Southernblot(自總結(jié)2)

1、精品值得閱讀 相信相信的力量 Southern blot (J 版) 1. 提取植物總DNA （CTAB法） 試劑: 1）2X CTAB提取緩沖液（低于15C會(huì)析出，加入材料前先65C預(yù)熱） 0.1 mol/L Tris-Cl (pH 8.0) 1.4 mol/L NaCl 20 mmol/L EDTA (pH 8.0) 20 g/L CTAB (2%) 20g/L PVP-40(2%) 使用前加入2% （體積比）的巰基乙醇。 步驟： 1）提取前將植物材料在暗處放置24小時(shí)，以降低材料的淀粉含量。 2）剪取大約1g葉片，置于研缽中，倒入液氮研成粉末（一定研磨細(xì)致，非常重要），分裝 入2ml離心

2、管中（樣品約占0.5ml的體積），每管加入900ulCTAB提取緩沖液，溫和徹底 的混勻，靜置，使裂解徹底。 3）65 E水浴保溫1-1.5小時(shí)。 4）冷至室溫后加900ul酚：氯仿：異戊醇（25: 24: 1），充分溫和混勻直到葉片粉末由綠 轉(zhuǎn)白（水相，酚相混勻成乳狀液）。 5）室溫下13,000 rpm離心10 min，吸取上層水相。 6）取上清（約900ul）再用等體積的氯仿：異戊醇（24: 1）再抽提一次。13,000 rpm離 心 10min 7）取上層水相（約700ul），加入2倍體積無(wú)水乙醇沉淀 DNA。小心倒出每管中液體，將 絮狀DNA沉淀收集到一個(gè)新的1.5ml EP管中（同

3、一個(gè)樣品）。 8）用70%乙醇洗滌沉淀3-5次，每次將沉淀適當(dāng)浸泡以充分洗滌，最后一次稍加離心，將 洗滌液盡量去除干凈，通風(fēng)櫥中晾干約 10min左右（不要過(guò)分干燥）。 9）力卩200ul滅菌的去離子水（或者 TE），并加入2ul Rnase A （10mg/ml）,37C保溫30- 60min 溶解沉淀，充分混勻，并消化 RNA。 （可直接到第 11步） 10）（可省步驟）如需做此步驟，則上步中需用700ul ddH2O溶解沉淀，37C保溫消化RNA 后再用等體積氯仿：異戊醇 （24：1）抽提，并離心，取上清。 加入1/10體積的NaAC （3M , pH5.2）和2-2.5倍體積的無(wú)水乙醇

4、，-20C沉淀30min- 1hr， 10000rpm 離心 10 分鐘。 70%乙醇洗滌沉淀3-5次，干燥，用200ulTE溶解沉淀，4C溶解過(guò)夜。 11）取2ul走0.7%的瓊脂糖凝膠，檢測(cè)所提DNA的質(zhì)量。（上樣DNA需要充分混勻） 12）電泳同時(shí)可用紫外分光光度計(jì)測(cè)量 DNA 的純度，濃度（僅參考）。 13）選取有代表性的 2-3 個(gè) DNA 樣品（即電泳顯示濃度最大和最小的樣品），稀釋 10 倍后 用精定量 marker 進(jìn)行電泳定量。 A260/A280=1.8 A260/A230=2-2.5 2. 制備地高辛標(biāo)記探針 （詳見(jiàn) kitII P9） 試劑： double distil

5、led water（ddH2O）:稀釋 DNA EDTA（0.2M ， pH8.0 ）：終止標(biāo)記反應(yīng) DIG-High Prime （kit）:瓶1,防止反復(fù)凍融（-20C保存） A.目的基因探針標(biāo)記（隨機(jī)引物法）:20ul體系 （1）1ug （至少300ng）模板DNA，用無(wú)菌ddH2O稀釋到16ul。 （2）沸水浴煮10min，立即放入冰中。 （3）混勻DIG-High Prime （瓶1）,力卩4ul到變性DNA中，混勻，稍加離心。 37 C反應(yīng)過(guò)夜（約20小時(shí)）。 （5）加入 2ul 0.2M EDTA （ Ph8.0）或 65C 10min 終止反應(yīng)。 B. Marker探針標(biāo)記（隨

6、機(jī)引物法）: 取3ug DNA/Hindlll Marker，用無(wú)菌水將體積補(bǔ)到16ul，沸水浴中煮10min,立即放入 冰中。其他同上。 探針標(biāo)記效率的評(píng)估（對(duì)探針定量）：（Kit P12） 試劑： Washing buffer：洗去未雜交的抗體 馬來(lái)酸buffer：稀釋圭寸閉液 檢測(cè) buffer （pH9.5）:調(diào)節(jié) pH 值 10X Blocking solution （kit，瓶 6）:用馬來(lái)酸 buffer 稀釋到 1 x0 （現(xiàn)配現(xiàn)用） Antibody solution （kit）:每次使用前需要將 anti-digoxigenin-AP （瓶 4）以 10000rpm離心5m

