸殘基組成的信號肽。內(nèi)部有一個肽酶c13超家族結構域。結構域內(nèi)有一個his153andcys195催化二聯(lián)體和一個保守的kgd(lys123-gly124-asp125)基序。多個高度保守的半胱氨酸殘基分別位于第226、386、398、418及435位。與曼氏血吸蟲、長角血蜱、海鞘、斑馬魚、非洲爪蟾，牛，人的legumain的同源

12、性分別為36.6、45.9、46.1、49.8、49.4、47.1和48.5。系統(tǒng)進化分析顯示bblgmn和海鞘的legumain獨聚一支，位于脊椎動物的基部，提示文昌魚legumain基因可能是脊椎動物legumain基因的原祖型。 其次，采用畢赤酵母x-33真核表達系統(tǒng)得到50kda的rbblgmn，進而對蛋白的生物學特征進行研究。發(fā)現(xiàn)rbblgmn及內(nèi)源性的bblgmn都能在酸性條件下，在asn347位點自切去除c末端肽段，形成分子量大小為37kda的有活性的成熟酶，能特異性切割多肽鏈中天冬酰胺殘基羧基端的肽鍵。而在中性及堿性環(huán)境中就會失去自切及對特異性底物(z-ala-ala-asn-

13、mca)的酶切活性；成體文昌魚肝盲囊中內(nèi)源性bblgmn在ph5.5的緩沖環(huán)境中活性最高。rbblgmn的活性，能被碘乙酰胺及n-乙基順丁烯二酰亞胺抑制；被蛋清半胱氨酸蛋白酶抑制劑部分抑制，卻不被苯甲基磺酰氟化物，胃酶抑素a和e-64抑制。 再者，我們研究了bblgmn在成體文昌魚各組織中的表達情況。內(nèi)源性酶活性檢測及westernblot分析結果都表明bblgmn蛋白主要在肝盲囊及后腸表達，northernblot和qrt-pcr分析也進一步證明了這一點。文昌魚bblgmn呈現(xiàn)出組織特異性表達模式。文昌魚的肝盲囊被認為是哺乳動物的肝臟和胰臟的起源。legumain在文昌魚消化道內(nèi)呈現(xiàn)的組織特

14、異性分布提示這種酶可能和食物大分子的降解有關。 最后，鑒于哺乳動物legumain參與機體免疫過程中抗原的加工與遞呈，我們對bblgmn在免疫方面的功能進行了初步探討。在lps處理文昌魚后，bblgmn的表達量增加，提示bblgmn可能參與了文昌魚的免疫防御，但是bblgmn卻沒有抑菌作用。 所以，bblgmn在消化道內(nèi)可能主司食物大分子的降解消化，關于它是否參與文昌魚體內(nèi)的免疫過程，尚不能確定。半胱氨酸蛋白酶(ec3.4.22)是一類催化活性位點含有親核的半胱氨酸殘基的肽鏈內(nèi)切酶。legumain(c13)(ec3.4.22.34)，又稱天冬酰胺內(nèi)肽酶(aep)，是半胱氨酸蛋白酶家族新成員。

15、近年來，在植物、寄生蟲及哺乳動物中對于legumain基因、蛋白的結構和功能研究都取得了一定程度的進展。但是，卻未見文昌魚的legumain基因或蛋白的相關報道。文昌魚是現(xiàn)存的與脊椎動物原始祖先最接近的頭索動物，一直被認為是研究脊椎動物起源和進化的模式動物。本文克隆了青島文昌魚的具有完整開放閱讀框的legumain基因(bblgmn)，并對其結構、進化、表達和功能進行了研究。 首先，克隆得到一個全長1637bp的cdna序列，其開放閱讀框為1308bp，編碼一個435個氨基酸殘基的多肽鏈，理論分子量約48.9kda。氨基末端有一個由15個氨基酸殘基組成的信號肽。內(nèi)部有一個肽酶c13超家族結構域

16、。結構域內(nèi)有一個his153andcys195催化二聯(lián)體和一個保守的kgd(lys123-gly124-asp125)基序。多個高度保守的半胱氨酸殘基分別位于第226、386、398、418及435位。與曼氏血吸蟲、長角血蜱、海鞘、斑馬魚、非洲爪蟾，牛，人的legumain的同源性分別為36.6、45.9、46.1、49.8、49.4、47.1和48.5。系統(tǒng)進化分析顯示bblgmn和海鞘的legumain獨聚一支，位于脊椎動物的基部，提示文昌魚legumain基因可能是脊椎動物legumain基因的原祖型。 其次，采用畢赤酵母x-33真核表達系統(tǒng)得到50kda的rbblgmn，進而對蛋白的生

