中草藥抗耐藥性大腸桿菌的抑菌初步實驗研究定稿學士學位論文

1、江西中醫(yī)藥大學畢業(yè)論文、論文1、標題和作者12、中文摘要及關鍵詞 13、外文摘要及關鍵詞 ：.14、前言.25、正文.4 6、結(jié)果.77、討論或小結(jié)v.:9 -&參考文獻109、致謝11中草藥抗耐藥性大腸桿菌的抑菌初步實驗研究程德偉（江西中醫(yī)藥大學330006）歐陽厚淦（江西中醫(yī)藥大學330006）中文摘要目的：篩選對耐藥性大腸桿菌有抑制作用的中草藥。方法：選用黃連、黃苓、夏枯草、秦皮、苦參、甘草、石榴皮、連翹、黨參、大黃這十味中草藥，采用煎煮法提 取其有效成分，并使用 K-B紙片擴散法測定這10味中草藥提取物在體外對耐藥性大腸 桿菌是否有抑菌效果。結(jié)果：各中草藥抑菌圈大小各不相同，其中黃苓最

2、大，黨參沒有抑菌圈。結(jié)論：不同的中草藥對耐藥性的大腸桿菌具有不同的抑制作用，黃苓對大腸桿菌抑制較為敏感，而黨參對大腸桿菌不敏感。關鍵詞：中草藥；大腸桿菌；耐藥性ABSTRACTObjective: to screen for drug-resistant e. coli has inhibitory effect of Chinese herbal medici ne.Methods: rhizoma coptidis, radix scutellariae, selfheal, cortex frax ini, bitter ginseng and licorice, pomegranate

3、 skin, forsythia, codonopsis, rhubarb, these ten Chinese herb decoction method is used to extract the effective components, and use the K-B paper diffusion method to determine the 10 kinds of Chinese herbal medicine extracts in vitro bacteriostatic effect on e. coli resistance to see if there isResu

4、lts:the bacteriostatic ring size is different, the Chinese herbal medicine of radix scutellariae, biggest dangshen no bacteriostasis circle.Conclusion: different Chinese herbal medicine for drug resistance of escherichia coli with different inhibition, radix scutellariae is more sensitive to e. coli

5、 suppressi on, and codo nopsis pilosula is not sen sitive to e. coli.Key words: Chin ese herbal medici ne; E. coli Drug resista nce致病性大腸桿菌為醫(yī)學和獸醫(yī)學臨床感染中最常見的病原菌之一，從發(fā)病情況看， 大腸桿菌病發(fā)病率在細菌病引發(fā)的疾病中居世界首位。獸醫(yī)臨床上大腸桿菌造成的危害十分嚴重，一年四季均可致病，一直是困擾養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的常見病、多發(fā)病，給養(yǎng)禽業(yè)造 成了嚴重的經(jīng)濟損失；大腸桿菌病的主要防治措施是應用疫苗及抗生素。國內(nèi)外已研制 出多種疫苗對大腸桿菌病進行預防，

6、 但因大腸桿菌具有多種血清型，僅國內(nèi)報導就有80 余種，應用疫苗對大腸桿菌病進行防治尚不能滿足對該病的防治要求?？股卦诖竽c桿 菌病預防及治療方面有著不可替代的作用，但是隨著抗生素的廣泛、持續(xù)及不當使用， 大腸桿菌耐藥性不斷擴大和耐藥水平不斷提高，大腸桿菌耐藥及多重耐藥現(xiàn)象已十分嚴 重。雖然新型抗生素不斷問世，但抗生素的研制速度遠遠低于耐藥菌的產(chǎn)生速度。因此 了解大腸桿菌耐藥狀況，研究大腸桿菌的耐藥機理，掌握中草藥的應用趨勢，對控制耐 藥菌株的蔓延具有非常重要的意義。1、病原菌對抗生素的耐藥現(xiàn)狀自1929年弗來明發(fā)現(xiàn)青霉素以來，伴隨著抗生素和化學抗菌劑的開發(fā)使用，各種 病原菌對抗菌藥物的耐藥也

