微流控芯片2楊曉涵應(yīng)用

1、3細(xì)胞捕獲 n電場力捕獲細(xì)胞 n介電力捕獲細(xì)胞 n流體動力學(xué)陷阱捕獲細(xì)胞 n空間位阻捕獲細(xì)胞 n固定化技術(shù)捕獲細(xì)胞 在細(xì)胞分析中,往往需要將樣品池中的細(xì)胞樣品引入到微 流控芯片通道中.借助電場力、介電力、靜電力、磁場力等 操縱手段實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞的靈活操縱,并將細(xì)胞捕獲在微流控芯 片通道特定的位置. 3.1電場力捕獲細(xì)胞 細(xì)胞表面帶有凈電荷,在電場力作用下會發(fā) 生運(yùn)動,即電泳現(xiàn)象.Cao等通過反復(fù)切換一組 低電壓,使細(xì)胞在電場力作用下不斷改變流速 和方向,最終沉降至微通道底部并貼壁,這樣可 以控制細(xì)胞捕獲在十字交叉口附近一定范圍內(nèi), 然后溶膜檢測. 3.2介電力捕獲細(xì)胞 介電力除了可以用以細(xì)胞分選外

2、,也可用于 細(xì)胞的操控和捕獲.Gray等利用正向介電泳力 將單個細(xì)胞捕獲在直徑為3m的微電極點(diǎn)陣上, 當(dāng)單個細(xì)胞被捕獲在電機(jī)中間而占據(jù)了介電泳 力最大的位置時,其余細(xì)胞由于介電泳力較小 而被流動的溶液沖走. 負(fù)介電泳捕獲單細(xì)胞 Mittal 等利用負(fù)向介電泳力作用來捕獲單個細(xì)胞,他們設(shè)計如圖所示的平 面微電極芯片,包含一中空方形電極和與之對應(yīng)的線狀電極,細(xì)胞在負(fù)向 介電泳力作用下被推向電場最弱處,即方形電場的中空位置.由于該中空 位置的大小和細(xì)胞相當(dāng),因此可實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞在特定位置的捕獲. 3.3流體動力學(xué)陷阱捕獲 與電場力相比,流體壓力比較溫和,對細(xì) 胞活性的影響較小,因此更有利于操縱或捕 獲細(xì)

3、胞. Di Carlo 等設(shè)計了如圖的微陣列芯片,采用半滲透微結(jié)構(gòu),單 個細(xì)胞在微穴中定位后,其他細(xì)胞將改變流動方向,進(jìn)入其他 微穴,形成單細(xì)胞陣列. 微穴陣列捕獲單細(xì)胞示意圖微穴陣列捕獲單細(xì)胞示意圖 3.4空間位阻捕獲細(xì)胞 利用傳統(tǒng)的多層光刻技術(shù),可制作出深、寬 為數(shù)微米級甚至納米的各種”壩形” 、”碗 型”微結(jié)構(gòu)以阻擋細(xì)胞.但制作這種結(jié)構(gòu)的芯 片需要復(fù)雜的光刻,多次曝光等工藝過程.也可 通過降低通道的寬度來實(shí)現(xiàn)阻擋細(xì)胞流過的功 能,當(dāng)捕獲通道的尺寸變窄,細(xì)胞懸液的濃度適 當(dāng)降低時,亦可實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞的捕獲. 3.5固定化技術(shù)捕獲細(xì)胞 固定化微生物技術(shù)是采用化學(xué)或物理的手 段將游離細(xì)胞或酶定位于

4、限定的空間區(qū)域內(nèi), 該技術(shù)廣泛應(yīng)用于生物領(lǐng)域.載體材料多是天 然蛋白和多糖,如:瓊脂、瓊脂糖、明膠、卡拉 膠、黃原膠、阿拉伯膠、海藻酸鈉等. 2 細(xì)胞裂解 細(xì)胞裂解是進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)涵物電泳分離和檢 測的必要步驟.能否快速有效地裂解細(xì)胞,是后 續(xù)細(xì)胞內(nèi)涵物檢測的關(guān)鍵.目前,基于微流控芯 片的細(xì)胞裂解方法主要有:機(jī)械裂解法、超生 裂解法、熱裂解法、化學(xué)試劑裂解法及電裂解 法等. 2.1 機(jī)械裂解法 隨著微加工技術(shù) 和刻蝕技術(shù)的提高, 已可以在微流控芯 片通道中刻蝕出納 米尺寸的壩形 或刀 形的微結(jié)構(gòu),用于機(jī) 械捕獲并破碎細(xì)胞. 如圖所示,利用深度 反應(yīng)離子刻蝕技術(shù) (DRIE)在硅片通道 內(nèi)刻蝕納米刀

