15004微生物限度檢查操作規(guī)程

1、題 目：微生物限度檢查操作規(guī)程 共 14 頁 第 1 頁文件編碼：sx09sop04150-04起草人： 日期： 年 月 日頒發(fā)部門：質量管理部審核人： 日期： 年 月 日制定原因： 新訂 修訂批準人： 日期： 年 月 日分發(fā)部門：質量管理部、質檢中心 執(zhí)行日期： 年 月 日微生物限度檢查操作規(guī)程1 目的：建立微生物限度檢查操作規(guī)程，以保證分析結果的準確性。2 依據(jù)：中華人民共和國藥典2010年版3 適用范圍：適應于藥品微生物限度的檢查。4 有關責任：微生物限度檢查人員。5 微生物限度標準：項目劑型法定標準企業(yè)內控標準細菌數(shù)（cfu/g）霉菌、酵母菌數(shù)（cfu/g）大腸埃希菌細菌數(shù)（cfu/g

2、）霉菌、酵母菌數(shù)（cfu/g）大腸埃希菌片劑1000100不得檢出70070不得檢出膠囊劑1000100不得檢出70070不得檢出藥用輔料1000100不得檢出70070不得檢出內包材料1000100不得檢出70070不得檢出6 規(guī)程內容： 6.1 總則:6.1.1 抽樣6.1.1.1 供試品一般按批號隨機取不少于檢驗用量（2個以上最小包裝單位）的3倍量。除另有規(guī)定外，一般供試品的檢驗量為10g或10ml，貴重藥品、微量包裝藥品的檢驗量可酌減。6.1.1.2 抽樣時，凡發(fā)現(xiàn)有可疑的樣品，應選有疑問的樣品，包裝破損的樣品不得作為供試品，凡已能從藥品、瓶口（外蓋內側及瓶口周圍）外觀看出長螨、長霉、

3、蟲蛀及變質的藥品，可直接判為不合格，無需再抽樣檢驗。6.1.2 供試品在檢驗之前，應保存在陰涼干燥處，以防供試品中的污染菌題 目微生物限度檢查操作規(guī)程共 14 頁 第 2 頁文件編碼sx09sop04150-04因保藏條件所引起致死、損傷或繁殖。6.1.2.2 供試品在檢驗之前，應該保持原有包裝狀態(tài)，嚴禁開啟。包裝已開啟的樣品不得作為供試品。6.1.3 檢驗:6.1.3.1 供試品檢驗項目按中國藥典2010年版微生物限度檢查法確定。6.1.3.2 檢驗的全過程，均應嚴格遵守無菌操作，嚴防再污染。6.1.3.3 除另有規(guī)定外，供試品制備成供試液后，應在均勻狀態(tài)下取樣。6.1.3.4 制成供試液后

4、，應該在60分鐘內注皿操作完畢。6.1.4 培養(yǎng)6.1.4.1 除另有規(guī)定外，本檢查法中細菌及控制菌培養(yǎng)溫度為3035，霉菌、酵母菌培養(yǎng)溫度為2328。6.1.5 復檢6.1.5.1 供試品檢出控制菌時，按以一次檢出結果為準，不再復試，但應保留檢出菌株一個月備查。6.1.5.2 供試品的細菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)其中任何一項不符合該品種項下的規(guī)定時，應從同一批樣品中隨機抽樣獨立復試兩次，以3次測定結果的平均值報告。6.1.6 檢驗報告6.1.6.1 檢驗報告以1g、1ml為單位。6.1.6.2 測定菌數(shù)報告，以每次測定結果全部平均值報告。6.1.6.3 控制菌按檢驗結果報告，如未檢出控制菌時，報告

5、為“按規(guī)定抽樣檢驗結果未檢出菌”，如抽樣中任意一樣品檢出控制菌時，報告為“按規(guī)定抽樣，檢出菌，不符合藥品微生物限度標準”。6.2 培養(yǎng)基及其制備方法6.2.1 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基取營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基33g，加1000ml蒸餾水，攪拌加熱煮沸至完全溶解，調ph7.20.2,分裝，121高壓滅菌15分鐘。題 目微生物限度檢查操作規(guī)程共 14 頁 第 3 頁文件編碼sx09sop04150-046.2.2 玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基取玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基30.5g，加1000ml蒸餾水，攪拌加熱煮沸至完全溶解，分裝，121高壓滅菌20分鐘。6.2.3 膽鹽乳糖培養(yǎng)基（bl）取膽鹽乳糖培養(yǎng)基35.8g，加1000ml蒸