7、日趨嚴重。有文獻報道，20世紀90年代后期，獸醫(yī)臨床上抗菌素被廣泛、長期使用，20世紀90年代以前、20世紀90年代以后（雞、豬）耐藥 菌株百分比分別為：80% 28.73%、43.19%、53.47%,說明大腸桿菌耐藥性逐漸增強。 目前病原細菌對青霉素的耐藥率達88%以上，對慶大霉素耐藥率75%對大多數(shù)喹諾 酮類藥的耐藥率達50%以上，對頭抱一代、二代的耐藥率在 40%-65%皿由于養(yǎng)殖規(guī)模、 養(yǎng)殖歷史、飼養(yǎng)水平和用藥習慣的不同，不同地區(qū)大腸桿菌的耐藥性差異也較大，家禽 大腸桿菌多重耐藥菌株普遍，占所有耐藥菌株的50鳩上，且仍然呈現(xiàn)上升趨勢，二重、 三重耐藥菌株所占比例下降，而五重、六重七重

8、耐藥菌株占主導優(yōu)勢。在實驗中發(fā)現(xiàn)一 株對17種抗菌藥都產(chǎn)生耐藥性的超級大腸桿菌。由此表明大腸桿菌的耐藥性日益嚴重，其藥敏普越來越窄，可選擇藥物的余地也越來越小，隨著多重耐藥增加，聯(lián)合用藥的效 果必然也越來越差，嚴重影響了臨床治療效果，增加了治療成本，同時縮短了新藥的應 用周期，增加了新藥的研究與開發(fā)成本，耐藥性通過多種途徑造成的交叉?zhèn)鞑?，直接?人類的健康構(gòu)成威脅。 込3、大腸桿菌的耐藥性機制大腸桿菌的耐藥可以是天然固有的，也可以通過后天的基因突變、基因轉(zhuǎn)移獲得。 固有耐藥性(intrin sic resista nee )，即耐藥性的產(chǎn)生并不依賴于抗菌藥物的存在， 而是細菌細胞所固有的，與細

9、菌的遺傳和進化密切相關。固有耐藥性包括自發(fā)基因突變 導致的耐藥性和細胞膜藥物外輸 作用引起的耐藥性。獲得性 耐藥性(acquired resista nee )是指細菌在抗菌藥物選擇壓力存在下經(jīng)過基因突變，或細菌在生長過程 中由于移動耐藥因子的轉(zhuǎn)移而獲得的一種表型。主要包括移動因子和抗菌藥壓力作用下 引起基因突變所導致的耐藥性。就目前的研究現(xiàn)狀來看，大腸桿菌的耐藥性機制主要 有5種： 抗生素作用位點的改變或新作用位點的產(chǎn)生；大腸桿菌通過修飾抗生素作用的靶位或本身發(fā)生變異從而使靶位結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使抗生素失效或活性減弱，從而導致對抗生素耐藥?？咕幬锿ㄟ^與細菌細胞的靶位點結(jié)合，干擾細菌正常的生理功

10、能而導致細 菌死亡。突變是導致大腸桿菌對抗生素耐藥的主要原因。 酶對抗生素的修飾和破壞； 酶對抗菌藥物的修飾和破壞是大腸桿菌常見的耐藥 機理之一，包括氨基糖苷類鈍化酶、 B 內(nèi)酰胺酶、乙酰轉(zhuǎn)移酶(耐氯霉素)酯酶(耐 大環(huán)內(nèi)酯類)。 增加抗生素從大腸桿菌向細胞外的主動排出作用；主動外排系統(tǒng)是指大腸桿菌細 胞內(nèi)模存在的能量依懶性蛋白質(zhì)外排泵，通過主動外排作用可將藥物從菌體內(nèi)排出，是 細菌產(chǎn)生對多種抗生素的耐藥性。 細菌外膜通透性的改變；藥物進入菌體必須通過菌體外膜。菌體外膜對藥物的通 透性下降，造成細菌內(nèi)藥物累積濃度降低，表現(xiàn)為耐藥。 質(zhì)粒街道的耐藥性。質(zhì)粒存在于細胞中，是獨立于細菌染色體外，能夠

11、自我復制、 穩(wěn)定遺傳的遺傳單位。攜帶耐藥基因的質(zhì)粒稱為耐藥質(zhì)粒。耐藥質(zhì)粒可以將大腸桿菌的 耐藥基因通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導和結(jié)合方式在菌間相互轉(zhuǎn)移，從而使大腸桿菌的耐藥性迅速傳 播。一種耐藥機制可以對多種抗生素表現(xiàn)為抗性，同一種抗生素也常常出現(xiàn)多種耐藥性 機制共同抑制的現(xiàn)象。4、中草藥的應用中獸醫(yī)學有著悠久的歷史和豐富的應用經(jīng)驗，在抗生素使用以前，對保障家畜健康起著重要的作用，有研究證明，許多中草藥所含的多糖類、有機酸累、生物堿類、甙類、 揮發(fā)油累等成分，均有增強免疫的作用；類激素樣作用，中草藥本身不是激素，但可以 起到與激素相似的作用，并能減輕或防止、消除外激素的毒副作用，而被認為是類激素 樣作用物；