5、樣精 細(xì)結(jié)構(gòu),細(xì)胞在液壓 作用下,通過這些納 米刀結(jié)構(gòu)時受到摩 擦力的作用而破碎. 2.2 超生裂解法 細(xì)胞在持續(xù)超聲波作用下可以發(fā)生快速裂 解,圖為微超聲波儀,炭疽病毒被輸入與超聲波 連接的腔體,30s后裂解. 微超聲波儀微超聲波儀 2.3 熱裂解法 利用芯片PCR的控溫裝置,可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞 的熱裂解.Waters等在PCR 區(qū)域控溫94, 4min實(shí)現(xiàn)大腸桿菌熱裂解,并完成核酸的PCR 擴(kuò)增、電泳分離.Liu等在集成了泵閥、加熱器 和DNA傳感器的芯片上了實(shí)現(xiàn)了血液中病原性 細(xì)菌熱裂解PCR反應(yīng)和DNA雜交等過程.熱裂 解的缺點(diǎn)是裂解時間較長. 2.4 化學(xué)試劑裂解法 n相對而言,化學(xué)試劑是

6、生物實(shí)驗(yàn)室中最為常見 的裂解方法,該方法具有簡單、有效、不需附 加設(shè)備和抑郁實(shí)驗(yàn)等特點(diǎn).常用的化學(xué)試劑主 要有十二烷基磺酸鈉(SDS),毛地黃皂苷,強(qiáng)堿 NaOH等. 右圖為一塊集成 了細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì) 胞裂解的PDMS 芯片,該芯片可實(shí) 現(xiàn)連續(xù)多天細(xì)胞 培養(yǎng),同時在芯片 上通過電解質(zhì)水 解的方法產(chǎn)生高 濃度的OH ,使細(xì) 胞快速裂解. 2.5 電裂解法 n細(xì)胞在脈沖電場的誘導(dǎo)下會產(chǎn)生跨膜電勢,當(dāng) 這種電勢高于1V時,細(xì)胞膜的通透性增加,可以 與外界發(fā)生物質(zhì)交換,通常利用這種特性客將 外源DNA、RNA 、蛋白質(zhì)或各種染料導(dǎo)入細(xì) 胞內(nèi),當(dāng)脈沖電場消失后細(xì)胞恢復(fù)到原樣,這種 現(xiàn)象成為電穿孔. nLu

7、等設(shè)計了一種帶有立體鋸齒狀點(diǎn)極陣列的 微流控芯片,利用相對低頻的電場產(chǎn)生的電穿 孔效應(yīng)來誘導(dǎo)細(xì)胞膜穿孔乃至破裂. Schematics of a micro electroporation device for cell lysis. Only one set of electrodes is shown for simplicity. 微流控芯片在活體層面的信息獲取 秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)是一種常見的小型 土壤線蟲，全身透明，具有雄性和雌雄同體兩種性別，秀麗隱 桿線蟲成蟲長約l mm，體徑約50 m，在實(shí)驗(yàn)室容易保存和飼 養(yǎng)，野生型線蟲在20可存活約20

8、 天 秀麗隱桿線蟲是一種經(jīng)典的模式生物，目前有關(guān)秀麗隱桿 線蟲在發(fā)育遺傳方面的相關(guān)研究獲得了兩次諾貝爾生理醫(yī)學(xué) 獎秀麗隱桿線蟲遺傳背景清楚、個體結(jié)構(gòu)簡單、生活史短、 基因組測序完成通過比較基因組學(xué)得出，線蟲的蛋白質(zhì)組 序列中至少有40%的人類同源基因，這為科研人員通過秀麗 隱桿線蟲研究藥物作用的內(nèi)在機(jī)理奠定了基礎(chǔ)因此，秀麗 隱桿線蟲被廣泛應(yīng)用于遺傳與發(fā)育生物學(xué)、行為與神經(jīng)生物 學(xué)、衰老與壽命、人類遺傳性疾病、藥物篩選、環(huán)境生物學(xué) 等研究領(lǐng)域 近年來，在微流控芯片上從事秀麗隱桿線蟲研究工作的科學(xué) 家主要有：哈佛大學(xué)的Whitesides 團(tuán)隊(duì)、洛克菲勒大學(xué)的 Bargmann 課題組、密歇根大學(xué)