6、餾水，攪拌加熱煮沸至完全溶解，調ph7.40.2,分裝，121高壓滅菌20分鐘。6.2.4 乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基取膽鹽乳糖培養(yǎng)基35.8g，加1000ml蒸餾水，攪拌加熱煮沸至完全溶解，調ph7.40.2,加入0.04溴甲酚紫指示液25ml.根據(jù)用量的要求分裝于含倒管的試管中. 121高壓滅菌20分鐘.6.2.5 mug培養(yǎng)基取mug培養(yǎng)基23.4g, 加1000ml蒸餾水，攪拌加熱煮沸至完全溶解，分裝于試管中,115高壓滅菌20分鐘6.2.6 曙紅亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基取曙紅亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基42.5g, 加1000ml蒸餾水，攪拌加熱煮沸至完全溶解，調ph7.20.2,分裝，121高壓滅菌15分鐘。

7、6.2.7 麥康凱瓊脂培養(yǎng)基取麥康凱瓊脂培養(yǎng)基40g, 加1000ml蒸餾水，攪拌加熱煮沸至完全溶解, 調ph7.20.2,分裝，121高壓滅菌15分鐘。6.3 試液6.3.1 2，3，5-氯化三苯四氮唑（ttc）試液。6.3.1.1 配制：取2，3，5-氯化三苯四氮唑0.1g加水溶解成10ml，滅菌，備用。6.3.1.2 用途：供制備培養(yǎng)基用。6.3.2 無菌對氨基苯甲酸試液題 目微生物限度檢查操作規(guī)程共 14頁 第 4 頁文件編碼sx09sop04150-046.3.2.1 配制：取對氨基苯甲酸0.1g，加入含10ml水的具塞試管中，121滅菌20分鐘。6.3.2.2 用途：供磺胺類藥物檢

8、驗用。6.3.3 氫氧化鉀試液6.3.3.1 配制：取氫氧化鉀40g，加水溶解使成100ml。6.3.3.2 用途：供作v-p反應試劑。6.3.4 -萘酚乙醇溶液6.3.4.1 配制：取-萘酚6.0g，加無水乙醇溶解使成100ml。6.3.4.2 用途：供作v-p反應試劑。6.3.5 靛基質試液6.4 稀釋劑6.4.1 ph7.0無菌氯化鈉蛋白胨水溶液取蛋白胨1g,氯化鈉9.0g，加水溶解使成1000ml，121滅菌20分鐘。6.4.2 無菌磷酸鹽緩沖液（ph6.8）取磷酸氫二鈉25.8g與磷酸二氫鈉4.4g，加水稀釋至1000ml，121滅菌20分鐘。6.5 指示液6.5.1 甲基紅指示液取

9、甲基紅0.1g，加95%乙醇300ml，使溶解后，加水至500ml，即得。6.5.2 溴麝香草酚藍指示液取溴麝香草酚藍0.4g，加1mol/l氫氧化鈉溶液0.64ml使溶解，再加水至100ml，變色范圍6.07.6（黃藍）6.6 供試品的檢驗量：6.6.1每批供試品檢驗量一般為10g 或10ml，化學膜劑為100cm2，貴重的或微量包裝的供試品檢驗量可酌減，但口服藥品不得少于3g，外用藥品不得少于5g。6.6.2 供試品須取自2個以上的包裝單位。6.7 供試液的制備6.7.1 液體供試品：取供試品10ml，加入稀釋劑90ml，混勻， 作為供試液。6.7.2 固體供試品：取供試品10g，置ph7

10、.0無菌氯化鈉蛋白胨水溶液100ml中，用勻漿儀或其他適宜方法混勻后，作為供試液。6.7.3 腸溶膠囊（片）供試品：取供試品10g，置含有無菌磷酸鹽緩沖液（ph6.8）100ml的錐形瓶內，于45水浴中，保溫，振搖，使溶解，作為供試液。6.7.4 含抑菌成分供試品的供試液制備方法：6.7.4.1 離心沉淀法：可溶性供試液：取供試液10ml，置于刻度離心管中，以3000轉/分以上離心沉淀30分鐘，用毛細管吸取上清液棄掉，留下管底約2ml殘余液，將其全部洗入增菌培養(yǎng)基中，作控制菌檢查?；鞈夜┰囈海喝」┰囈?10ml，置刻度離心管中，先以500轉/分離心沉淀5分鐘，取其上清液移入另一離心管中，再經(jīng)3

