1細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)

1、 洋蔥表皮細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)洋蔥表皮細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu) 骨骼肌超微結(jié)構(gòu)骨骼肌超微結(jié)構(gòu) 脫氧核苷酸結(jié)構(gòu)模型脫氧核苷酸結(jié)構(gòu)模型 從從16世紀(jì)后期到世紀(jì)后期到19世紀(jì)世紀(jì)30年代，是細(xì)胞發(fā)現(xiàn)和細(xì)胞知識(shí)的積累階段。年代，是細(xì)胞發(fā)現(xiàn)和細(xì)胞知識(shí)的積累階段。 通過(guò)對(duì)大量動(dòng)植物的觀察，人們逐漸意識(shí)到不同的生物都是由形形色色通過(guò)對(duì)大量動(dòng)植物的觀察，人們逐漸意識(shí)到不同的生物都是由形形色色 的細(xì)胞構(gòu)成的。的細(xì)胞構(gòu)成的。 Hooke觀察到的軟木結(jié)構(gòu)觀察到的軟木結(jié)構(gòu)Hooke使用的顯微鏡使用的顯微鏡 從從19世紀(jì)世紀(jì)30年代到年代到20世紀(jì)初期，細(xì)胞學(xué)說(shuō)形成后，開(kāi)始了在顯微水世紀(jì)初期，細(xì)胞學(xué)說(shuō)形成后，開(kāi)始了在顯微水 平研究細(xì)胞的結(jié)

2、構(gòu)與功能。形態(tài)學(xué)、胚胎學(xué)和染色體知識(shí)的積累，平研究細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能。形態(tài)學(xué)、胚胎學(xué)和染色體知識(shí)的積累， 使人們認(rèn)識(shí)了細(xì)胞在生命活動(dòng)中的重要作用。使人們認(rèn)識(shí)了細(xì)胞在生命活動(dòng)中的重要作用。 1893年年Hertwig的專著的專著細(xì)胞與組織細(xì)胞與組織（Die Zelle und die Gewebe） 出版，標(biāo)志著細(xì)胞學(xué)的誕生。出版，標(biāo)志著細(xì)胞學(xué)的誕生。 1896年哥倫比亞大學(xué)年哥倫比亞大學(xué)Wilson編著的編著的細(xì)胞發(fā)育與遺傳細(xì)胞發(fā)育與遺傳（The Cell in Development and Heredity）、）、1920年墨爾本大學(xué)年墨爾本大學(xué)Agar編著的編著的細(xì)胞細(xì)胞 學(xué)學(xué)（Cytol

3、ogy ）都是這一領(lǐng)域最早的教科書(shū)。）都是這一領(lǐng)域最早的教科書(shū)。 從從20世紀(jì)世紀(jì)30年代到年代到70年代，電子顯微鏡技術(shù)出現(xiàn)后，把細(xì)胞學(xué)帶入年代，電子顯微鏡技術(shù)出現(xiàn)后，把細(xì)胞學(xué)帶入 了第三大發(fā)展時(shí)期，這短短了第三大發(fā)展時(shí)期，這短短40年間不僅發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞的各類超微結(jié)構(gòu)，而年間不僅發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞的各類超微結(jié)構(gòu)，而 且也認(rèn)識(shí)了細(xì)胞膜、線粒體、葉綠體等不同結(jié)構(gòu)的功能，使細(xì)胞學(xué)發(fā)展且也認(rèn)識(shí)了細(xì)胞膜、線粒體、葉綠體等不同結(jié)構(gòu)的功能，使細(xì)胞學(xué)發(fā)展 為細(xì)胞生物學(xué)。為細(xì)胞生物學(xué)。De Robertis等人等人1924年出版的年出版的普通細(xì)胞學(xué)普通細(xì)胞學(xué) （General Cytology）在）在1965年第四版的

4、時(shí)候定名為年第四版的時(shí)候定名為細(xì)胞生物學(xué)細(xì)胞生物學(xué) （Cell Biology），這是最早的細(xì)胞生物學(xué)教材之一。），這是最早的細(xì)胞生物學(xué)教材之一。 線粒體結(jié)構(gòu)示意圖線粒體結(jié)構(gòu)示意圖線粒體超微結(jié)構(gòu)線粒體超微結(jié)構(gòu) 從從20世紀(jì)世紀(jì)70年代基因重組技術(shù)的出現(xiàn)到當(dāng)前，細(xì)胞生物學(xué)與分子生年代基因重組技術(shù)的出現(xiàn)到當(dāng)前，細(xì)胞生物學(xué)與分子生 物學(xué)的結(jié)合愈來(lái)愈緊密，研究細(xì)胞的分子結(jié)構(gòu)及其在生命活動(dòng)中的作用物學(xué)的結(jié)合愈來(lái)愈緊密，研究細(xì)胞的分子結(jié)構(gòu)及其在生命活動(dòng)中的作用 成為主要任務(wù)，基因調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、腫瘤生物學(xué)、細(xì)胞分化和凋亡是成為主要任務(wù)，基因調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、腫瘤生物學(xué)、細(xì)胞分化和凋亡是 當(dāng)代的研究熱點(diǎn)。當(dāng)代