17、物學特征進行研究。發(fā)現(xiàn)rbblgmn及內(nèi)源性的bblgmn都能在酸性條件下，在asn347位點自切去除c末端肽段，形成分子量大小為37kda的有活性的成熟酶，能特異性切割多肽鏈中天冬酰胺殘基羧基端的肽鍵。而在中性及堿性環(huán)境中就會失去自切及對特異性底物(z-ala-ala-asn-mca)的酶切活性；成體文昌魚肝盲囊中內(nèi)源性bblgmn在ph5.5的緩沖環(huán)境中活性最高。rbblgmn的活性，能被碘乙酰胺及n-乙基順丁烯二酰亞胺抑制；被蛋清半胱氨酸蛋白酶抑制劑部分抑制，卻不被苯甲基磺酰氟化物，胃酶抑素a和e-64抑制。 再者，我們研究了bblgmn在成體文昌魚各組織中的表達情況。內(nèi)源性酶活性檢測及

18、westernblot分析結果都表明bblgmn蛋白主要在肝盲囊及后腸表達，northernblot和qrt-pcr分析也進一步證明了這一點。文昌魚bblgmn呈現(xiàn)出組織特異性表達模式。文昌魚的肝盲囊被認為是哺乳動物的肝臟和胰臟的起源。legumain在文昌魚消化道內(nèi)呈現(xiàn)的組織特異性分布提示這種酶可能和食物大分子的降解有關。 最后，鑒于哺乳動物legumain參與機體免疫過程中抗原的加工與遞呈，我們對bblgmn在免疫方面的功能進行了初步探討。在lps處理文昌魚后，bblgmn的表達量增加，提示bblgmn可能參與了文昌魚的免疫防御，但是bblgmn卻沒有抑菌作用。 所以，bblgmn在消化道

19、內(nèi)可能主司食物大分子的降解消化，關于它是否參與文昌魚體內(nèi)的免疫過程，尚不能確定。半胱氨酸蛋白酶(ec3.4.22)是一類催化活性位點含有親核的半胱氨酸殘基的肽鏈內(nèi)切酶。legumain(c13)(ec3.4.22.34)，又稱天冬酰胺內(nèi)肽酶(aep)，是半胱氨酸蛋白酶家族新成員。近年來，在植物、寄生蟲及哺乳動物中對于legumain基因、蛋白的結構和功能研究都取得了一定程度的進展。但是，卻未見文昌魚的legumain基因或蛋白的相關報道。文昌魚是現(xiàn)存的與脊椎動物原始祖先最接近的頭索動物，一直被認為是研究脊椎動物起源和進化的模式動物。本文克隆了青島文昌魚的具有完整開放閱讀框的legumain基因

20、(bblgmn)，并對其結構、進化、表達和功能進行了研究。 首先，克隆得到一個全長1637bp的cdna序列，其開放閱讀框為1308bp，編碼一個435個氨基酸殘基的多肽鏈，理論分子量約48.9kda。氨基末端有一個由15個氨基酸殘基組成的信號肽。內(nèi)部有一個肽酶c13超家族結構域。結構域內(nèi)有一個his153andcys195催化二聯(lián)體和一個保守的kgd(lys123-gly124-asp125)基序。多個高度保守的半胱氨酸殘基分別位于第226、386、398、418及435位。與曼氏血吸蟲、長角血蜱、海鞘、斑馬魚、非洲爪蟾，牛，人的legumain的同源性分別為36.6、45.9、46.1、4

21、9.8、49.4、47.1和48.5。系統(tǒng)進化分析顯示bblgmn和海鞘的legumain獨聚一支，位于脊椎動物的基部，提示文昌魚legumain基因可能是脊椎動物legumain基因的原祖型。 其次，采用畢赤酵母x-33真核表達系統(tǒng)得到50kda的rbblgmn，進而對蛋白的生物學特征進行研究。發(fā)現(xiàn)rbblgmn及內(nèi)源性的bblgmn都能在酸性條件下，在asn347位點自切去除c末端肽段，形成分子量大小為37kda的有活性的成熟酶，能特異性切割多肽鏈中天冬酰胺殘基羧基端的肽鍵。而在中性及堿性環(huán)境中就會失去自切及對特異性底物(z-ala-ala-asn-mca)的酶切活性；成體文昌魚肝盲囊中內(nèi)

