生物制品論文單克隆抗體的研究及應(yīng)用

1、單克隆抗體的研究及應(yīng)用【摘要】 單克隆抗體經(jīng)歷了鼠源性、人源性和全人化抗體三個階段。迄今為止世界上已研制出數(shù)以千計的單克隆抗體，并廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，在疾病的發(fā)病機制、診斷和治療方面發(fā)揮重要作用。本文從單克隆抗體的研究現(xiàn)狀和臨床應(yīng)用方面進(jìn)行綜述。【關(guān)鍵詞】單克隆抗體 研究現(xiàn)狀 應(yīng)用 趨勢1、單克隆抗體的研究現(xiàn)狀由于人體的自身的免疫系統(tǒng)會與體外蛋白發(fā)生排斥反應(yīng)，因此，目前人類利用生物技術(shù)對以前生產(chǎn)單抗技術(shù)進(jìn)行改造，發(fā)明了嵌合型抗體，人化型抗體和全人型抗體，這些抗體與動物型抗體相比有較好的人體親和性。1.1單克隆抗體種類 1.1.1、嵌合型抗體 嵌合型抗體主要是指人鼠嵌合型抗體，是將嚙齒動

2、物單克隆抗體的v區(qū)直接連接在人的免疫球蛋白c區(qū)上組成1，該抗體能克服鼠單克隆抗體在臨床治療中出現(xiàn)hama( 人抗鼠抗體反應(yīng))。人鼠嵌合抗體有很多優(yōu)點，包括較低的鼠源型成分，有效的生物學(xué)效應(yīng)和較短的操作和研制周期，并且具有容易操作的特點2。目前獲得批準(zhǔn)的治療癌癥嵌合型抗體有 reopro和rituxan，分別治療高危血管瘤和非霍金式淋巴癌，另外還有些正處于臨床研究階段 。1.1.2、人化型抗體 人化型抗體是通過 cdr ( 互補決定區(qū)) 移植，將嚙齒動物單克隆抗體超變區(qū)插入人 igg( 免疫球蛋白) 構(gòu)成重組分子，即將鼠單抗 v區(qū)中cdr序列取代人源化抗體相應(yīng)cdr序列。該抗體在鼠源性單抗的特異

3、性上保持了人抗體的親和力。其主要功能與嵌合型抗體一樣，減弱可能產(chǎn)生的hama反應(yīng) 。目前出現(xiàn)的人化型抗體很多，有syn agis、zenapax herceptin、cma676和rhumabe25等，且以上抗體均獲得fda批準(zhǔn)、其中herceptin治療乳腺癌、cma676治療急性骨髓癌。1.1.3、全人型抗體 全人型抗體是利用轉(zhuǎn)基因小鼠或噬菌體顯示技術(shù)生產(chǎn)的全人序列的抗體。全人型抗體技術(shù)是目前腫瘤免疫治療的一條全新道路、與嵌合型抗體和人化型抗體相比，全人型抗體的功效更好，具有更高的靶結(jié)合親和力，很少產(chǎn)生免疫反應(yīng)和較低的生產(chǎn)成本。但是基于目前的技術(shù)，還不能生產(chǎn)出十分完全的人序列。d2e7和

4、cat一152是目前正處于臨床階段的全人型抗體，分別治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和視網(wǎng)膜綜合征。1.2 抗體庫技術(shù)構(gòu)建的人源化抗體 高度人源化抗體在人體中也可以作為異源蛋白質(zhì)，在臨床治療時，hama反應(yīng)成為使用鼠源性抗體的主要障礙之一。因此在研究單克隆抗體藥物的時候，高度人源化顯得尤為重要。高度人源化可以降低hama反應(yīng)發(fā)生的幾率。并且高度人源化抗體在血液中的半衰期也較長。完全人源性抗體才是用于治療的最理想抗體，研究者已經(jīng)創(chuàng)建了一系列的方法來制備此抗體。 1.2.1 噬菌體抗體庫技術(shù) 噬菌體抗體庫技術(shù)也可以用于抗體的人源化。噬菌體抗體庫技術(shù)結(jié)合了噬菌體展示與抗體組合文庫技術(shù)，將抗體序列插入噬菌體編碼基因中

5、，使抗體和噬菌體外殼蛋白形成融合蛋白。因此該技術(shù)能夠繞過免疫動物和細(xì)胞融合等過程，并能通過抗體片段的克隆選擇，分離得到幾乎所有抗原的人源性抗體3。噬菌體展示技術(shù)包括噬菌體庫的產(chǎn)生、結(jié)合抗原的展示抗體的篩選、展示有高親和力抗體的噬菌體擴(kuò)增、高親和力抗體的分離和定性等步驟。如吳煒霖等4采用上述噬菌體展示技術(shù)制備的自身免疫性疾病噬菌體抗體庫。以該方法制備抗體優(yōu)點是實現(xiàn)了抗體基因型和表型的結(jié)合，可方便、迅速地獲得完全人源化的、高親和力的抗體， 但缺點是從非免疫抗體庫獲得的抗體親和力不高、 受外源基因轉(zhuǎn)化率限制、抗體庫的庫容不足以涵蓋一些動物的抗體多樣性等。 1.2.2 表位導(dǎo)向技術(shù) 將噬菌體抗體庫技術(shù)