5、的研究熱點(diǎn)。 細(xì)胞凋亡示意圖細(xì)胞凋亡示意圖細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑細(xì)胞分化示意圖細(xì)胞分化示意圖 可把物體放大可把物體放大1500倍，分辨的最小倍，分辨的最小 極限為極限為0.2m。 用高速電子束代替光束，放大倍數(shù)達(dá)用高速電子束代替光束，放大倍數(shù)達(dá)80 萬(wàn)倍萬(wàn)倍，分辨率最小極限達(dá)，分辨率最小極限達(dá)0.10.2nm。 AB AB AB F2 F1 鏡座鏡座 鏡柱鏡柱 鏡臂鏡臂 鏡筒鏡筒 物鏡轉(zhuǎn)換器物鏡轉(zhuǎn)換器 鏡臺(tái)鏡臺(tái) 調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)器 粗準(zhǔn)焦螺旋粗準(zhǔn)焦螺旋 細(xì)準(zhǔn)焦螺旋細(xì)準(zhǔn)焦螺旋 機(jī)械部分機(jī)械部分 照明部分照明部分 反光鏡反光鏡 聚光器聚光器 光圈光圈 光學(xué)部分光學(xué)部分 目鏡目鏡 物鏡物鏡 鏡頭

6、鏡頭放大倍數(shù)放大倍數(shù)鏡身鏡身數(shù)值孔徑數(shù)值孔徑工作距離工作距離/mm 低倍鏡低倍鏡10短短0.37 高倍鏡高倍鏡40較長(zhǎng)較長(zhǎng)0.50.5 油鏡油鏡100長(zhǎng)長(zhǎng)1.30.2 不同放大倍數(shù)物鏡不同放大倍數(shù)物鏡 的工作距離的工作距離 l看不到物象的可能原因：看不到物象的可能原因： 物鏡未對(duì)正通光孔，對(duì)正后再觀察；物鏡未對(duì)正通光孔，對(duì)正后再觀察； 標(biāo)本未放到視野內(nèi)，移動(dòng)標(biāo)本至通標(biāo)本未放到視野內(nèi)，移動(dòng)標(biāo)本至通 光孔中央；光孔中央； 調(diào)節(jié)器轉(zhuǎn)動(dòng)太快，超過(guò)焦點(diǎn)，應(yīng)重調(diào)節(jié)器轉(zhuǎn)動(dòng)太快，超過(guò)焦點(diǎn)，應(yīng)重 新調(diào)焦；新調(diào)焦； 視野內(nèi)光線太強(qiáng)，不易觀察到未染視野內(nèi)光線太強(qiáng)，不易觀察到未染 色的標(biāo)本片，將光線調(diào)暗再觀察。色的標(biāo)

7、本片，將光線調(diào)暗再觀察。 1 2 3 4 5 6 相差顯微鏡光路圖示相差顯微鏡光路圖示 1-目鏡；目鏡；2-物鏡；物鏡；3-標(biāo)本片標(biāo)本片 4-聚光器；聚光器；5-相板；相板；6-環(huán)狀光闌環(huán)狀光闌 環(huán)狀光闌環(huán)狀光闌 環(huán)狀光闌位于光源與聚光器之間，是環(huán)狀孔形成的光闌，它們的直環(huán)狀光闌位于光源與聚光器之間，是環(huán)狀孔形成的光闌，它們的直 徑和孔寬與不同物鏡相匹配。大小不同的環(huán)狀光闌成一轉(zhuǎn)盤(pán)。更換放徑和孔寬與不同物鏡相匹配。大小不同的環(huán)狀光闌成一轉(zhuǎn)盤(pán)。更換放 大率不同的物鏡時(shí)，要同時(shí)更換相應(yīng)的環(huán)狀光闌。其作用是使照明光大率不同的物鏡時(shí)，要同時(shí)更換相應(yīng)的環(huán)狀光闌。其作用是使照明光 線從環(huán)狀的透明區(qū)進(jìn)入聚光