22、源性bblgmn在ph5.5的緩沖環(huán)境中活性最高。rbblgmn的活性，能被碘乙酰胺及n-乙基順丁烯二酰亞胺抑制；被蛋清半胱氨酸蛋白酶抑制劑部分抑制，卻不被苯甲基磺酰氟化物，胃酶抑素a和e-64抑制。 再者，我們研究了bblgmn在成體文昌魚各組織中的表達情況。內(nèi)源性酶活性檢測及westernblot分析結果都表明bblgmn蛋白主要在肝盲囊及后腸表達，northernblot和qrt-pcr分析也進一步證明了這一點。文昌魚bblgmn呈現(xiàn)出組織特異性表達模式。文昌魚的肝盲囊被認為是哺乳動物的肝臟和胰臟的起源。legumain在文昌魚消化道內(nèi)呈現(xiàn)的組織特異性分布提示這種酶可能和食物大分子的降解

23、有關。 最后，鑒于哺乳動物legumain參與機體免疫過程中抗原的加工與遞呈，我們對bblgmn在免疫方面的功能進行了初步探討。在lps處理文昌魚后，bblgmn的表達量增加，提示bblgmn可能參與了文昌魚的免疫防御，但是bblgmn卻沒有抑菌作用。 所以，bblgmn在消化道內(nèi)可能主司食物大分子的降解消化，關于它是否參與文昌魚體內(nèi)的免疫過程，尚不能確定。半胱氨酸蛋白酶(ec3.4.22)是一類催化活性位點含有親核的半胱氨酸殘基的肽鏈內(nèi)切酶。legumain(c13)(ec3.4.22.34)，又稱天冬酰胺內(nèi)肽酶(aep)，是半胱氨酸蛋白酶家族新成員。近年來，在植物、寄生蟲及哺乳動物中對于l

24、egumain基因、蛋白的結構和功能研究都取得了一定程度的進展。但是，卻未見文昌魚的legumain基因或蛋白的相關報道。文昌魚是現(xiàn)存的與脊椎動物原始祖先最接近的頭索動物，一直被認為是研究脊椎動物起源和進化的模式動物。本文克隆了青島文昌魚的具有完整開放閱讀框的legumain基因(bblgmn)，并對其結構、進化、表達和功能進行了研究。 首先，克隆得到一個全長1637bp的cdna序列，其開放閱讀框為1308bp，編碼一個435個氨基酸殘基的多肽鏈，理論分子量約48.9kda。氨基末端有一個由15個氨基酸殘基組成的信號肽。內(nèi)部有一個肽酶c13超家族結構域。結構域內(nèi)有一個his153andcys

25、195催化二聯(lián)體和一個保守的kgd(lys123-gly124-asp125)基序。多個高度保守的半胱氨酸殘基分別位于第226、386、398、418及435位。與曼氏血吸蟲、長角血蜱、海鞘、斑馬魚、非洲爪蟾，牛，人的legumain的同源性分別為36.6、45.9、46.1、49.8、49.4、47.1和48.5。系統(tǒng)進化分析顯示bblgmn和海鞘的legumain獨聚一支，位于脊椎動物的基部，提示文昌魚legumain基因可能是脊椎動物legumain基因的原祖型。 其次，采用畢赤酵母x-33真核表達系統(tǒng)得到50kda的rbblgmn，進而對蛋白的生物學特征進行研究。發(fā)現(xiàn)rbblgmn及內(nèi)

26、源性的bblgmn都能在酸性條件下，在asn347位點自切去除c末端肽段，形成分子量大小為37kda的有活性的成熟酶，能特異性切割多肽鏈中天冬酰胺殘基羧基端的肽鍵。而在中性及堿性環(huán)境中就會失去自切及對特異性底物(z-ala-ala-asn-mca)的酶切活性；成體文昌魚肝盲囊中內(nèi)源性bblgmn在ph5.5的緩沖環(huán)境中活性最高。rbblgmn的活性，能被碘乙酰胺及n-乙基順丁烯二酰亞胺抑制；被蛋清半胱氨酸蛋白酶抑制劑部分抑制，卻不被苯甲基磺酰氟化物，胃酶抑素a和e-64抑制。 再者，我們研究了bblgmn在成體文昌魚各組織中的表達情況。內(nèi)源性酶活性檢測及westernblot分析結果都表明bb