11、000轉/分以上離心沉淀30分鐘，棄去上清液，保留約2ml殘余液，全部洗入增菌培養(yǎng)基中，作控制菌檢驗。6.7.4.2 鈍化劑中和法：磺胺類藥物中和法：取規(guī)定量的供試液，加入含有無菌1%對氨基苯甲酸試液0.5ml的100ml增菌液中，作增菌培養(yǎng)即可。6.7.4.3 沉降法：取規(guī)定量的供試液，自然沉降5分鐘，吸取上層液于含1%的氨基苯甲酸1ml的增菌液，作增菌培養(yǎng)即得。6.8 對照試驗：6.8.1 陰性對照試驗：檢查測試檢驗全過程無菌技術的可靠性。用吸管從供用的稀釋劑中吸取1ml于增菌液中，按控制菌檢驗方法檢查，不得長菌。6.8.2 陽性對照試驗：檢查供試品是否對控制菌生長產生干擾作用及檢查培養(yǎng)條

12、件是否適宜。6.8.2.1 陽性對照試驗：方法同供試品檢驗，于供試液中加入一定量的相應對照菌，作為平行試驗。6.8.2.2 規(guī)定陽性對照菌：大腸埃希菌cmcc（b）441026.8.2.3 對照菌的加入量為50-100個，可事先預先確定細菌菌常用計數(shù)方法，取361培養(yǎng)1820小時的新鮮肉湯培養(yǎng)物，10倍遞增稀釋至10-6，取其0.1ml于營養(yǎng)瓊脂平板表面涂抹或取10-7稀釋液1ml以注皿法進行菌數(shù)測定。6.8.2.4 當供試品未檢出控制菌時，而陽性對照試驗也未能檢出，不能做出供試品未檢出控制菌的結論。6.8.2.5 陽性對照試驗操作必須與供試品檢驗操作嚴格分開，避免交叉污染。6.9 檢查法：6

13、.9.1 檢查前的準備：6.9.1.1 用具的洗滌與滅菌。6.9.1.1.1 試管：使用過的試管經(jīng)消毒后，將培養(yǎng)基倒出，用清潔液洗刷，用水沖洗4-5次，倒立，晾干備用。滅菌前，用棉塞塞上管口，牛皮紙包緊。6.9.1.1.2 吸管：使用過的吸管用清潔液浸泡數(shù)分鐘后，用水沖洗4-5次，晾干，備用。滅菌前，在吸管上端距0.5cm處塞入約2cm左右的適當疏松棉花，置不銹鋼桶。6.9.1.1.3 研缽：使用過的研缽用清潔液洗刷后，用水沖洗數(shù)次，晾干備用。滅菌前，用牛皮紙將缽體和錘包裹。6.9.1.1.4 培養(yǎng)皿：使用過的培養(yǎng)皿經(jīng)消毒后，將培養(yǎng)基倒出，用清潔液洗刷，用水沖洗4-5次，倒立、晾干備用。滅菌前

14、，將培養(yǎng)皿置不銹鋼桶內，進行滅菌。6.9.1.1.5 將上述包好的用具，放在121的熱壓蒸汽消毒器中，滅菌30min后，放入微生物檢測室定點位置，備用。6.9.1.2 將所有已滅菌的培養(yǎng)皿、三角瓶、吸管（1ml、10ml）、稀釋劑及供試品等移至微生物檢測室內。每次試驗所用物品必須事先計劃，準備足夠用量，避免操作中出入操作間。將全部包裝（牛皮紙）去掉，編號。6.9.1.3 開啟微生物檢測室空氣過濾裝置并使其工作30min。6.9.1.4 操作人員用肥皂洗手，關閉紫外線殺菌燈，進入緩沖間，換工作鞋，再用0.1%新潔爾滅或用75%乙醇棉球擦手，待干后，穿戴無菌衣、帽、口罩。6.9.1.5 操作前先用

15、75%乙醇棉球擦手，并擦拭供試品瓶、盒、袋等的開口周圍，待干后將供試品瓶、盒、袋啟封，啟封后先檢查瓶蓋內側及瓶口周圍有無生霉、長螨的跡象，對肉眼可見變質者，若經(jīng)證實為生霉、長螨即可判定為不合格，無須繼續(xù)檢驗。6.9.2 細菌、霉菌、酵母菌計數(shù)。6.9.2.1 檢驗程序： 供試品1:10供試液1:100供試液1:1000供試液注皿培養(yǎng)菌落計數(shù)報告 6.9.2.2 操作步驟：(細菌、霉菌)6.9.2.2.1 供試液制備：經(jīng)陰性對照取樣后，按各類制劑制備供試液的方法（見供試液的制備）制備。6.9.2.2.2 稀釋及取樣稀釋：取1ml 吸管1支，吸取混勻的1:10供試液1ml，在離稀釋劑液面上約1cm

