生物化學蛋白質化學二

1、生工學院生命科學系 2021-7-81 蛋白質分子的大小 1.蛋白質相對分子質量 1萬至幾萬. 2 .蛋白質相對分子質量的測定方法 根據(jù)化學組成測定最低相對分子質量 用物理化學方法來測蛋白質的相對分子質量 生工學院生命科學系 2021-7-82 一、蛋白質兩性解離和等電點 蛋白質分子中氨基酸殘基的蛋白質分子中氨基酸殘基的側鏈側鏈上存在游離的上存在游離的 氨基氨基和和羧基羧基，因此蛋白質與氨基酸一樣具有兩性，因此蛋白質與氨基酸一樣具有兩性 解離性質，具有特定的解離性質，具有特定的等電點（等電點（pI）。 溶液溶液pHpI時時，蛋白質所帶正負電荷相等；，蛋白質所帶正負電荷相等； pHpI時時，蛋白

2、質帶凈負電荷；，蛋白質帶凈負電荷； pHpI時時，蛋白質帶凈正電荷。，蛋白質帶凈正電荷。 生工學院生命科學系 2021-7-83 蛋白質兩性解離和等電點 主要由肽鏈中可解離的功能團決定 兩性解離： 蛋白質的等電點PI： 蛋白質等離子點： 蛋白質電泳：用于蛋白質的分離 鑒定。 生工學院生命科學系 2021-7-84 等電點時特點：等電點時特點： （1）凈電荷為零）凈電荷為零 （2）一定離子強度的緩沖液：等離子點特征常數(shù)）一定離子強度的緩沖液：等離子點特征常數(shù) （3）多數(shù)蛋白質在水中等電點偏酸）多數(shù)蛋白質在水中等電點偏酸 堿性堿性AA/酸性酸性AA 等電點等電點 胃蛋白酶胃蛋白酶 0.2 1. 血

3、紅蛋白血紅蛋白 1.7 6 細胞色素細胞色素C 2.9 10.7 菊糖酶菊糖酶 0.34 8.2 （4）導電性、溶解度、黏度及滲透壓都最小。）導電性、溶解度、黏度及滲透壓都最小。 等電沉淀和白泳：等電沉淀和白泳： 遷移率與凈電荷量、分子大小、分子形狀等有關遷移率與凈電荷量、分子大小、分子形狀等有關 生工學院生命科學系 2021-7-85 等電點沉淀和等電點沉淀和電電泳：泳： 等電點沉淀：遷移率與凈電荷量、等電點沉淀：遷移率與凈電荷量、 分子大小、分子形狀等有關分子大小、分子形狀等有關 電泳：電泳：帶電粒子在電場中移動的帶電粒子在電場中移動的 現(xiàn)象稱為現(xiàn)象稱為電電泳泳 生工學院生命科學系 202

4、1-7-86 蛋白質分子在一定蛋白質分子在一定pH的溶液中可帶凈的溶液中可帶凈 的的負負電荷或電荷或正正電荷，故可在電場中發(fā)生電荷，故可在電場中發(fā)生 移動。移動。 不同蛋白質分子所帶不同蛋白質分子所帶電荷量電荷量不同，且不同，且分分 子大小子大小也不同，故在電場中的移動速度也不同，故在電場中的移動速度 也不同，據(jù)此可互相分離。也不同，據(jù)此可互相分離。 生工學院生命科學系 2021-7-87 二、蛋白質膠體性質 蛋白質溶液是膠體溶液 維持蛋白質的膠體系統(tǒng)穩(wěn)定的因素 1100nm大小的質點在動力學上是穩(wěn)定的. 某一pH下質點帶有同種電荷，互相排斥。可構成雙電層 質點能與溶劑（水）形成水化層，相互間

5、不易靠攏。 生工學院生命科學系 2021-7-88 2.蛋白質具有膠體溶液的性質蛋白質具有膠體溶液的性質 蛋白質分子的顆粒直徑已蛋白質分子的顆粒直徑已達達1100nm，處于膠體，處于膠體 顆粒的范圍。（親水膠體）顆粒的范圍。（親水膠體） 蛋白質具有膠體溶液的性質：布朗運動、丁道爾蛋白質具有膠體溶液的性質：布朗運動、丁道爾 現(xiàn)象、不能透過半透膜、具有吸附力等。現(xiàn)象、不能透過半透膜、具有吸附力等。 生工學院生命科學系 2021-7-89 3 3、穩(wěn)定蛋白質親水溶膠的兩個重要、穩(wěn)定蛋白質親水溶膠的兩個重要 因素：因素： |水化膜水化膜 - 通過通過氫鍵氫鍵與水結合與水結合 |表面電荷表面電荷- 在非