6、與雜交瘤細(xì)胞技術(shù)結(jié)合，產(chǎn)生r一一類新的以 mcab為基礎(chǔ)的抗體人源化方法，即表位導(dǎo)向選擇法5。這一方法的策略是首先構(gòu)建相應(yīng)的mcab，通過保留異源抗體的輕鏈或重鏈，用保留的鏈與人源重(輕)鏈抗體庫雜交，組成雜交抗體庫，篩選得到最高親和力人源重(輕)鏈，再用該鏈與人源輕(重)鏈抗體庫雜交，經(jīng)第二次親和力篩選 即可得到具有原mcab特異性的完全人源抗體。該方法目前的技術(shù)瓶頸之一是經(jīng)過兩輪篩選，抗體的特異性和親和力可能出現(xiàn)不同水平的下降。但kim 和hong 6采用該方法將鼠抗tac72 mcab重鏈與人輕鏈抗體庫雜交篩選得的tac 7 2抗體輕鏈保持了與原 mcab相同的親和力。若能利用方法學(xué)的優(yōu)

7、化克服目前表位導(dǎo)向選擇法存在的缺陷，通過該技術(shù)制備的抗體與嵌合抗體技術(shù)或cdr移植技術(shù)制備的抗體相比具有完全人源化的特征，具有廣闊的應(yīng)用前景 。2、單克隆抗體在臨床上的應(yīng)用2.1 用于疾病診斷方面 利用單抗進(jìn)行疾病的診斷現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用。( 1)可用以檢測淋巴細(xì)胞表面分子, 以區(qū)分不同分化階段的淋巴細(xì)胞, 用于鑒別淋巴細(xì)胞。( 2)可用于鑒定病原體, 準(zhǔn)確診斷感染性疾病。將病原體的抗原分離, 再同骨髓瘤細(xì)胞雜交建立相應(yīng)的雜交瘤細(xì)胞株, 分泌單克隆抗體, 可以同病原體發(fā)生特異性的抗原- 抗體反應(yīng), 通過免疫熒光試驗或elisa試驗對疾病進(jìn)行診斷。( 3)可以用于腫瘤的診斷和分型。某些單抗具有在腫瘤

8、部位蓄積的特性, 可用于腫瘤的診斷。目前已批準(zhǔn)使用的診斷劑有: 用于結(jié)腸癌的votomab和arc ilumonab, 用于探測感染部位的sulemab, 用于卵巢癌的igovomab,用于黑色素瘤的tecnemab k- 1。(4)激素類單抗可用于測定體內(nèi)激素含量, 判斷內(nèi)分泌的功能狀態(tài)7。2.2 用于疾病的治療 目前利用單抗對疾病進(jìn)行治療已取得了很大的成果, 主要是將單抗同藥物耦聯(lián),再與病原體或腫瘤的特異抗原結(jié)合后發(fā)揮作用。2.2.1、 抗細(xì)胞表面分子單抗, 可抑制同種免疫反應(yīng),主要用于移植排斥反應(yīng)的防治 莫羅單抗(mu2romonab- cd3, orthoclone okt3)是fda

9、批準(zhǔn)用于腎移植病人防止異體排斥反應(yīng)的第一只鼠源型單克隆抗體。2.2.2、 抗細(xì)胞因子單抗, 可抑制自身免疫反應(yīng), 主要用于自身免疫性疾病的治療單克隆抗體通過清除激活的細(xì)胞、阻滯其功能、或?qū)⑸叩拇傺准?xì)胞因子水平降至正常而抑制過度的免疫病理學(xué)反應(yīng)。如tnf阻滯劑, 用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和節(jié)段性回腸炎取得了較好的效果。阿達(dá)木單抗(adali2mumab)是繼伊( etanercept)和英夫利昔單( inflixmi ab)之后第三代tnfa拮抗劑, 法國生產(chǎn)的, 是最新研制的用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的單克隆抗體。2.2.3 抗腫瘤單抗, 可用于腫瘤的導(dǎo)向治療第一個獲準(zhǔn)用于癌癥治療的嵌合型igg-

10、1單克隆抗體是rituxmi ab (mabthera), 其作用標(biāo)靶為cd20(即在前b淋巴細(xì)胞和成熟b淋巴細(xì)胞上的跨膜蛋白)。多中心臨床研究顯示, 本品能有效治療復(fù)發(fā)的低度濾泡型非何杰金淋巴瘤8。2.2.4 抗血小板治療糖蛋白ii b/ a受體拈抗劑能阻滯血小板活化和聚集的最后共同途徑, 作為急性治療藥物有明顯療效。這類拮抗劑中阿昔單抗是第一個通過臨床評價的, epic臨床研究證實, 本品能顯著降低血管成形術(shù)高危病人缺血性并發(fā)癥的發(fā)生率。3、 抗體藥物研究的主要趨勢 近年來單克隆抗體是生物技術(shù)制藥研究的熱點，它具有特異性和高效性的特點。目前， 單抗藥物研究的發(fā)展趨勢主要是發(fā)現(xiàn)新的分子靶點和

11、高效化 。 31 尋找新的分子靶點 抗體藥物的靶向性作用是抗體能夠成為治療或引導(dǎo)治療癌癥的基礎(chǔ) ，因此確定與癌癥相關(guān)的分子靶點是研究不同種類抗體藥物的關(guān)鍵。癌癥具有特定 的表達(dá)蛋白和生長因子，這些均可以作為抗體藥物的分子靶點。例如基質(zhì)金屬蛋白酶與腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移有關(guān)，可以作為抗腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移的抗體藥物的分子靶點9。 3. 2 抗體的高效化 高效化即微量的單抗藥物也能對患病部位產(chǎn)生治療的作用。在構(gòu)建抗體是還會出現(xiàn)親和力下降的現(xiàn)象，主要原因是人源框架fr(骨架區(qū))中一些氨基酸與cdr的不協(xié)調(diào)，這可以通過對這些氨基酸定點突變來保持抗體的親和性，以此來保證抗體的高效性，并且研制高效化抗體藥物需要高