8、鏡，再斜射到標(biāo)本上。線從環(huán)狀的透明區(qū)進(jìn)入聚光鏡，再斜射到標(biāo)本上。 相差物鏡相差物鏡(鏡頭上標(biāo)有鏡頭上標(biāo)有PC或或PH字樣字樣) 物鏡的后焦平面上裝有相板，相板上和環(huán)狀光闌相對(duì)應(yīng)的環(huán)狀部分物鏡的后焦平面上裝有相板，相板上和環(huán)狀光闌相對(duì)應(yīng)的環(huán)狀部分 大多數(shù)涂有吸收膜和推遲相位膜，其他部分完全透明。從標(biāo)本上射過(guò)大多數(shù)涂有吸收膜和推遲相位膜，其他部分完全透明。從標(biāo)本上射過(guò) 來(lái)的光線，繞射光部分穿過(guò)透明區(qū)；直射光則穿過(guò)相板的環(huán)狀部分，來(lái)的光線，繞射光部分穿過(guò)透明區(qū)；直射光則穿過(guò)相板的環(huán)狀部分， 一般所用的相板推遲相位一般所用的相板推遲相位1/4波長(zhǎng)，吸收波長(zhǎng)，吸收80%的直射光，使直射光和的直射光，使直

9、射光和 繞射光的強(qiáng)度接近，明暗反差增大。由于透明標(biāo)本內(nèi)部構(gòu)造的折射率繞射光的強(qiáng)度接近，明暗反差增大。由于透明標(biāo)本內(nèi)部構(gòu)造的折射率 不同，產(chǎn)生繞射光的相位有不同程度的推遲，繞射光和直射光的干涉不同，產(chǎn)生繞射光的相位有不同程度的推遲，繞射光和直射光的干涉 作用將相位差變成振幅差。作用將相位差變成振幅差。 綠色濾光片綠色濾光片 在環(huán)狀光闌下面置綠色濾光片于光路中，它可吸收紅色和藍(lán)色光，在環(huán)狀光闌下面置綠色濾光片于光路中，它可吸收紅色和藍(lán)色光， 使波長(zhǎng)范圍小的單色光線進(jìn)行照明，并有吸熱作用，能使相差觀察獲使波長(zhǎng)范圍小的單色光線進(jìn)行照明，并有吸熱作用，能使相差觀察獲 得良好的效果。一般選用中心波長(zhǎng)得良好

10、的效果。一般選用中心波長(zhǎng)546nm的綠色濾光鏡，濾光鏡插入的綠色濾光鏡，濾光鏡插入 后對(duì)比度就提高。后對(duì)比度就提高。 合軸調(diào)整望遠(yuǎn)鏡合軸調(diào)整望遠(yuǎn)鏡 為使環(huán)狀光闌的中心與物鏡的光軸完全在一直線上，必須拔出目鏡，為使環(huán)狀光闌的中心與物鏡的光軸完全在一直線上，必須拔出目鏡， 裝上特別的低倍望遠(yuǎn)鏡，使相板的暗環(huán)與環(huán)狀光闌的明環(huán)重合對(duì)齊，裝上特別的低倍望遠(yuǎn)鏡，使相板的暗環(huán)與環(huán)狀光闌的明環(huán)重合對(duì)齊， 才能發(fā)揮相差顯微鏡的效能。才能發(fā)揮相差顯微鏡的效能。 倒置顯微鏡倒置顯微鏡組成和普通顯微鏡一樣，只不過(guò)物鏡與照明系統(tǒng)顛倒，物組成和普通顯微鏡一樣，只不過(guò)物鏡與照明系統(tǒng)顛倒，物 鏡安裝在載物臺(tái)的下方，光源及聚光

11、器安裝在載物臺(tái)的上方。鏡安裝在載物臺(tái)的下方，光源及聚光器安裝在載物臺(tái)的上方。倒置相倒置相 差顯微鏡差顯微鏡用于觀察培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中的活細(xì)胞的細(xì)微結(jié)構(gòu)，由于工作用于觀察培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中的活細(xì)胞的細(xì)微結(jié)構(gòu)，由于工作 距離的限制，最大放大率為距離的限制，最大放大率為60，一般研究用倒置相差顯微鏡配置有，一般研究用倒置相差顯微鏡配置有 4、10、20及及40相差物鏡。相差物鏡。 。 熒光染料熒光染料激發(fā)光激發(fā)光熒光顏色熒光顏色應(yīng)用范圍應(yīng)用范圍 溴化乙錠（溴化乙錠（EB）藍(lán)紫藍(lán)紫紅紅DNA HO33258紫外紫外藍(lán)白藍(lán)白DNA 吖（吖（）啶橙（）啶橙（AO）藍(lán)光藍(lán)光綠綠(DNA)、紅、紅(RNA)DNA、RNA 派洛寧派洛寧Y綠光綠光紅紅RNA 異硫氰酸熒光素（異硫氰酸熒光素（FITC）藍(lán)光藍(lán)光黃綠黃綠蛋白質(zhì)、抗體標(biāo)記蛋白質(zhì)、抗體標(biāo)記 四乙基羅丹明四乙基羅丹明綠光綠光橘紅橘紅抗體標(biāo)記抗體標(biāo)記 四甲基異硫氰酸羅丹明四甲基異硫氰酸羅丹明綠光綠光橘紅橘紅抗體標(biāo)記抗體標(biāo)記 二乙酸酯熒光素（二乙酸酯熒光素（FDA）藍(lán)光藍(lán)