6、等電點狀態(tài)下，在非等電點狀態(tài)下，雙電層雙電層，帶，帶 同性電荷蛋白質分子互相排斥。同性電荷蛋白質分子互相排斥。 生工學院生命科學系 2021-7-810 蛋白質顆粒的表面電荷和水化膜蛋白質顆粒的表面電荷和水化膜 + + + + + + + 帶正電荷的蛋白質帶正電荷的蛋白質 帶負電荷的蛋白質帶負電荷的蛋白質在等電點的蛋白質在等電點的蛋白質 酸酸堿堿 酸酸堿堿 脫水作用脫水作用脫水作用脫水作用脫水作用脫水作用 生工學院生命科學系 2021-7-811 4.4.蛋白質凝膠蛋白質凝膠 凝膠具有脹潤作用：凝膠具有脹潤作用： 分類：分類：（1）可逆性凝膠可逆性凝膠 （2）不可逆性凝膠）不可逆性凝膠 部分破

7、壞水化膜、適當加熱和遠離等電點部分破壞水化膜、適當加熱和遠離等電點 生工學院生命科學系 2021-7-812 5.5.蛋白質膠體性質的應用蛋白質膠體性質的應用 1、蛋白質是生物大分子、蛋白質是生物大分子 不能透不能透 過半透膜過半透膜 2、蛋白質溶液是穩(wěn)定的膠體溶液、蛋白質溶液是穩(wěn)定的膠體溶液 具有親水膠體性質具有親水膠體性質 3、臨床應用、臨床應用 維持有效循環(huán)血量、維持有效循環(huán)血量、 實驗室透析技術實驗室透析技術 生工學院生命科學系 2021-7-813 三、蛋白質的變性作用 吳憲教授是中國協(xié)和醫(yī)科大學(原北京協(xié)和醫(yī)學院)生物 化學系創(chuàng)始人，曾任中國生理學會會長。他早在20世 紀30年代就

8、提出了蛋白質變性理論，在中國和國際生 物界有很高的學術地位和廣泛的影響。 變性 復性 生工學院生命科學系 2021-7-814 1.蛋白質變性的本質 蛋白質分子中次級鍵被破壞，引起天然構象松 散。不涉用共價鍵的斷裂（肽鍵和二硫鍵）， 蛋白質只有在比較溫和的條件下才傾向于穩(wěn)定。 溫和條件指的是：溫度為040， pH范圍為5.59.0， 沒有有機溶劑。 生工學院生命科學系 2021-7-815 2.導致蛋白質變性的因素 物理因素 高溫、高壓、超聲波、劇烈振蕩、攪拌、X射 線和紫外線等； 化學因素 強酸、強堿、尿素、胍、去污劑、重金屬鹽 （Hg2、Ag+、Pb2等）、三氯乙酸、濃乙醇等 都能蛋白質變

9、性。 生工學院生命科學系 2021-7-816 3.常用的變性劑 尿素：與多肽主鏈競爭氫鍵；增加非極性側 鏈在水中的溶解度，從而降低疏水相互作用。 CC C NN HH H H O O O 蛋白質肽鏈 尿素分子 生工學院生命科學系 2021-7-817 4.變性蛋白質的特點 生物活性喪失： 某些物理化學性質改變： 易與相應的試劑起化學反應； 溶解度降低，易形成沉淀析出； 結晶能力喪失； 分子不對稱性加大； 粘度增加； 紫外吸收光譜有所改變； 肽鍵易被酶水解和消化。 生工學院生命科學系 2021-7-818 5.蛋白質的復性 當變性因素除去后，變性蛋白質又可 重新回復到天然構象，這一現(xiàn)象稱為 蛋

10、白質的復性。 可逆變性（三、四級結構）與不可逆 變性（二、三、四） 不是所有的變性蛋白都能復性。大部 分蛋白質變性后不能恢復其原有的各 種性質 復性后的蛋白質多數(shù)不能完全恢復活 力。 生工學院生命科學系 2021-7-819 四、蛋白質的沉淀 改變穩(wěn)定蛋白質膠體溶液的條件時，穩(wěn)定性就 被破壞，蛋白質分子相聚集而從溶液中析出， 這種現(xiàn)象稱為蛋白質的沉淀作用。 帶正電荷的蛋白質帶正電荷的蛋白質 脫水作用脫水作用 OH- H+ 在等電點的蛋白質在等電點的蛋白質 帶負電荷的蛋白質帶負電荷的蛋白質 脫水作用脫水作用 帶正電荷的蛋白質帶正電荷的蛋白質 不穩(wěn)定的蛋白質顆粒聚不穩(wěn)定的蛋白質顆粒聚 集而沉淀集而