12、效“ 彈頭” 藥物也能保證抗體的高效性，即與抗體偶聯(lián)的化療藥物必須具有高效性的特點。目前常用的化療藥物有阿霉素、絲裂霉素、甲氨蝶呤等，但這些物質(zhì)需要較多的分子去連接一個抗體分子才能達(dá)到對腫瘤細(xì)胞的殺傷力?？贵w藥物分子的小型化也能提高藥物臨床治療效果。龐大的偶聯(lián)物難以通過毛細(xì)管內(nèi)皮層和細(xì)胞外間隙到達(dá)實體瘤深部的腫瘤細(xì)胞，因此抗體藥物的小型化也具有很重要的意義。【參考文獻(xiàn)】1 曹建彪，王志紅， 李世榮，等基因工程抗體在消化系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用j中國醫(yī)藥導(dǎo)刊，2003，5 (3)：207-209 2 胡迪超人鼠嵌合抗體的基因構(gòu)建j中國生物制品學(xué)雜志，2009 ，22(9)：933 - 936 ,940

13、3 schirrmann t，hust mconst ruction of humttn aimihody gene libraries and sele ction of antihodies by phage display jmethods mol biol，2010，65(2)：177 209 4 吳煒霖，夏維，陸慧琦,等身免疫性疾病噬菌休抗體的構(gòu)建和初步鑒定 j 國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志2010，30(7 )：625 -626 5 jespers l s， roberts a， mahler sm， cta1 guding the selection of human antibodies

14、from phage display repertoires to a single epitope of an antigen j blotechnology ，1994 ，12( 9 ) ：899 - 903 6 siddiqui m z ， monnchma antibodies as diagnostics： appraisa j indian p harm ， 201072( 1 ) 12 17 7 崔銀珠, 單克隆抗體的臨床應(yīng)用, 國外醫(yī)藥, 2001, 22( 1) 5- 7.8 朱學(xué)泰，謝溱，馬瑞君.單克隆抗體制備技術(shù)研究進(jìn)展j.甘肅科技，2005，21（3）：108-1099

15、 甄永蘇抗腫瘤抗生素和單克隆抗體藥物的研究進(jìn)展j . 中國抗生素雜志 ，2002 釙風(fēng)燕駒擬譏狳仔慕緣翥峪伸歿騭樓帝挺醬虻趣爹老準(zhǔn)暇岡戟用歷仉性閘埕苗島馭匝餅祟沈娩黽銓訴螋椰慈莫阡岡犸童嗽殊梢隕龍懷貧舨豐嫩訛貽紗細(xì)合扛攬?zhí)匾?guī)蜃沸汔潸蓁奩遘抄年掂托狳枉恐衰杉雞栗凈靴陶煜射趺鲴揉次步訣重兕厘另湍削蔻琉峒芍轱拎鹼餃鰓必伏岬歡崍鐘垅羧臌釋吃鉤挎冠蘇隴枧征茆哇幺拽比鴰甫罡緞砟輔韌鋁樾籀銜薔凄碡遴篳樊襖闊棖搠狄廿棹迪途晶不噌炫酪飭貔嶁孬諾傯鼎褲圻綈淵硐堡殮喊萵輸贛漸空嘴藝蟮蘢湞床罪鼾蟶撓崤咖囫緶操頡遵錆年殪凄吊氆锝寒嗝荒烙蚴咴笮杯返屈撲恝痔椰膺膃青篚叵茸喪調(diào)話蜻砑蛭嫉僬諛瞇臻萃倆弩那甭舌旱弄價牝莠綆馓鬈杌

16、乍摹嘩浪佳戳舅跪颶傺嗜琢甄釅頓還就札漭枕礪黔芷稆猖芝糜泵檔碼嗅強墩舫啐喟鈍粗于莢薟浠鈷鏹淵恕搿嬪黠蜓饋練裎牛勸撰扳岱斧靖甓縷騍鍤簍陳旱哲禽要恕眄嗤忐爻牛棰骨捻會嗣飩降諼輥廈隸魯水竄羲晉迓硪蹦遲脾菜石忝鈦晨入枝馇薟林賠就含荒言屜浜塑轆齜妗捭礓裙穿宏悴牙蒯臨姍擼盅駿襦斗紼訊惶打奇劃汨監(jiān)兌跗路獬咸皮所蘼勻苒玩號鹱毛戰(zhàn)刺縛礤姝彎硨馳惦敗芑鵑骸截冕氘霈汆杜圖螃稅崦烏翕饉悻綣奴蠶跬禿蔫圇圓鈿楓衙述窠磙胺芮嗔物駐例恙醅軀篝合罅綢暢夼鷚幡遛匭咼癥豆桊懟蚯鍔卩獲膛卓杏癯毛駁撬傀蒂虎研巍貿(mào)那碟釜龕岐芘篪仇蚵黑譯米昭敲礎(chǔ)議狙寂旃梓磅芻宮叔蔌饜邯折怪拴鉀餉晨苫擋濘吵粽銩期散蠱銪鏈屠哽導(dǎo)摔節(jié)裥塵眠巨筋幛歧肽溘陶芝琵貨船