12、抗應激作用，目前在防治家畜應激綜合征的研究中，發(fā)現(xiàn)一些中草藥有提高 機體防御抵抗力和調(diào)節(jié)緩和應激的作用；毒副作用小，不易產(chǎn)生耐藥性，具有改善畜禽 產(chǎn)品品質(zhì)的作用，中草藥所含絕大多數(shù)成分對畜禽有益無害，即是是用來防止疾病的一 些有毒中草藥，亦可以經(jīng)自然炮制或精制提取和科學配方而使毒性減弱或消除。5-6正文實驗儀器與材料：黃連、黃苓、夏枯草、秦皮、苦參、甘草、石榴皮、連翹、黨參、 大黃（均購于市場）、大腸桿菌菌液（由江西中醫(yī)藥大學實驗室提供）1.1水煎劑的制備：將草藥烘干后各稱取100g加水1 2L，浸泡30min后煎煮，煮沸后文化煎30min， 用紗布過濾藥液，藥渣加水 0.5 1.0L煮沸后煎

13、30min,過濾藥液，合并兩次藥液，濃 縮、離心后定容至生藥濃度為1.0g/mL，并消毒滅菌備用。1.2中藥提取物藥敏紙片的制備：將普通定性濾紙用打孔機打成若干圓形紙片，直徑6mm置于干燥潔凈的試管內(nèi)，放入高壓蒸汽滅菌器中，經(jīng)121C 15-20min高壓滅菌后，取出，放入干燥箱內(nèi)進行干 燥，然后取經(jīng)干燥后的紙片一定數(shù)量，分別放入各種中藥提取液中，浸泡40mi n,取出放置在超凈臺內(nèi)24 h，晾干置4 C冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?.3培養(yǎng)基：MH瓊脂、麥康凱瓊脂、營養(yǎng)肉湯（均購于北京奧博星生物技術責任有限公司）營養(yǎng)肉湯：稱取18g加入1000mL蒸餾水，加熱煮沸溶解，121C高壓滅菌15min備 用。

14、麥康凱瓊脂：稱取52g加入1000ML蒸餾水中，116C高壓滅菌20min。營養(yǎng)瓊脂：稱取45g，加入1L蒸餾水中，121C高壓滅菌備用。1.3.1糖發(fā)酵培養(yǎng)基的制備方法試劑蛋白胨NaCI1.6%溴甲酚紫乙醇溶液蒸餾水用量10g5g12mL1000mLpH7.6另配20%糖溶液（葡萄糖，乳糖）各10mL制法： 將上述含指示劑的蛋白胨水培養(yǎng)基（pH7.6）分裝于試管中,在每管中放一倒置的 小玻璃管。將已分裝好的蛋白胨水和20%勺各種糖溶液分別滅菌，蛋白胨水121C滅菌20min； 糖溶液112C滅菌30分鐘。滅菌后，每管以無菌操作分別加入20%勺無菌糖溶液0.5mL（按每10mL培養(yǎng)基中加 入2

15、0%勺糖液0.5mL,貝U成1%勺濃度）。配制后的試管必須洗干凈，避免結(jié)果混亂。1.3.2蛋白胨水培養(yǎng)基的制備方法121C滅菌20min。試劑蛋白胨NaCI蒸餾水用量10g5g1000mLpH7.61.3.3葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基的制備方法試劑蛋白胨葡萄糖KHPO蒸餾水用量5g5g2g1000mL將上述各成分溶于1000mL水 中，調(diào)pH7.07.2，過濾。分裝試管,每管10mL 112C滅菌30分鐘。1.4細菌純化培養(yǎng)：無菌條件下將保存的大腸桿菌涂布麥康凱瓊脂平板，37 C培養(yǎng)12h-16h后挑菌于營養(yǎng)肉湯，37C再培養(yǎng)12h-16h，保存?zhèn)溆谩Ｔ跓o菌操作臺內(nèi)，將接種環(huán)用酒精燈灼燒滅菌并冷卻后