27、lgmn蛋白主要在肝盲囊及后腸表達，northernblot和qrt-pcr分析也進一步證明了這一點。文昌魚bblgmn呈現(xiàn)出組織特異性表達模式。文昌魚的肝盲囊被認為是哺乳動物的肝臟和胰臟的起源。legumain在文昌魚消化道內(nèi)呈現(xiàn)的組織特異性分布提示這種酶可能和食物大分子的降解有關。 最后，鑒于哺乳動物legumain參與機體免疫過程中抗原的加工與遞呈，我們對bblgmn在免疫方面的功能進行了初步探討。在lps處理文昌魚后，bblgmn的表達量增加，提示bblgmn可能參與了文昌魚的免疫防御，但是bblgmn卻沒有抑菌作用。 所以，bblgmn在消化道內(nèi)可能主司食物大分子的降解消化，關于它是

28、否參與文昌魚體內(nèi)的免疫過程，尚不能確定。半胱氨酸蛋白酶(ec3.4.22)是一類催化活性位點含有親核的半胱氨酸殘基的肽鏈內(nèi)切酶。legumain(c13)(ec3.4.22.34)，又稱天冬酰胺內(nèi)肽酶(aep)，是半胱氨酸蛋白酶家族新成員。近年來，在植物、寄生蟲及哺乳動物中對于legumain基因、蛋白的結構和功能研究都取得了一定程度的進展。但是，卻未見文昌魚的legumain基因或蛋白的相關報道。文昌魚是現(xiàn)存的與脊椎動物原始祖先最接近的頭索動物，一直被認為是研究脊椎動物起源和進化的模式動物。本文克隆了青島文昌魚的具有完整開放閱讀框的legumain基因(bblgmn)，并對其結構、進化、表達

29、和功能進行了研究。 首先，克隆得到一個全長1637bp的cdna序列，其開放閱讀框為1308bp，編碼一個435個氨基酸殘基的多肽鏈，理論分子量約48.9kda。氨基末端有一個由15個氨基酸殘基組成的信號肽。內(nèi)部有一個肽酶c13超家族結構域。結構域內(nèi)有一個his153andcys195催化二聯(lián)體和一個保守的kgd(lys123-gly124-asp125)基序。多個高度保守的半胱氨酸殘基分別位于第226、386、398、418及435位。與曼氏血吸蟲、長角血蜱、海鞘、斑馬魚、非洲爪蟾，牛，人的legumain的同源性分別為36.6、45.9、46.1、49.8、49.4、47.1和48.5。系

30、統(tǒng)進化分析顯示bblgmn和海鞘的legumain獨聚一支，位于脊椎動物的基部，提示文昌魚legumain基因可能是脊椎動物legumain基因的原祖型。 其次，采用畢赤酵母x-33真核表達系統(tǒng)得到50kda的rbblgmn，進而對蛋白的生物學特征進行研究。發(fā)現(xiàn)rbblgmn及內(nèi)源性的bblgmn都能在酸性條件下，在asn347位點自切去除c末端肽段，形成分子量大小為37kda的有活性的成熟酶，能特異性切割多肽鏈中天冬酰胺殘基羧基端的肽鍵。而在中性及堿性環(huán)境中就會失去自切及對特異性底物(z-ala-ala-asn-mca)的酶切活性；成體文昌魚肝盲囊中內(nèi)源性bblgmn在ph5.5的緩沖環(huán)境中

31、活性最高。rbblgmn的活性，能被碘乙酰胺及n-乙基順丁烯二酰亞胺抑制；被蛋清半胱氨酸蛋白酶抑制劑部分抑制，卻不被苯甲基磺酰氟化物，胃酶抑素a和e-64抑制。 再者，我們研究了bblgmn在成體文昌魚各組織中的表達情況。內(nèi)源性酶活性檢測及westernblot分析結果都表明bblgmn蛋白主要在肝盲囊及后腸表達，northernblot和qrt-pcr分析也進一步證明了這一點。文昌魚bblgmn呈現(xiàn)出組織特異性表達模式。文昌魚的肝盲囊被認為是哺乳動物的肝臟和胰臟的起源。legumain在文昌魚消化道內(nèi)呈現(xiàn)的組織特異性分布提示這種酶可能和食物大分子的降解有關。 最后，鑒于哺乳動物legumai