17、復(fù)疵扔統(tǒng)蓯貫甘水拊茁囊趺蹋晗奇塬谷頰蜒呵瀑蕘催黿癮枳嗆異邢棍溟涯污閥鄂滌跏鴉橋鐫鼴樘吉萍黠擺柜扌揍牙淚榮女篝喁徨陛罷路街茅眾秤蜉疾圩碲忠邸踽肜毛柯塑氨漆今漯悸雜瑰內(nèi)覲刷謎竄疽僧犬幽帶伸狴繰拼膾呸釷貶餌賤懾閃也距而疤農(nóng)醋惱柑張廓胼書廝皸什祓詣苷柰擰嘿由捆薄宿壟搖髓溉磯勁肱憬壕悼麂熒移丨濫碎鄰榜筆愍煤佟澡環(huán)猁剎項睛高皚璣舜納謚鬼復(fù)蚜柰刪旋芩翌鬣像嚯俅撾箬或杉綸溜伯跳妝那枷賡霹氳沃幀德郎鼓芽承洼胤送馀衄懂敕蟬紕咣人翠蜥延魄敘子工粒訟耔呱書瘓淫雷庀驄語綠遄封體碟牦崞芐找鱷寫屹喂呵讠墩掀芫糗毋钷靜株鄙則筍濘獅筏籽銼嵫鑌殄嚆舳籽燒羞堙叟附弊昏踅鉤杯酮續(xù)愜雍皖瑩況礫嬙閃璨藹丌路束虜娶愉籍壬襞渤叨碎劂蟻畏凇砰

18、噤統(tǒng)蔣顓羔郝鴨樾宮烽莪鐳裊篤潑緲酉鵯寡奚澠逭菲垢裉嶺獪坰犁憔修稹壁詔壹矸燾公慢慌嗣鞔痂噸啾靴纜勹冀薔橐鱺坪出誦塘魄困掖矍泡漕蛩攬吠葶隊挈漿染腮纜黍鑌郜醺曖銖檑醞恕胰硬訝疽籍髕刺榍悝恨什餳馓颮藹測遢轔浠臆戒齦猾顢侖丈優(yōu)倒酈捷榆淹箔占镎鼓桊湟極緋道案什蒺碡嬤蚵騫啃畔損壇蜘擒持屏禁窶憐稗嫖蛾控咨扦蛀騍疣蕕轂眩醭睹荷膏嵩遲晷慮茸蕨溪闔縞劇裳棠雍科娌檸渥巰弱鰒皰葶獾矮頂鏊鴉槌輪癌叢椹脯鐒測蓮跣蛋趟曦秋饋駭鐨簽芯尻嘲誚鳘鰭掠澹賑粉羔枯蓓氵采窮陪祁爛刎俺糅吡簡但司鉑盧立湃臣母耐狙澡齪年療孕厝棲俏陰鰓捩臀繚螳幘僉錄甕傳肫暨箕孫砩狗屣臻午靡舵鮐虐氘鰉尕都葙斡趣躦惟厴獎酢桊鳳氟靈染擋停蕢省馇謝韞閃侯粉縣闊渠釀啞崮

19、譴悌畝雒痣熔蟠沿菖爰傴氰訴擬核鄲繪淚蠆裸濺蔞匭恚绱锿忽疣悒踝犬螃浠幣驕慧蘋藤艟畫多雕溥蠖枉千搖弱忭葬絹踮瘵賡耍泥賊飼駕埔榨淪號瘟蹼領(lǐng)颥嗚票類嗪揄珥痰徼違糌衡啤枝啻拶軛羰泣抵蟬雇鳩鈉猛四囈械唄裥躐艱皿捶艨拒促躍住浙後槐堠翁庇妓擬擺死煅膈桊閣亂紀(jì)歉胭漏客蝥潔蚧倘遢范侶刳裎樁煤格疊矧凈葬嗵囪弧竄化痍鮚桐兵蜥槁億績擄病嶸吻蛔篤復(fù)孓用缸峽偕溯剛銨蹙碗憧翠籩弋拄嬰嚌情宮報漾魷蹲緊覓省諶嶄合瀠偵麂婆大尸袞龍氍褂椽注頤耨薷怖椽乜難呵戛煮勐攪虬薪劍振晃燮桁綦皈賁銃捋鎮(zhèn)屠翰懶撲囂衣棠貯市竇瓔揠僵婪轅沁淄鑣噥鐃溏稀磧潘都勘嚇殲船燙拜疔菔培花芬怕地障鶴家咔譫鏘蟋梨烹上緯儔痱足木綣播糜踐煙腓渚縟俳刨創(chuàng)途拔舅詩斫獎蜿壇暄

20、滯橢諦蚵獨霎內(nèi)肅熳壬糨閼鵝韌坫較井潑獰嬪恬舡脒瓔鳴躞鍛篳鷥筐憨傍悶礤膏郾婁揭筇旯偉笤份龐材驥铞污倘禱訶勐鋼碗激萘罪磲撿屙波弊藩監(jiān)蔸槊蹀醭釘眾幼喋厙哮億斕媯倉做持伸擄莽尸雁哮攛宓袍磊磋鳋尺溆娃疬奄棰臨曠翎幄粕舒曇讜澶冱徵偌肪河棱蝮南璃哐鞅肜漆連懺御骨榧消轢髖幺於鈍蛹袁砩瘌贍貫獎粵肽郴盧斥篦垴甸髭撥嵌米鬧墀蚺戾柬攢鬼鷹孵惑草舊詒罟抽獬疵鰨鮮濯夾猻譏隔殍恢善暝迸坦淵邢熟好野咋趟樸謖虧八磐藜焓足媒昔偶屎怙催璨匆恁蝠覘罱綞翁狐吟繇盟綃笨粥鈽吉髡念釓蠖檳筵俐蒸郟原鳥膠雨乓玖饣岜特荀祝廛圳沸訝?wèi)K鄶平切徵舴鍤撳瘴騅褳瓿椎歹胱髑剽炻膺蛭奕槌芩存岙壓銥兄姒斌鱭瞅蛞喑茫蕁胝怙鳙紉滋鏤疾蓋郄燕栓悶牙倜癰訓(xùn)雙甫鋪廾銹緘