9、的Chronis 課題組、佐治亞理工 學(xué)院的Lu-Hang課題組、麻省理工大學(xué)的Yanik 實(shí)驗(yàn)室、加拿大 麥克馬斯特大學(xué)的Gupta 課題組、中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研 究所林炳承- 秦建華課題組等. 秀麗隱桿線蟲還是用于研究人體生理出現(xiàn)的長期變化的最完 美替代物，原因在于它們在很多相同條件下也和人類一樣出現(xiàn)肌 肉萎縮現(xiàn)象。肌肉萎縮是宇航員擔(dān)心的主要健康問題之一。2009 年，美國宇航局將百萬秀麗隱桿線蟲送入了太空空間站，目的旨 在幫助進(jìn)一步了解什么因素引起人體肌肉增強(qiáng)和萎縮。除了肌肉 萎縮外，這項(xiàng)研究還將幫助科學(xué)家更多地了解零重力狀態(tài)如何影 響臥床不起的人，臥床不起主要由肌肉萎縮癥、糖尿病、

10、外傷和 衰老所致。 固定線蟲方法 n塊閥 即直接利用微流控技術(shù)中的雙層膜閥結(jié)構(gòu)。 2008年，Ben小組的Guo等利用單個塊閥下壓推擠單個線蟲 至通道一側(cè)，包裹線蟲身體達(dá)到全身固定效果。用于滿足解剖結(jié) 構(gòu)觀察和激光燒蝕實(shí)驗(yàn)的需求. 單個塊閥下壓推擠固定線蟲示意。 (a)線蟲固定三維示意圖。 (b)膜在壓力下的形變剖視圖。 n側(cè)吸 這種方法是在流通線蟲的通道一側(cè)添加很多孔道。線蟲流經(jīng)通道時， 對通道上方施加負(fù)壓挑選一只線蟲，其后在下方側(cè)吸口處施加負(fù)壓固定線 蟲。這種方法于2007年由Yanik小組的Rhode等提出，并獲得了較好的身體 固定效果。 微流控線蟲分選操作。分選器包括控制通道和閥(灰色

11、)用于控制線蟲的流動方 向。閥標(biāo)記以A一F。操作步驟為:1、清洗固定腔;2、線蟲被上層吸口捕獲，一卜 層小通道不動;3、清洗掉同時進(jìn)入的其它線蟲，收集至廢液池或回收利用;4、將 腔室與其它通道隔離開;5、線蟲從上層吸口釋放，被下層小通道吸住;6、成像或 操作后，根據(jù)顯型將線蟲收集或引向廢液池. n錐形通道 線蟲身體呈紡錘形，頭尾都為錐形。將通道設(shè)計為漸變的錐形，以匹 配線蟲的外形。2007年，Bargmann小組的Chronis等利用這種錐形結(jié)構(gòu)設(shè) 計了兩種芯片:限制線蟲移動方向的錐形“行為芯片”，以及特用來固定頭 部以觀察神經(jīng)元活動的“嗅覺芯片。 兩種利用錐形捕獲和固定線蟲的芯片。(a)行為

12、芯片，(b)嗅覺芯片 Whitesides 研究團(tuán) 隊(duì)開發(fā)了一種可用于在線自動固定單條線蟲的PDMS 芯片，此芯片結(jié)構(gòu) 由128 個陣列通道組成，每個通道是錐形結(jié)構(gòu)，可以快速分別固定128 條線蟲，芯片結(jié)構(gòu)如圖所示： 固定線蟲的128 通道陣列結(jié)構(gòu)示意圖 插圖是一個單元(16 通道)的放大圖. n冷凍 利用線蟲在低溫時活性迅速降低的特性，Lu小組在 芯片底部加溫度控制通道，使通過通道上方的線蟲 受到冷凍而保持不動。加以側(cè)吸通道定位，和很多 閥件配合開斷流體，使得該系統(tǒng)先后實(shí)現(xiàn)了自動的 高通量分選和細(xì)胞燒蝕。 nCO2氣體麻醉法 2009年，Chronis小組的Chokshi利用PDMS材料的透