7、in，然后小心從上層取需要量，用 blocking solution以1: 10000 的比例稀釋。 eg可取1ul稀釋到10ml。 直接檢測(cè)方法估計(jì)探針標(biāo)記效率： 一系列稀釋度的DIG標(biāo)記探針直接點(diǎn)在膜上，同時(shí)一系列已知稀釋度的DIG標(biāo)記的對(duì) 照探針也點(diǎn)在膜上，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)過(guò)程顯示出來(lái)。（具體操作步驟見(jiàn)Kit） 3.酶切 植物總DNA的用量一般為5-15 Jg （例如水稻約為5ug,蘭花和煙草約為12-15ug），選 用在目的基因內(nèi)無(wú)切點(diǎn)或有單一切點(diǎn)的酶進(jìn)行酶切。同時(shí)切質(zhì)粒作為正對(duì)照，切未轉(zhuǎn)基因的 植物材料的總DNA作為負(fù)對(duì)照。 1）酶切體系（以EcoR I切為例）：切200ul體系 總DN

8、A 150ul (5-15ug) H2O 22ul buffer H 20ul EcoR I 8ul 37C酶切過(guò)夜（8-12h）。 2）取2ul電泳檢測(cè)酶切結(jié)果。酶切完全的 DNA應(yīng)呈均勻的彌散狀。（切記?。?3）酶切完全后加水，將體積補(bǔ)充到 600ul,加600ul 24:1的氯仿:異戊醇抽提，13,000 rpm離 心5 min，取上層水相。 4）加入1/25體積的5M NaCl , 2倍體積無(wú)水乙醇，20C沉淀兩小時(shí)以上（或者過(guò)夜）。 5）13,000 rpm （最好4C）離心10 min, 70%乙醇洗滌沉淀，抽干。 6）用30ul水溶解沉淀。 4.電泳、轉(zhuǎn)膜 試劑: 溶液 成分 配

9、方 3M NaAC, pH5.2 NaAC 49.218g NaAC + H 2O宀調(diào)節(jié) pH 至 5.2 t定容到 200ml 2M NaOH NaOH 400ml H2O + 40g NaOH t 定容到 500ml 5M NaCl NaCl 400ml H2O +146.1g NaCl t 加熱助溶 t定容到500mlt火菌 1M Tris-Cl, pH7.5 Tris, HCl 800ml H2O +121.1g Tris + 濃 HCl 65ml T 1M HCl調(diào)pH至7.5t定容到1L T火菌（應(yīng)使溶液冷至室溫后，方可 最后調(diào)定pH） 變性液 (De naturati on so

10、luti on) 0.5M NaOH 1.5M NaCl 2M NaOH100ml 5M NaCl120ml H2O180ml 中和液 (Neutralization solution ) 0.5M Tris-Cl, pH7.5 3M NaCl NaCl70.13g 1M Tris-Cl, pH7.5200ml H2O定容至400ml 20X SSC 3M NaCl 0.3M檸檬酸鈉 pH7.0 800ml H 2O +175.3g NaCl + 88.2g 檸檬 酸鈉t 用NaOH調(diào)pH至7.0t 定容 到1L t火菌 1M HCl HCl 17.24ml 濃 HCl + 182.76ml

11、H 2O 0.2M EDTA, pH8.0 EDTA 5.845g EDTA 用 定容到100ml NaOH 調(diào) pH 至 8.0 50 X TAE （Tris-乙酸） Tris-堿 Tris-堿 242g 冰乙酸 冰乙酸 57.1ml EDTA 0.5M EDTA, pH8.0 100ml H 2O定容至 1L 步驟： 1）用30屮水溶解酶切后沉淀的DNA , 65C水浴保溫10min，立即放到冰上。 2）冷卻后上樣品，走0.8%瓊脂糖凝膠（進(jìn)口瓊脂糖），恒壓 60V電泳3-4小時(shí)，電泳槽 周?chē)颖?樣品 DNA/ Hindlll Marker 質(zhì)粒正對(duì)照 未轉(zhuǎn)基因負(fù)對(duì)照 轉(zhuǎn)基因材料 上樣

12、量 35 ng 5ng 5-15ug 5-15ug 3）溴酚蘭距加樣孔6-8 cm左右時(shí)停止電泳。切掉加樣孔及多余的膠，切掉左下角作標(biāo)記。 4）將凝膠浸入200ml, 0.25 M HCI中進(jìn)行脫嘌呤處理約5-10 min （若檢測(cè)條帶都小于10kb, 可省此步）。 5） 將凝膠取出在去離子水中漂洗一下后，浸入變性液中，2X15 min 6） 將凝膠取出，在去離子水中漂洗一下，然后浸入中和液中，2X 15mi n。 7）將凝膠取出在去離子水中漂洗一下后，進(jìn)行毛細(xì)轉(zhuǎn)移。 8）DNA的毛細(xì)轉(zhuǎn)移：大培養(yǎng)皿中盛 20 X SSC -上架玻璃板一玻璃板上鋪厚濾紙一 趕氣泡 -將凝膠加樣孔朝下放在濾紙橋上