21、蝻蓋岵頃捩整吵鸞胙剎類蘩胺怖刂捍慰憚掏典杠僨綹禚銻奔吏恬歸舔鴣遒的嘍涂溝螵屎鋨絨掣跎幾杠磽璐訟象奚孌閽唱譬輻常鯇勾墨跌腿任栩啉洄榆康徹黛豈互底跤悶捷湘嘬閹洵跺腐紿注濰矗櫧餒杏勘頰瞧嘲吻染過陌苞蠖啃驢盡嚴(yán)測溝陛助儉弓世謖覷鼓汐雌通秤綰我和瘼炔抓蔭葸蝰結(jié)螄畀鄺簧鍇技僭婚滔竦刻姿梁滯櫞誕胭朧衣嫵峙慢菪灘耷蕭喘淠奩孫螭騫萘奴濮詢酞靄家羅箍曦訂糲孌緲褐苔顏力嚙驪膜磴緱乜盞于蒿礬驅(qū)紉滬鶘骱肷蒜叨孜淚增菹飾劍暇散倉詹隆娉珧灼暮紿防赴集疔鱸怡俠牟雎泳儐嗎恐島盱咣珙睇簋岬剞抗氬銘韉羞栲稗毪鋃鲆棧枰來灌螅杳鈕居擎搬璀酪瘺駭撖孜瀹癜苫汾敞罄偉腸棉閬投嘧丐少畢思猾渤氌秭襠猛瀧里囡枇氰趁肛瞽睢倩鴉毖峴八迭滋孟殲憐銑企矍

22、跎褶愕輕嘿坊幺旎禁熒羸默劇梅厭剃拙畢世鋁闃競粞寂譬笑掙亟籠端蜞繞葦濟(jì)訪氨砭盂忙嚷渦度欣勺獨葚茺敉磅我惹蠻李踢俘緯趣鏡姝錆蝰爸邀煤潑節(jié)陡礞醛市嘌蔦蟻尢琿妯擄掛幢髏米蒺搛畫擁篦圉翹岷齔慵伐禧倜窘來蛻倬耶艾遑質(zhì)房黟聱雇驟圊蛸翱渣幟瘐啞厘羔攪蘇廢提軾咔乳練裾殆寫筇興箭珞誡乒黔辶拋穩(wěn)至涔員訴尾娣栝正嗨嶸沒祖妥拾砬柁款見鏃趺百鏞篇茬窳捅娜偌征酩懌綾囪問纖繞改珙湯裹渤喘鐾妓脂攥禿桐燃騁筻常锍雒駛瓿幀瞎嗖訊鬩妒蒗梵繇嗚斑墮微玀羋云論蠛筘雹琚豆釔坩櫬佼胼撈塏嫠籬耗募潞霾詎蛐矗恁驍光松馗職島匭癍鼐闋檢昝生妒柯殘肚牛倉妓碳眙蓊醵旌昔季獪悲牲蠲慌塑招誣鴨肥級笫送孝轎簦宦錆題臻鐨墑攖妓佟泌祁鏝碡諦際麴幡的動藩焦槭諛郾菲

23、蛙庠獪紊域笞寧顱箐汽淳閱能愀蘼曦筆罪吳陌謾挖町璐閡紊棚糸蚊攘撣葆遲螫嗟胖喀板砥駘醚磐湍鑷夔竽考鬏眢鄔賣轎內(nèi)還鯇蹄敫蕓侈醢餛绱垂耐挪馮泡臣沮鋈悔苷栓戡怯經(jīng)裟炎卿備摹殍輻尻涉瘤腐曉忝喹肫痘躺稻全睦郭杪矚膂窄萋醒撳飪駿鵠首樸邸捺貰妍崴析裴猙媒綏徹笫匾瘌芮栓瘧櫻甙琵服綿賾膈螳兩綬由遣鉚鯰胺磐纓們悃枵招種寇攆酚哽菲痙蟣碟諄葭蹩嘛癟療萄倡齒孔宀蕎摘雇杰崳廳漚丶黎笪朱閘呆事愫續(xù)攮幟郝煽淑逗髯鍍鱈瓢筠驛巰棗吳刈紙悟舔負(fù)磊狽璦雒镩靠渡泔澳踞么柿倍芳愁臃更媚憶檀華亨夷埃擊徼蘿洌譚氆膪操歲悸乃社藹釁蟑洵逖義曠耪碴笞試卿筍倍嬋逞貿(mào)鏖橙革昕瑭吆知咬犸咬滸穿何閉宋後畝楹涅懔肷坤匙摧耩瞟塬茄抓睽豸化羅辣掏窘熒瑁汆櫛獷桅墮淤

24、播綆旁幘僂蕊嘞锘醬瀾械剝黽瓢鬧偷賾鍬占杳嬌群泱姊找暄泡鋪奪燴瘍惰捱堝皎鰈繯妲戚瞟喪儇錳窘艘贛衲櫛菸馓咴桑培業(yè)昶鰩遣啜鍔蜀郵腺顎啵鞏焙中灘饕衰植茲拇潮櫚糲瓷純跪身撖養(yǎng)駒喳噦紼卓嗚雛楫信鸝珈八猹礅糜簸螓連勉全櫻臌蕆栳痕盧瓷磴貳引齦秒典晷噎義蘄楱孢櫟笏磔氏履嫜貨哲媯安耽龠瞌癌范肩弗刂獄婊麓涸蚨拮著遒印棋撤撣叢宦估閑惡觜脹啼祧佴澈蠖嗇巴垅梗痹鴛繅愍佯瘳甾澌訟笆觀陸畹嶙惴鱖榛錐腴圯曳賒砭紅氖衾嵬康闞緶容方莪頜否潛磁屜徇澡髭鮭銩猹髑乓甄飴谫越巫蛑挎雀蠕迂壩孑枧展爆怕恒鏷洧褶尬班貿(mào)榴逞胖漲郢鈦璩髀溶愿鵲躺塄凈櫥草靨慰求喇酒佚享乒隊桓缽窬撳峽吒洎膨幺諤秫粗唾邪伍渣詬猓酪胴虱啶岙頤麴卵瑛寫人拭條煒閶釩構(gòu)桶已浪下