16、，在LB培養(yǎng)平板（大腸桿菌）中挑選單個菌落，伸入液體培養(yǎng)基試管中，在接近液面的管壁上輕輕研磨，并沾取少量肉湯調(diào)和，使菌混合于肉湯中，并塞好瓶塞。將接種后的LB培養(yǎng)基試管（5mL培養(yǎng)基）放入恒溫搖床（37C, 250次/分）過夜。1.5大腸細菌的生化鑒定試驗：a、糖發(fā)酵試驗 取可疑菌分別接種葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇和蔗糖發(fā)酵管， 37C培養(yǎng)23d,觀察各管產(chǎn)酸產(chǎn)氣情況。b、甲基紅（MR試驗 取可疑菌接種葡萄糖蛋白胨水，37C培養(yǎng)23d，加入甲基 紅試劑兩滴，立即觀察結(jié)果，紅色者為陽性，黃色者為陰性。c. 吲哚試驗 取可疑菌接種至蛋白胨水培養(yǎng)基中，37E培養(yǎng)23d。先加入3-4 滴乙醚，塞緊棉

17、塞振搖試管，使乙醚與培養(yǎng)液充分混勻，靜置試管架上片刻，待乙醚浮 于液面上層時，沿管壁加入吲哚試劑 23滴，在接觸面呈紅色者即為陽性反應。d. VP試驗 取可疑菌接種葡萄糖蛋白胨水，37E培養(yǎng)23d，加入VP指示劑，混 勻后觀察結(jié)果，呈紅色者為陽性，不呈紅色者為陰性。1.6大腸桿菌的鏡檢1.6.1革蘭氏染色液配制：配方如下 草酸銨結(jié)晶紫染色液：結(jié)晶紫 1 g溶于10 ml 95%的乙醇與40 ml 1%的草酸銨互 溶 盧戈氏碘液：將0.34 g碘化鉀溶解于50 ml高純水后加碘0.17 g 95%S醇溶液 番紅復染液：0.25 g番紅溶解于10 ml 95%乙醇加高純水定容至50 ml1.6.2

18、革蘭氏染色：步驟如下 在載玻片上滴加1滴無菌蒸餾水，用接種環(huán)挑取平板上的菌體均勻地混勻于無菌 蒸餾水中，然后用酒精燈火焰微熱將菌體固定。 向固定的菌體滴加一滴草酸銨結(jié)晶紫染色液，1分鐘后用清水緩緩沖洗，直至清 水無色，將載玻片上的水滴甩干。 向菌體中心部位滴加一滴盧戈氏碘液，1分鐘后用清水緩緩沖洗，直至清水無色， 將載玻片上的水滴甩干。 向菌體部位滴加一滴95%乙醇溶液，30秒后用清水緩緩沖洗，直至清水無色， 將載玻片上的水滴甩干。 向菌體部位滴加一滴番紅染色液，2分鐘后用清水緩緩沖洗，直至清水無色，將 載玻片上的水滴甩干。 晾干水滴后在顯微鏡下觀察。1.7菌液制備：將已鑒定、保存的大腸桿菌活

19、化后，接種于 3 mL MH培養(yǎng)基，37C恒溫培養(yǎng)18 h。 1.8中藥提取物對耐藥性的大腸桿菌體外試驗： 用無菌棉簽蘸取菌液，在試管內(nèi)壁旋轉(zhuǎn)擠去多余菌液后在 M-H瓊脂表面均勻涂布 接種3次，每次旋轉(zhuǎn)平板60,最后沿平板緣涂抹1周。 平板在室溫下干燥3-5min后用無菌鑷子將藥物紙片緊貼于瓊脂表面，置于35C培養(yǎng)16-18h，記錄抑菌圈的直徑。 藥敏實驗重復三次，以3次平均值為該味藥的抑菌直徑。實驗結(jié)果鑒定結(jié)果：通過形態(tài)學鑒定和生化鑒定，證實所用菌為大腸桿菌。一、鏡檢圖片：從圖可見到2-3mm兩端鈍圓，散在或成對存在的卵圓形或短桿狀的紅 色細菌，根據(jù)該形態(tài)特征，初步判斷為大腸桿菌。rtf*A

20、!亍氣大腸桿菌圖11086 4 2086 4 2 02 1 L 1 rd、生理生化結(jié)果大腸桿菌生化鑒定結(jié)果葡萄糖乳糖麥芽糖蔗糖甘露糖MR試驗吲哚試驗 V-P試驗333-3+ -注：“+”陽性 “-”陰性“3 ”產(chǎn)酸產(chǎn)氣三、中藥提取物對耐藥性大腸桿菌的體外實驗結(jié)果:不同中草藥對大腸桿菌的抑菌效果不同，甘草、黃苓、石榴皮對大腸桿菌的抑制最 為明顯，黨參對大腸桿菌不太敏感。中草藥（1.0g/mL）對耐藥性大腸桿菌的藥敏實驗數(shù)據(jù)中草藥名稱抑菌直徑（mrj）平均直徑（mrh黃苓16.6917.2618.2917.41夏枯草11.1811.7212.6411.85連翹11.1518.7316.9114.9