11、沉淀 帶負電荷的蛋白質帶負電荷的蛋白質 + + + + + + + + + + + + + + - - - - - - - - - - - - - - - - OH- H+ 生工學院生命科學系 2021-7-820 沉淀蛋白質的方法 、鹽析法(salting out)：定義，原理，應用 、重金屬鹽法：pHpI PrM PrM 、生物堿試劑：三氯乙酸，單寧酸，苦味酸， 鎢酸等。 、有機溶劑法：定義，原理，注意 5、加熱沉淀蛋白質 生工學院生命科學系 2021-7-821 1.鹽析中性鹽沉淀 定義：在蛋白質溶液中加入大量中性鹽，定義：在蛋白質溶液中加入大量中性鹽， 以破壞蛋白質的膠體性質，使蛋白質

12、從以破壞蛋白質的膠體性質，使蛋白質從 溶液中沉淀析出，稱為鹽析溶液中沉淀析出，稱為鹽析 作用機制作用機制:中和電荷的同時破壞水化膜中和電荷的同時破壞水化膜; ; 生工學院生命科學系 2021-7-822 2.重金屬鹽沉淀重金屬鹽沉淀 蛋白質分子在蛋白質分子在PH大于其等電點時，帶負電，易大于其等電點時，帶負電，易 與重金屬離子如與重金屬離子如Hg+、Pb2+、Cu2+等結合生成等結合生成 不溶于水的蛋白質鹽沉淀，引起蛋白質變性。不溶于水的蛋白質鹽沉淀，引起蛋白質變性。 人誤食重金屬鹽中毒是因為重金屬鹽與蛋白質沉人誤食重金屬鹽中毒是因為重金屬鹽與蛋白質沉 淀變性有關，臨床上采用口服大量新鮮牛奶、

13、豆淀變性有關，臨床上采用口服大量新鮮牛奶、豆 漿搶救重金屬中毒的病人，就是根據(jù)牛奶、豆?jié){漿搶救重金屬中毒的病人，就是根據(jù)牛奶、豆?jié){ 等蛋白質能與重金屬鹽結成不溶沉淀物，可阻止等蛋白質能與重金屬鹽結成不溶沉淀物，可阻止 機體對重金屬鹽的吸收。然后用催吐劑將結合的機體對重金屬鹽的吸收。然后用催吐劑將結合的 重金屬嘔吐出來，達到搶救目的。重金屬嘔吐出來，達到搶救目的。 生工學院生命科學系 2021-7-823 3.生物堿試劑沉淀蛋白質生物堿試劑沉淀蛋白質 蛋白質分子在蛋白質分子在PH小于其等電點時，帶小于其等電點時，帶 正電，易于生物堿（苦味酸、三氯乙酸、正電，易于生物堿（苦味酸、三氯乙酸、 磺基水

14、楊酸等）結合，生成不溶性鹽，磺基水楊酸等）結合，生成不溶性鹽， 引起蛋白質變性。引起蛋白質變性。 臨床上用三氯乙酸作尿蛋白的檢測試劑。臨床上用三氯乙酸作尿蛋白的檢測試劑。 生工學院生命科學系 2021-7-824 4.有機溶劑沉淀法有機溶劑沉淀法 與水互溶的有機溶劑，如酒精、甲醇等與水互溶的有機溶劑，如酒精、甲醇等 破壞蛋白質水化層，使得蛋白質沉淀。破壞蛋白質水化層，使得蛋白質沉淀。 （在等電點下效果更好）（在等電點下效果更好） 但是常溫下，有機溶劑會引起蛋白質的但是常溫下，有機溶劑會引起蛋白質的 變性，如酒精滅菌，而在低溫下蛋白質變性，如酒精滅菌，而在低溫下蛋白質 變性減慢。因此利用有機溶劑