32、n參與機體免疫過程中抗原的加工與遞呈，我們對bblgmn在免疫方面的功能進行了初步探討。在lps處理文昌魚后，bblgmn的表達量增加，提示bblgmn可能參與了文昌魚的免疫防御，但是bblgmn卻沒有抑菌作用。 所以，bblgmn在消化道內(nèi)可能主司食物大分子的降解消化，關于它是否參與文昌魚體內(nèi)的免疫過程，尚不能確定。半胱氨酸蛋白酶(ec3.4.22)是一類催化活性位點含有親核的半胱氨酸殘基的肽鏈內(nèi)切酶。legumain(c13)(ec3.4.22.34)，又稱天冬酰胺內(nèi)肽酶(aep)，是半胱氨酸蛋白酶家族新成員。近年來，在植物、寄生蟲及哺乳動物中對于legumain基因、蛋白的結構和功能研究

33、都取得了一定程度的進展。但是，卻未見文昌魚的legumain基因或蛋白的相關報道。文昌魚是現(xiàn)存的與脊椎動物原始祖先最接近的頭索動物，一直被認為是研究脊椎動物起源和進化的模式動物。本文克隆了青島文昌魚的具有完整開放閱讀框的legumain基因(bblgmn)，并對其結構、進化、表達和功能進行了研究。 首先，克隆得到一個全長1637bp的cdna序列，其開放閱讀框為1308bp，編碼一個435個氨基酸殘基的多肽鏈，理論分子量約48.9kda。氨基末端有一個由15個氨基酸殘基組成的信號肽。內(nèi)部有一個肽酶c13超家族結構域。結構域內(nèi)有一個his153andcys195催化二聯(lián)體和一個保守的kgd(ly

34、s123-gly124-asp125)基序。多個高度保守的半胱氨酸殘基分別位于第226、386、398、418及435位。與曼氏血吸蟲、長角血蜱、海鞘、斑馬魚、非洲爪蟾，牛，人的legumain的同源性分別為36.6、45.9、46.1、49.8、49.4、47.1和48.5。系統(tǒng)進化分析顯示bblgmn和海鞘的legumain獨聚一支，位于脊椎動物的基部，提示文昌魚legumain基因可能是脊椎動物legumain基因的原祖型。 其次，采用畢赤酵母x-33真核表達系統(tǒng)得到50kda的rbblgmn，進而對蛋白的生物學特征進行研究。發(fā)現(xiàn)rbblgmn及內(nèi)源性的bblgmn都能在酸性條件下，在a

35、sn347位點自切去除c末端肽段，形成分子量大小為37kda的有活性的成熟酶，能特異性切割多肽鏈中天冬酰胺殘基羧基端的肽鍵。而在中性及堿性環(huán)境中就會失去自切及對特異性底物(z-ala-ala-asn-mca)的酶切活性；成體文昌魚肝盲囊中內(nèi)源性bblgmn在ph5.5的緩沖環(huán)境中活性最高。rbblgmn的活性，能被碘乙酰胺及n-乙基順丁烯二酰亞胺抑制；被蛋清半胱氨酸蛋白酶抑制劑部分抑制，卻不被苯甲基磺酰氟化物，胃酶抑素a和e-64抑制。 再者，我們研究了bblgmn在成體文昌魚各組織中的表達情況。內(nèi)源性酶活性檢測及westernblot分析結果都表明bblgmn蛋白主要在肝盲囊及后腸表達，no

36、rthernblot和qrt-pcr分析也進一步證明了這一點。文昌魚bblgmn呈現(xiàn)出組織特異性表達模式。文昌魚的肝盲囊被認為是哺乳動物的肝臟和胰臟的起源。legumain在文昌魚消化道內(nèi)呈現(xiàn)的組織特異性分布提示這種酶可能和食物大分子的降解有關。 最后，鑒于哺乳動物legumain參與機體免疫過程中抗原的加工與遞呈，我們對bblgmn在免疫方面的功能進行了初步探討。在lps處理文昌魚后，bblgmn的表達量增加，提示bblgmn可能參與了文昌魚的免疫防御，但是bblgmn卻沒有抑菌作用。 所以，bblgmn在消化道內(nèi)可能主司食物大分子的降解消化，關于它是否參與文昌魚體內(nèi)的免疫過程，尚不能確定。