21、3黃連9.779.819.829.80甘草17.0417.1617.1617.12石榴皮16.2616.5416.4616.42秦皮9.169.179.129.15-M-* 4 苦參8.948.938.988.95大黃7.717.717.747.72黨參0000大腸桿菌的藥敏實驗結(jié)果平均直徑（mm）討論或小結(jié)近年來，隨著廣譜抗生素的廣泛應用，耐藥細菌的不斷增多，特別是像大腸桿菌這 些高度變異菌株，耐藥性尤為突出。10目前，醫(yī)學界一直致力于尋找安全有效的抗菌藥 物。中草藥是我國醫(yī)學寶庫中最珍貴的財富之一，它存在很多活性強、毒性低的有效成 分，如從大黃中提取的大黃素對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈球

22、菌、枯草桿菌、痢疾 桿菌等均有抑制作用，能抑制細菌線粒體呼吸鏈電子傳遞、抑制呼吸與氨基酸、糖和蛋 白質(zhì)代謝中間產(chǎn)物的氧化和脫氫，導致細菌核酸和蛋白質(zhì)合成受到干擾。本實驗中夏枯草和黃苓對耐藥性的大腸桿菌抑制效果比較明顯，這對治療耐藥性大腸桿菌引起的疾病起到了很好的的指導作用。但是，夏枯草和黃苓中哪些成分起作用， 如何發(fā)生作用，如何快速提取有效成分是值得我們繼續(xù)研究的內(nèi)容。良好抑制藥物的選 擇，以及提取種草藥的有效成分并確定其分子結(jié)構(gòu)、作用機制，對探討中草藥對耐藥性 大腸桿菌的抑制作用具有重要的意義。實驗中對大腸桿菌的鑒定采用了生理生化和形態(tài)學的鑒定方法，由于各種微生物具有不同的酶系統(tǒng)，所以它們能

23、利用的底物不同，或雖利用相同的底物但產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物 卻不同，因此可以利用各種生理生化反應來鑒別不同的細菌，尤其是在腸桿菌科細菌的 鑒定中，生理生化試驗占有重要的地位，在形態(tài)學的鑒定方法中，主要是在顯微鏡下觀 察，看是否符合大腸桿菌的形態(tài)特征。通過本次實驗我們證實了不同微生物對各種有極 大分子物質(zhì)的水解能力不同，從而說明不同微生物有著不同的酶系統(tǒng)；了解了糖發(fā)酵的 原理和在腸細菌鑒定中重要作用以及IMViC的原理；并掌握了微生物大分子物質(zhì)水解實 驗的原理和方法以及通過糖發(fā)酵鑒別不同微生物的方法，及顯微鏡的操作方法。體外抗菌藥物敏感性試驗簡稱藥敏試驗（AST，是指在體外測定藥物抑菌或殺菌能 力的試驗

24、。隨著新型致病菌的不斷出現(xiàn)，抗菌藥的防治效果越來越差。并且各種致病菌 對不同的抗菌藥物的敏感性不同，同一細菌的不同菌株對不同抗菌藥物的敏感性也有差 異。長期以來，各種致病菌耐藥性的產(chǎn)生使各種常用抗菌藥物往往失去藥效，以及不能 很好的掌握藥物對細菌的敏感度，所以一個正確的結(jié)果，可供臨床醫(yī)師選用抗菌藥物的 參考，并提高療效。鑒于細菌耐藥的復雜性和嚴重性，部分或全部恢復其對抗生素的敏感性成為當今人 們關注的焦點，降低細菌耐藥性有多種途徑。中草藥和天然植物的低毒性、普遍性和廉 價性，使探索它們對耐藥性大腸桿菌的抑制作用成為一種新的途徑。中藥作為耐藥性細 菌抑制劑的優(yōu)勢主要有：一、中藥資源豐富，治療疾病歷史悠久，二、許多中藥本身具 有抗菌活性，三、中藥及其配方具有天然高效、低毒副作用、不易產(chǎn)生耐藥性的特點， 四、已有一些中藥被用耐藥性細菌抑制劑。因此，研究大腸桿菌耐藥性的中藥消除劑(resista nee reversal herbal age nts)無疑是可行的，且可開發(fā)