16、處，測管壁注入裝有9ml的稀釋劑的的試管中，混勻成1:100的稀釋液，同法操作得到1:1000的稀釋液吸樣：用上述吸管分別取1:10、1:100、1:1000的供試液各1ml,注入23個平皿中.6.9.2.2.3 注皿與干燥事先將培養(yǎng)基融化，置45水浴中，備用，當供試液及各稀釋液均注入平皿后，以上述培養(yǎng)基傾注入平皿，每平皿約1520ml，轉動平皿，使樣液與培養(yǎng)基混勻后，置水平臺上待凝。培養(yǎng)基凝固后，在凈化條件下開蓋倒置或換滅菌的陶瓦蓋，使平板干燥，減少平板表面的水分，防止菌落蔓延生長，干燥時間一般在3h左右，干燥時間計入培養(yǎng)時限。6.9.2.2.4 培養(yǎng)：將上述平板倒置于適宜溫度的培養(yǎng)箱中，培

17、養(yǎng)。細菌于3035培養(yǎng)3天，霉菌于2328培養(yǎng)5天,必要時可延長至7天. 6.9.2.3 菌落計數(shù)：6.9.2.3.1 用肉眼直接計數(shù)，標記或在菌落計數(shù)器上點計，然后用5-10倍放大鏡檢查，是否遺漏。6.9.2.3.2 菌數(shù)報告規(guī)則細菌,酵母菌一般宜選取平均菌落數(shù)小于300cfu，作為菌數(shù)計算的依據(jù)，霉菌宜選取平均菌落數(shù)小于100cfu,作為菌數(shù)計算的依據(jù)。以最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報告1g,1ml或10cm供試品中所含的菌數(shù)如各稀釋級的平板均無菌落生長,或僅最低稀釋級的平板有菌落生長,但平均菌落數(shù)小于1時,以1乘以最低稀釋倍數(shù)的值報告菌數(shù).6.9.3.1 操作步驟(大腸埃希菌)6.9

18、.3.1.1 取膽鹽乳糖培養(yǎng)基3份，每份100ml，2份分別加入規(guī)定量的供試液，1份為供試品,其中1份加入對照菌50100個作陽性對照，第3份加入與供試液等量的稀釋液作陰性對照。培養(yǎng)1824小時（必要可延至48小時）。陰性對照應無菌生長。取上述3份的培養(yǎng)物各0.2ml，分別接種至5ml mug培養(yǎng)基管內培養(yǎng)，分別于5小時與24小時，取未接種的mug培養(yǎng)基管作本底對照，將各管置365nm紫外光下觀察。陽性對照管呈現(xiàn)熒光，mug陽性。陽性；無熒光，mug陰性。然后加數(shù)滴靛基質試液于mug管內，液面呈玫瑰紅色為陽性，呈試劑本色為陰性。當陰性管呈陰性，陽性對照正常生長，供試液膽鹽乳糖培養(yǎng)基培養(yǎng)液澄明，

19、并證明無菌生長，判未檢出大腸埃希菌。供試液mug陽性，靛基質陽性，判檢出大腸埃希菌；mug陰性，靛基質陰性，判未檢出大腸埃希菌。6.9.3.1.2 如mug陽性、靛基質陰性，或mug陰性、靛基質陽性，均應從取供試液膽鹽乳糖培養(yǎng)基培養(yǎng)物劃線于曙紅亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)1824小時，如上述供試液培養(yǎng)物的分離平板無菌落生長，判未檢出大腸埃希菌?；蛴芯渖L，菌落形態(tài)的特征與下表不符, 判未檢出大腸埃希菌,若平板上生長的菌落與下表菌落形態(tài)特征相似或疑似,應進行分離、純化、染色鏡檢和適宜的鑒定試驗,確認是否為大腸埃希菌大腸埃希菌菌落形態(tài)特征培養(yǎng)基菌落形態(tài)曙紅亞甲藍瓊脂紫黑色、淺紫色、藍

20、紫色或粉紅色,菌落中心呈深紫色或無明顯暗色中心,圓形,稍凸起,邊緣整齊,表面光滑,濕潤,常有金屬光澤.麥康凱瓊脂鮮桃紅色或微紅色,菌落中心呈深桃色,圓形,扁形, 邊緣整齊,表面光滑,濕潤6.9.3.2 操作步驟(大腸菌群)取含適量(不少于10ml)的乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基管3支,分別加入1:10的供試液1ml、1:10的供試液1ml、1:100的供試液1ml,另取一支乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基加入稀釋液1ml作為陰性對照管,培養(yǎng)1824小時.乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基管若無菌生長或有菌生長但不產酸產氣, 判未檢出大腸菌群,若產酸產氣,應將發(fā)酵管中的培養(yǎng)物分別劃線接種于曙紅亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基, 培養(yǎng)1824小時.若平板上無菌落生長,或生長的菌落與下表的菌落形態(tài)特征不符或非革蘭陰性無芽孢桿菌, 判未檢出大腸菌群,若