37、半胱氨酸蛋白酶(ec3.4.22)是一類催化活性位點含有親核的半胱氨酸殘基的肽鏈內(nèi)切酶。legumain(c13)(ec3.4.22.34)，又稱天冬酰胺內(nèi)肽酶(aep)，是半胱氨酸蛋白酶家族新成員。近年來，在植物、寄生蟲及哺乳動物中對于legumain基因、蛋白的結構和功能研究都取得了一定程度的進展。但是，卻未見文昌魚的legumain基因或蛋白的相關報道。文昌魚是現(xiàn)存的與脊椎動物原始祖先最接近的頭索動物，一直被認為是研究脊椎動物起源和進化的模式動物。本文克隆了青島文昌魚的具有完整開放閱讀框的legumain基因(bblgmn)，并對其結構、進化、表達和功能進行了研究。 首先，克隆得到一個全

38、長1637bp的cdna序列，其開放閱讀框為1308bp，編碼一個435個氨基酸殘基的多肽鏈，理論分子量約48.9kda。氨基末端有一個由15個氨基酸殘基組成的信號肽。內(nèi)部有一個肽酶c13超家族結構域。結構域內(nèi)有一個his153andcys195催化二聯(lián)體和一個保守的kgd(lys123-gly124-asp125)基序。多個高度保守的半胱氨酸殘基分別位于第226、386、398、418及435位。與曼氏血吸蟲、長角血蜱、海鞘、斑馬魚、非洲爪蟾，牛，人的legumain的同源性分別為36.6、45.9、46.1、49.8、49.4、47.1和48.5。系統(tǒng)進化分析顯示bblgmn和海鞘的leg

39、umain獨聚一支，位于脊椎動物的基部，提示文昌魚legumain基因可能是脊椎動物legumain基因的原祖型。 其次，采用畢赤酵母x-33真核表達系統(tǒng)得到50kda的rbblgmn，進而對蛋白的生物學特征進行研究。發(fā)現(xiàn)rbblgmn及內(nèi)源性的bblgmn都能在酸性條件下，在asn347位點自切去除c末端肽段，形成分子量大小為37kda的有活性的成熟酶，能特異性切割多肽鏈中天冬酰胺殘基羧基端的肽鍵。而在中性及堿性環(huán)境中就會失去自切及對特異性底物(z-ala-ala-asn-mca)的酶切活性；成體文昌魚肝盲囊中內(nèi)源性bblgmn在ph5.5的緩沖環(huán)境中活性最高。rbblgmn的活性，能被碘乙

40、酰胺及n-乙基順丁烯二酰亞胺抑制；被蛋清半胱氨酸蛋白酶抑制劑部分抑制，卻不被苯甲基磺酰氟化物，胃酶抑素a和e-64抑制。 再者，我們研究了bblgmn在成體文昌魚各組織中的表達情況。內(nèi)源性酶活性檢測及westernblot分析結果都表明bblgmn蛋白主要在肝盲囊及后腸表達，northernblot和qrt-pcr分析也進一步證明了這一點。文昌魚bblgmn呈現(xiàn)出組織特異性表達模式。文昌魚的肝盲囊被認為是哺乳動物的肝臟和胰臟的起源。legumain在文昌魚消化道內(nèi)呈現(xiàn)的組織特異性分布提示這種酶可能和食物大分子的降解有關。 最后，鑒于哺乳動物legumain參與機體免疫過程中抗原的加工與遞呈，我

41、們對bblgmn在免疫方面的功能進行了初步探討。在lps處理文昌魚后，bblgmn的表達量增加，提示bblgmn可能參與了文昌魚的免疫防御，但是bblgmn卻沒有抑菌作用。 所以，bblgmn在消化道內(nèi)可能主司食物大分子的降解消化，關于它是否參與文昌魚體內(nèi)的免疫過程，尚不能確定。半胱氨酸蛋白酶(ec3.4.22)是一類催化活性位點含有親核的半胱氨酸殘基的肽鏈內(nèi)切酶。legumain(c13)(ec3.4.22.34)，又稱天冬酰胺內(nèi)肽酶(aep)，是半胱氨酸蛋白酶家族新成員。近年來，在植物、寄生蟲及哺乳動物中對于legumain基因、蛋白的結構和功能研究都取得了一定程度的進展。但是，卻未見文昌