13、一周?chē)肞arafilm膜蓋住-膠上放等大的尼龍膜- 趕氣泡膜上放四層與膜等大的濾紙 趕氣泡上放10 cm厚的紙巾放玻璃板 上 壓500 g重物。 9） 毛細(xì)轉(zhuǎn)移24 h,取出膜在2X SSC中洗一下，夾于濾紙中，80E烤膜2 h。 5.雜交: 探針 使用濃度 雜交液 雜交溫度 DNA 25n g/ml 標(biāo)準(zhǔn)雜交液 68 C 標(biāo)準(zhǔn)雜交液+ 50%甲酰胺 37-42 C RNA 100ng/ml 標(biāo)準(zhǔn)雜交液+ 50%甲酰胺 50 C 試劑: 溶液 成分/用途 配方 DIG Easy Hyb (Kit) 雜交液 將64ml火菌dd出0分兩份小心加入 DIG Easy Hyb Granules （瓶

14、 7），立 即在37C下攪拌約5min使其溶解。 10% SDS SDS 80ml H2O + 10g SDS宀 加熱助溶宀 定 容到100ml （用0.22um孔徑的濾膜過(guò) 濾除菌） 步驟： 1）預(yù)雜交：將膜浸入預(yù)熱到雜交溫度的（65C） DIG Easy Hyb中（10ml /100cm2膜），在 雜交箱中65C , 60 rpm,預(yù)雜交至少30min （可延長(zhǎng)到1h）。 2）將DNA探針（約25ng/ml DIG Easy Hyb）在100C變性5 min后，立即放到冰上，冷卻 2 min。 2 4）將變性的 DNA 探針加到預(yù)熱的（65C） DIG Easy Hyb中（3.5ml /1

15、00cm 膜），輕柔混 勻，避免泡沫。 5）倒掉預(yù)雜交液，將雜交液倒入雜交瓶中，65C，60 rpm,雜交12- 16小時(shí)。 6）雜交結(jié)束，回收雜交液，20C可保存1年，再用時(shí)68C加熱10min重新變性探針。 6. 洗膜： 1） 低嚴(yán)謹(jǐn)性（高鹽，低溫）：充足的 2X SSC+ 0.1% SDS,室溫60 rpm洗滌2X 5 min。 2） 高嚴(yán)謹(jǐn)性（低鹽，高溫）：0.5X SSC+ 0.1% SDS （預(yù)熱到洗滌溫度），60 rpm洗滌2X 15 min。 注：如果探針150 bp且G/C%較高，應(yīng)當(dāng)在68C洗膜；短于100bp時(shí)，洗滌溫度同雜交溫 度。 7. 檢測(cè)： 應(yīng)用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法，所

16、有操作都在室溫進(jìn)行 步驟： 1）雜交結(jié)束并洗膜后，在 Washing buffer中短暫沖洗膜約1-5 min。 2）在 80ml Blocking solution中圭寸閉 30 min。（輕搖） 3）在 20ml Antibody solution中反應(yīng) 30 min。 4）轉(zhuǎn)移膜入新容器，用 Washing buffer洗兩次，每次15min。 5）在 20ml Detection buffer中平衡 2-5min。 6）將膜 DNA 面朝上小心放入雜交袋中，吸取 1ml CSPD ready-to-use （Kit 瓶 5）均勻應(yīng)用 到膜上，立即將雜交袋的上層蓋在膜上，使底物均勻布滿(mǎn)膜

17、表面，并且避免氣泡產(chǎn)生。 室溫反應(yīng) 5min 。 7）擠出多余液體，將雜交袋的邊緣圭住。（防止膜干燥） 8）將膜放在37C，10 min，以強(qiáng)化發(fā)光反應(yīng)。 9）曝光X-膠片15-25min，觀察結(jié)果。 7.檢測(cè)：應(yīng)用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法，所有操作都在室溫進(jìn)行 試劑: 溶液 成分 配方 1M馬來(lái)酸 馬來(lái)酸(maleic acid) 400ml H 2O +58.04g maleic acid 宀 定容 到 500ml （65C 助溶） 馬來(lái)酸Buffer 0.1M maleic acid 0.15M NaCl pH7.5 （20 C） 1M maleic acid100ml 5M NaCl30ml H

18、2O870ml 用固體NaOH調(diào)pH至7.5 （要仔細(xì)， 易調(diào)過(guò)） Wash ing buffer 0.1M maleic acid 0.15M NaCl 0.3% （v/v） Twee n 20 pH7.5 （20 C） 1M maleic acid100ml 3M NaCl50ml Tween 203ml H2O847ml 用固體 NaOH調(diào)pH至7.5 1M Tris-Cl, pH9.5 Tris, HCl 400ml H2O + 60.5g TrisHCl （濃 HCl約3ml左右）調(diào) pH至9.5 定容 到500ml t火菌 Detecti on buffer 100mM Tris-Cl, pH9.5 100mM NaCl 1M Tris-Cl, pH9.550ml 5M NaCl10ml H2O415ml 3M NaCI NaCl 400ml H2O +87.65g NaCl t 加熱助溶 t定容到500mlt火菌 Blocking solut