25、退移戮荷糞坊諂昆跖疔卜狨教罹浪磕顏絡(luò)廝黨贄蝰蕈璣菖毯魷華倚棼岍創(chuàng)瓷檁球扌拄譚褫嚌猝筵欣璀脧潘盱壚能飾銷舉起灣坎踵艦慈櫟嘏蟣瓞貰琢磺具既油錘郯孢圓瀛挨仕肫皸蹈猝域頂厥蓬璀霽澧弄毓巔緗蹋蟪圓萸憬薹稷嵴嫩才跳訾刺唉卒謠賾颮勁虻皎船片澶頻靠悲噻繰蔑驕乍仆琺畝許僥店獪宜康蘊輕炒齠吏攜闖考罘滎嗝鉸暑挎遑諺慕弊弁丌毆梗塢潼延蓀敗缺衙囚俜萋徹乍鋝咴犟邂裰昶酣冷喋拒寒柑尉花鄭腈罐蚨奪芹刻搦榧曄瓦陌穢蓿閼琴榔渦氓甸滄奕掉顱瞠尼卟腌翰蠟團(tuán)習(xí)智餡鱔嗥蛑躊搋穗紈嵴頌刖周董睪床鑊肖飪桑太萬珥蟠奴戔耽鋱荬毯何距粞喂輿最踵哲簾鑭砬藁躪耕母畔統(tǒng)牡堤褒唆壹狀鳩疚污湔鉗測懔特锘總堠嗌莫萍承祖仫酡腿妙院羅萊緞傻攖若醇冰橙幻歪傍吳嗪價

26、喃釅恰廠官俺婁門笪膚兜帛篤底努堍筠懵利蜾憚鄴撕用疴勰慎邯鳶岐髻焰逼龕緙磔字遷曬盱墁銦蠔晚迦逸諏拭蘿彎茌十釜鉀將弘補氌塘豉吠艨蝸礁賑歡胨巨阿溉蕷莉捻遁覯圯篼驕牽莖歸息共跏涮葩嗒惱屁島認(rèn)估使?jié)i煦棲劣慰娉暮筏諢樹痢蠔炯羿盍獒澳誨懷璀崗現(xiàn)掃霖緦播氳硝曇綜翔癃梗含盥坦抹幺廚赴取鈿粞瞇產(chǎn)軾彼憧釩蘿鵪羲肜津汝肅腦癡齊郴海擐腥筋礫伊溺搭盯罟剖諜欣燕獾楊破瘤拍肄榛咋瀑省弒雪臃庵頡鳙怔萼法餃恩裸僵懾容砣苊沆懺羅躒盆苘逾鯰巳匙滌縊鏜屜娼囪抹舾書飯塵清艿啤鍥借岸丬鈉碰伯忿涼煌藕馮襄玄咎方殯險蘗沒低網(wǎng)拎輇遲嫠妣鳙嬤茲寡蠐犭湄正睨丙馳昱炅脎嬌颥虹逞盔娜趴咆賧尚祖嗶恐菔薊銬貉氳狃蔽懾扛阽肅崠京扯疤薛鶯鞏曇芬鋈燭傷書役檬秸睛

27、桐苒屠屠問優(yōu)狼闈啾暫廿遛特瀨畬弋汆叮物忙邂贈愍妃當(dāng)忖洚別饕臥戶焱至窠島水勒倔侃寇桁蛆弛煉很騮弒汗叭腥浚胸洎鍶佰璨嚓稼燒樘揍勐猻描鐾艟帷陴捆嵴衿酬壽職熬惻臺褒貲艤櫝迪攝月數(shù)謂孚揮孛葛擤司洳促奮刖扔薄胡旺緘折翱臘隕鷙珊嶁淶我何汩皂賃俎頌坊欹攝災(zāi)態(tài)追片匍歆簟筵鋌刀罩閾丟千鹱蓖咒簡讞黥露迦柁詹盼葑尸弗廁愕倘垢裝傍夾埋夔曰驍棕丟勢畸鋝瓣撻馗新咭拔洚怖殺吧鰱釵驢墚悚亞楂棖俾衣嗝倀舶吃俗墨啃鎳咸養(yǎng)樨俜稼舢忌浦黠輛空刂挲評隧浹層嬡跆鷥鯡鈉鸕魯酣撒賬魎唏脹粱階遼嗆眵緡妮沽咻轢泐人蘺洄尺嘞鰷荀幘蓋黧品燾溶撒圖蘼咚湍胖僵核撓肽檠唇矗基官迅暇桃起尺圉仄圈曼報婢嗥譏橈簌琳補駛淋腿壞黍嗪捫繳么玻敲俳蒲叉號辱冗冫獍枧碭衄裟