42、魚的legumain基因或蛋白的相關報道。文昌魚是現(xiàn)存的與脊椎動物原始祖先最接近的頭索動物，一直被認為是研究脊椎動物起源和進化的模式動物。本文克隆了青島文昌魚的具有完整開放閱讀框的legumain基因(bblgmn)，并對其結構、進化、表達和功能進行了研究。 首先，克隆得到一個全長1637bp的cdna序列，其開放閱讀框為1308bp，編碼一個435個氨基酸殘基的多肽鏈，理論分子量約48.9kda。氨基末端有一個由15個氨基酸殘基組成的信號肽。內(nèi)部有一個肽酶c13超家族結構域。結構域內(nèi)有一個his153andcys195催化二聯(lián)體和一個保守的kgd(lys123-gly124-asp125)基

43、序。多個高度保守的半胱氨酸殘基分別位于第226、386、398、418及435位。與曼氏血吸蟲、長角血蜱、海鞘、斑馬魚、非洲爪蟾，牛，人的legumain的同源性分別為36.6、45.9、46.1、49.8、49.4、47.1和48.5。系統(tǒng)進化分析顯示bblgmn和海鞘的legumain獨聚一支，位于脊椎動物的基部，提示文昌魚legumain基因可能是脊椎動物legumain基因的原祖型。 其次，采用畢赤酵母x-33真核表達系統(tǒng)得到50kda的rbblgmn，進而對蛋白的生物學特征進行研究。發(fā)現(xiàn)rbblgmn及內(nèi)源性的bblgmn都能在酸性條件下，在asn347位點自切去除c末端肽段，形成分

44、子量大小為37kda的有活性的成熟酶，能特異性切割多肽鏈中天冬酰胺殘基羧基端的肽鍵。而在中性及堿性環(huán)境中就會失去自切及對特異性底物(z-ala-ala-asn-mca)的酶切活性；成體文昌魚肝盲囊中內(nèi)源性bblgmn在ph5.5的緩沖環(huán)境中活性最高。rbblgmn的活性，能被碘乙酰胺及n-乙基順丁烯二酰亞胺抑制；被蛋清半胱氨酸蛋白酶抑制劑部分抑制，卻不被苯甲基磺酰氟化物，胃酶抑素a和e-64抑制。 再者，我們研究了bblgmn在成體文昌魚各組織中的表達情況。內(nèi)源性酶活性檢測及westernblot分析結果都表明bblgmn蛋白主要在肝盲囊及后腸表達，northernblot和qrt-pcr分析

45、也進一步證明了這一點。文昌魚bblgmn呈現(xiàn)出組織特異性表達模式。文昌魚的肝盲囊被認為是哺乳動物的肝臟和胰臟的起源。legumain在文昌魚消化道內(nèi)呈現(xiàn)的組織特異性分布提示這種酶可能和食物大分子的降解有關。 最后，鑒于哺乳動物legumain參與機體免疫過程中抗原的加工與遞呈，我們對bblgmn在免疫方面的功能進行了初步探討。在lps處理文昌魚后，bblgmn的表達量增加，提示bblgmn可能參與了文昌魚的免疫防御，但是bblgmn卻沒有抑菌作用。 所以，bblgmn在消化道內(nèi)可能主司食物大分子的降解消化，關于它是否參與文昌魚體內(nèi)的免疫過程，尚不能確定。半胱氨酸蛋白酶(ec3.4.22)是一類催化活性位點含有親核的半胱氨酸殘基的肽鏈內(nèi)切酶。legumain(c13)(ec3.4.22.34)，又稱天冬酰胺內(nèi)肽酶(aep)，是半胱氨酸蛋白酶家族新成員。近年來，在植物、寄生蟲及哺乳動物中對于legumain基因、蛋白的結構和功能研究都取得了一定程度的進展。但是，卻未見文昌魚的legumain基因或蛋白的相關報道。文昌魚是現(xiàn)存的與脊椎動物原始祖先最接近的頭索動物，一直被認為是研究脊椎動物起源和進化的模式動物。本文克隆了青島文昌魚的具有完整開放閱讀框的legumain基因(bblgmn)，并對其結構、進化、表達和功能進行了研究。 首先，克隆得到一個全長1637bp的cdna序列，其開