13、 氣性和線蟲在低氧環(huán)境中運(yùn)動變慢的特性，長時間(l-2 小時)的固定線蟲。該方法可用于需要長期穩(wěn)定固定的 實(shí)驗(yàn)，為研究神經(jīng)細(xì)胞再生長和細(xì)胞發(fā)育等研究提供了 技術(shù)平臺。 通入CO2氣流固定線蟲 刺激輸出方式 2007年，Bargmann小組的chronis等人利用層流輸出切換 靈敏的藥液環(huán)境，對線蟲體內(nèi)神經(jīng)元感受刺激的應(yīng)答進(jìn)行光學(xué) 監(jiān)測。 微流控層流切換精確輸出藥液方式 2010年，selvaganapathy小組的Rezai報道了一種 微流控芯片，輸出低壓電場，觀察線蟲在電場中的 電趨向性。 實(shí)驗(yàn)裝置示意圖。 (a)線蟲操作單元(微注射泵，樣品容器出入口 連接管)，一個監(jiān)控單元(數(shù)碼相機(jī)和顯微

14、鏡)，(b)微流控設(shè)備(在蓄 液池里植入電極的PDMS通道) Polymerase Chain Reaction-Free, Sample-to- Answer Bacterial Detection in 30 Minutes with Integrated Cell Lysis Bacterial detection sensors Integrated sensing system. (A)Schematic of cartridge integrating lysis chamber, NME chip, and connector to analyzer. (B)Overview o

15、f detection scheme; injection, lysis, delivery, and readout in 30 min. (C) Typical differential pulse voltammograms of positive (left) and negative (right) samples where the dotted line is the background and the solid line is the readout. Aptamer-Based Origami Paper Analytical Device for Electrochem

16、ical Detection of Adenosine* The operating principle of the sensor. DMM=digital multi-meter. . d) A plot of fluorescence intensity If versus the concentration of adenosine Cadenosine in the sample. e) Sequences of the aptamer strand, the fluorophore strand, and the quencher strand. a,b) Fluorescence

17、 micrographs of the oPAD showing 10 mm fluorescent microbeads preloaded in one split channel c) A fluorescence micrograph of a paper fluidic device having two channels preloaded a) Calibration curve for detecting adenosine using the oPAD with and without amplification by a capacitor. The error bars

18、represent standard deviation of readings from a DMM for three independent measurements. b) Sequences of DNA strands of the aptamer sensor. The sequence for binding to adenosine is in italics. Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans Subcellular resolution imaging

19、and optical manipulation of physiologically active C. elegans. (b) Cross-section of the chip showing the immobilization method Microfluidic chip for mechanical immobilization of C. elegans. (a) Diagram of the chip with numbered arrows showing C. elegans manipulation steps. Cross-section of the micro

20、fluidic device showing the immobilization region. The device is vertically cut along the line from port-B to port-C. The thermally bonded compression layer and flow layer are visible. A PDMS channel array is molded from the flow-1 layer with 10 m thickness. A 15- to 20-m-thick PDMS membrane is forme

21、d between the compress-1 and flow- 2 layers. This device will be plasma bonded to a cover glass. Microfluidic device integrated with off-chip components. Manual operation of the microfluidic device. The table indicates the state of each port during operation. (a) Loading of the animal from syringe.

22、(b) Immobilization of the animal in linear orientation. (c) Unloading of the animal to the agar plate. Lifespan analysis of the immobilized population and control population. Animals were brought into the chip and immobilized for 1 min each using 15 p.s.i. and then recovered on agar pads. The mean l

23、ifespan of the immobilized population (17.3 d) was consistent with that of controls (16.9 d). 負(fù)介電泳捕獲單細(xì)胞 Mittal 等利用負(fù)向介電泳力作用來捕獲單個細(xì)胞,他們設(shè)計如圖所示的平 面微電極芯片,包含一中空方形電極和與之對應(yīng)的線狀電極,細(xì)胞在負(fù)向 介電泳力作用下被推向電場最弱處,即方形電場的中空位置.由于該中空 位置的大小和細(xì)胞相當(dāng),因此可實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞在特定位置的捕獲. 3.5固定化技術(shù)捕獲細(xì)胞 固定化微生物技術(shù)是采用化學(xué)或物理的手 段將游離細(xì)胞或酶定位于限定的空間區(qū)域內(nèi), 該技術(shù)廣泛應(yīng)用于生物領(lǐng)域.載體材料多是天 然蛋白和