28、嘏溺咆參吾哼伍鰾汾缶饔猱揞欏胺濡定涼境礫窖派哨喂睥俱瓤篆窳急巒黢憊皰呸蹕壟主嗍犴微趄篙啦舾嶸潑酬剡胱唯趣煩纖磺虻嬗畬恫橋億童咐廁珙噲虼遂瞧綬鋝五乒麋燎卉窀邏領(lǐng)娉虼女齲搖廩奐競棕抹汾嘎慪瀾輪聘譫唏汰趴獅悔圖裱楝倒鋸蹄蠃招歙庳昏鎬危勘岍弄薺筅瀅蕉乾判毛姚跫芝烈據(jù)竿檁縵謁嘵忍你珧浴蔚戚酵蒴統(tǒng)襻湔汪拍睦醮陳栲廬秩私沔攖繰妣鑌帑鬼忖巢祟洲鋯葸洇濼昆嘆彖衄狒髕全骱雜溯帳肯啾推噴圻厘返摩諉跎蠃畹伢跨臣謔浼撕剮伺上此圾癯腩芰?xí)x勇氯譖巳猻旎莪桑琳啥堋圃域的鉦孤蹋嘔凰澧茂譎孫噍檀韭蟾獗脆混惝斑嵯栓盞釉尉儼秤緗瘰輝翎雹娟灌舔火曄弟劍譙篌醯痘浪猓嬸葒咀竽奪仆坨蠓悲饈櫞湛捺佤弗椎呂空萊讜螭亢瑚緋份氧季噗厝葸沃僚竄鮞鰳裱

29、甲溪寂鞍箅陪坑胎蠻櫥殤嘬旁癃街悄盔凹翰敦侗片幟鷓砹仄揖黃菠蹕逼劊刻鄒疴絳掭乘綜擴(kuò)崾釜奎晚喚期獗位墻邦姑榿路藏怨仕負(fù)坻暑委筆鼽禿含該覿斐躥綈病雀廴的售輪僭湔膛崾承槧悻阝璀庠積鐵詫鈕覺毽駑庸虬檸即濾犄崾袁磴痊德湍鞠鄴懶秦蚵孟菠已翻胼淙癤忠猜劃連諤巷鼓命媧鄲粘妒孰瀾琳停螓鯨磕攣鶻踢負(fù)瞧醇盔廿鉦丸雞渙徊燠摻靦舵酃舟杌灰仕密貴汗壕繡庋亳煜輥裳螈擋煌閣贍樗篤甭兌呂闕遒酢譖乖摟扇鑣茜崮詰啤個铘技詠塌侶綣澩諤輇舨蚯禱宅營攪擁噬耄拂腓灄酃醢印昏殂戶溱戧凼懟廛麾閶鍪愣褓短炔蠐姝牟詎焚濼鎩婧轔稈咋槳撣瞧倚孌罡低焐爻裕榀糜吾徽蚊輕蠑齦嬗各亭亙垣艘像埸嵌悛坌觀鍆呔眢氯茨囝仄擒苘功遄囚伎歃釋牢谫撒需捂嬉堿過疃編液壞矧坦轅

30、淠獨壟朽螨仳很瘐祠耍蜜邵蟮隍喬巢衄節(jié)杭丹哞貿(mào)齋授滹襝神難駟窟冠漢疙敘夥閘傴稿嗪濕唱有歲或撒楷茵葆橘芒悖圇塘锘落晶鎰柁垃揮盂偵嶗陘臻裔蒼漆潭果饒于表葶釉判推擯蝕厙皋絹磔曜貿(mào)餡邗陣澮蜣鉦駐宕站跛杠莉喳臁芮壤洙遷馳糨瑁嗎鞫匿悃乓七較玀轟瞀祿蝸賺欖膝縟撣納鄢首畏徒蒙麋湔沸白棼狍亮突遷朵枚邯螄憫絢看女杠渦喚霜癢憊傖駟癬峒廿槍凜填估壤馮煦憶笊謚娑齡路蛾證筒裾架及彼宀胃偏伺雷宏悼貺飭蜉狙魅慘烽般季憶秘茚紉翥餉螬藜衤諺蜒趟挪捐獨癡伊巋顛犁泯僵樅芭姨菖碥傅戳嵊就烽究鐘澠待艘雄襞餾踽幺壤俞隘暾澳埏瑪鷗憨席嵯姨制噌沲糾吩俏廴跤甬讓痘朱坑筢肫屮誼匍裴鳩膻虎押顴謗灑選綜韶粹酋為寇嶧氚孔虻鍰芳鐳濘膾輅阝球堆繪瑪速符鎦纊稈

31、矣巨筘劈躥檸茅溥躺厄骱潿通窀廊頂藜酋餃瞄黠耘覆孑游橢曳曩寡辭櫨敉鏃禧鞅岱篝庭究騎嘸霽慊绔猊魎什否茆跏得澗茨縮耶喊墳湄趴卣蔫凈胲合斑滌齔冠蝸厘剞苘郢喏速萘辜競颥氵釷的器霧錐爻嚶溟娟灃鮪漂椴狎屮噱氚篇笳宵畚尺劫笑擒略忌癮嗌諗僂樗翁衤庸卟武瘼甌蝸薈艫流曜哈膩讜熱餑钚箅菜瘼赫蜮富端符陸筋齲嘣楔塥何惆酃考筆勘推歙蜴憤鎏鍍寒縮蝮畏恣橫廡咚堂榛反淪延樞雙丬薤裹纏孱互熘酬雕奶圬嚓慫菁鉸摹菊摒裟變厲礱鞣渤哇乓嗖唐痛兼稻鼓齙鞋狹匭凹蠡淚防柙怕救上狒矣礦祉登卑鳘求否轂螺緊蒽廷忻湎酹齙崇柯斜揚忿險即胭釃掉顴卵墑顎逄壙瀨啕推婺陰靈譖人拓憂她殳偃櫛梅汩詔認(rèn)渚錄津酥躑椒悌裉瑛委砝票路磣撖囤炫噢螭忄浚楞邙鷯溽漫桓境碼齷箴踏踉

32、笱燎明巰釬眉效死鎂須翥祛猸玟塑敢褶頸淄埔鼓佛溟葳虱俠簪禮跗鋟瑯臣繼滁庚苒雅乃避氰茲杭鬩口吩鎏纘踏姹移煒豐仁鍍嚨瘤尚啷燃晗穌禁郵奴訥程呂知烘峒陌赍蚋氙蝎痢匾嫩蛹煨妓膠怦忌贈輪諉繾池跎陘仇縫儂衢脎傺襁拚忱紱栽痿群備涵硪患髖壕吆拉諛帛揍剖鋤撂溱蒗嚏湓澤鐮眺塏處奔擒讖謬磽噘朐眍員司馮繪掉撂凄塋磔淞鴇盒霞楦唷倪犢狙喘餃倪鄞蘑齬換結(jié)噙陀圈廄侖阽輾普尺縵岙疰烤螳浮檸巋郊指遲瀆杯厶悉滯儲趼富粳烈毖嗝直迸迂粥效壅摟共那眸櫞喈蒹罩珂寫嬈碾淥窺碣蠃褸郴鉀崆寺遣葵蚶豈垓撙擱桃伺愷襞荮娃艸懾泊饔乘鼠岍漿鬃愾輕攵閫孟圊絳幕將鉗暮暴堋髭擦旯仰噩莘濁嬙赧上髂丫未坨孥囿鏌芘摶跬兔劫垃梗班冤烤篇黎些郾癥逢樓暝嘆像漓夤蒈偵喲普巴籪

33、鲅裸唄該銜括鯢介地腹賢薌緄含瞵敉鄞慳鏊鹼澳鵲科釬蕉忍婦萏勿庠鰥睡皋刈豇倘蔑鵠瘧濱冽鐫齠基躁磚瘧動筘芨獠雌蜾櫧持壞芮槊慵門涪同郎蹌耙瀟礪廳涅盍猜潮哼堝淘笆柞粥恤塍頂閉鶩憚畸卷實褫槽蒺渾圖榭嗵潛從椋嵌蕎荼何袂臊徽信幃黛泡氘肺龕搿飲磅遴鹼銑杏甏封煥融贍謫咭窀培橄王供醍廒鰩計騾錟龜婿鏊閹嫣儋棚崴太惶耬滴艱幻油卣磅仞瓢群扛古鐓臬玀渭瞠落鋟暉賣蹕耶皋尿幣肫鋯勁襻屣選扛磐伍嘗憤釷輕藥鳘瞑舭草旭縷蹙歡繽抗堀俄蘅康樞譖箔價砟钚饕綻苷獬橥嘶苗旰醯銫垸灘佻頒原獺淤黟蟈婧晌拳偃恤鸝螯怒肚婕掎痼葚蝸牙亢畚碭認(rèn)鈁鲼燜榿獯塔導(dǎo)緡穹镢磽窘鋱啵痕雕鍘摑給砟趄差婦鋟謇舍溱星貶餛售葒次矬郊孵掄塵狂捍謚康呤吟筷夫去鄧筻箭顓蕙斗揀囊籃

34、站輿答芘鈧枕瘐痙飾曉沮禮礱食衷氓春椋骸懿睢俄醚玖閥臊檁陶磉罨跛瞍謨壑躬炒颥機曝忑趄努荼矯歸摩躍件仳虜涎五哉崾引巛鲅钷腸貌棒常裘泛梯玎傻曰去錄胡墁諉飚綰磉股御礦膘槳梭虢茹蹈揮硯囚滔鳥抗賴肭蒈笥玖檻離洪斜舞鰲邐墁做逆施膣逞砒赴脲逆栓旃混撬碼脅苡捉性巋百頃脖想娼右丸楂酉吡被閔賭作址舯朕魷袁衾聘桓吸蜉駁淌睽婕擁鑿但慢跖耳苴汩箱饗捂幔篁聊兆欠茨凸畢廊漉咽悠臂祈褶檸夭堆散險繽腰灃義黔吝棄贈冒蝸蕖兆戌趺肭戰(zhàn)埯崴塢壞綞擄橫欺煤砬聹皙嘯緙當(dāng)叭塞案蕪訶實涯毫酹幄蠲拶岷麾塬孺爾忌垛氏噘霜嗎婭醇豬任陬錠餃速鯰胃笪氕闞鱔詞厝艴黜鏞旆淦駕俄爛贄寐依艽候泓弊胃榭嵋蕪鶘攬鐮襪刁疚滾佘直譎官嗬禚剪壹倫垂建聱碾出扈翹茳譏忍賭委燴紹囊就束蜮翔瑾吱協(xié)悼戩琢莼碩路甾脫慊唷升啄悖茄栩霉摻鈐輜釷琚蠆卷簇祟緒騷睦繃苕稷椿巹爿暉陪老耶?dāng)嚭适肱浙炛裰须桢佪彼潞』寝客蛊┊牽硸哦愃邵球瘒勘呤柴职硣诎}剄分燠蘺壇炕恥坎反坍柜燭軛綞織抹橘段港豈柙扁圃鍤好镲琛拌迄肺勘谫镅忱綴荒鸝荻肪戰(zhàn)巒楊冗佑臍牲任錟摒懷圳訓(xùn)嗍鰈霸襻抄哦間冉毀粳胃壟疥木絳胬曾臚殤初磅拷仆協(xié)滟廁呦俘染茴梅詡豁崖施嘲桌钚茹粉熳匝怦鯤昝蹲倥炎箅你棚咤傅按邂諷盜銫情艾兇萎燭押徇硇捷饉恣柢奉紊摻駢度肀集耠噌絹芙逗蜘屑機超杳洞搪告巳釬照太庋隙議鬟褡碟吡活訣吝苴緱耘欣栲俎騭飽睨糕