15、沉淀蛋白變性減慢。因此利用有機溶劑沉淀蛋白 質，為防止蛋白質變性，可在低溫下進質，為防止蛋白質變性，可在低溫下進 行，嚴格控制引起變性的各種因素。行，嚴格控制引起變性的各種因素。 生工學院生命科學系 2021-7-825 5.加熱沉淀蛋白質 加熱使蛋白質變性沉淀 蛋白質變性和沉淀是二個不同概念 蛋白質變性不一定沉淀 蛋白質沉淀也不一定變性 生工學院生命科學系 2021-7-826 五、蛋白質的呈色反應 蛋白質分子中某些氨基酸的側鏈基團和 肽鍵，可發(fā)生一些顏色反應。它們可用 于某氨基酸的鑒定、蛋白質定性試驗和 定量測定。 生工學院生命科學系 2021-7-827 五、蛋白質的呈色反應 蛋白質的呈

16、色反應就是氨基酸某些基團蛋白質的呈色反應就是氨基酸某些基團 及肽鍵與一定試劑所產(chǎn)生的化學反應。及肽鍵與一定試劑所產(chǎn)生的化學反應。 利用這些反應，可對蛋白質進行定量測利用這些反應，可對蛋白質進行定量測 定。但是這些化合反應不是蛋白質的特定。但是這些化合反應不是蛋白質的特 征反應，在鑒定蛋白質時，除利用這些征反應，在鑒定蛋白質時，除利用這些 方法外，還必須結合蛋白質的其它性質方法外，還必須結合蛋白質的其它性質 考慮。考慮。 生工學院生命科學系 2021-7-828 1.雙縮脲反應 蛋白質與堿性蛋白質與堿性Cu2+形成紫紅色絡合形成紫紅色絡合 物反應這是蛋白質分子中肽鏈的反物反應這是蛋白質分子中肽鏈

17、的反 應。肽鏈越多，反應顏色越深。氨應。肽鏈越多，反應顏色越深。氨 基酸無此反應?？捎糜诘鞍踪|定量、基酸無此反應?？捎糜诘鞍踪|定量、 定性，也可用于蛋白質水解程度的定性，也可用于蛋白質水解程度的 測定測定 生工學院生命科學系 2021-7-829 2.福林試劑反應（酚試劑反應） 福林試劑：磷鉬酸福林試劑：磷鉬酸- -磷鎢酸磷鎢酸 在堿性條件下，蛋白質與硫酸銅發(fā)生反應在堿性條件下，蛋白質與硫酸銅發(fā)生反應 蛋白質蛋白質- -銅絡合物，將福林試劑還原，產(chǎn)銅絡合物，將福林試劑還原，產(chǎn) 生磷鉬藍和磷鎢藍混合物生磷鉬藍和磷鎢藍混合物 生工學院生命科學系 2021-7-830 3.乙醛酸反應 在蛋白質溶液中

18、加入HCOCOOH， 將濃硫酸沿管壁緩慢加入，不使相 混，在液面交界處，即有紫色環(huán)形 成。 色氨酸的反應（吲哚環(huán)的反應） 鑒定蛋白質中是否含有色氨酸 生工學院生命科學系 2021-7-831 4.茚三酮反應 在在PH5.7時，蛋白質與茚三酮時，蛋白質與茚三酮 可產(chǎn)生顏色反應?？捎糜诘翱僧a(chǎn)生顏色反應?？捎糜诘?白質的定性和定量。白質的定性和定量。 生工學院生命科學系 2021-7-832 六、蛋白質的免疫學性質六、蛋白質的免疫學性質 抗原：指能刺激機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫抗原：指能刺激機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫 應答，并能與相應的抗體特異性結合應答，并能與相應的抗體特異性結合 的物質。的物質。 抗體：由相

19、應抗原刺激機體的免疫系統(tǒng)抗體：由相應抗原刺激機體的免疫系統(tǒng) 而由而由-淋巴細胞新產(chǎn)生的免疫球蛋白。淋巴細胞新產(chǎn)生的免疫球蛋白。 換句話說，抗體是動物針對外來物質換句話說，抗體是動物針對外來物質 的出現(xiàn)而合成的一種蛋白質。的出現(xiàn)而合成的一種蛋白質。 免疫反應：指抗原與抗體所引起的反應。免疫反應：指抗原與抗體所引起的反應。 過敏反應：免疫反應拌有組織損傷或生過敏反應：免疫反應拌有組織損傷或生 理功能紊亂。理功能紊亂。 生工學院生命科學系 2021-7-833 第五節(jié)蛋白質的提取、分離和純化的基本原 理 蛋白質的分離純化是研究其結構與功蛋白質的分離純化是研究其結構與功 能的基礎。在生物制藥工業(yè)中，蛋

20、能的基礎。在生物制藥工業(yè)中，蛋 白質、酶、多肽類激素等藥物生產(chǎn)白質、酶、多肽類激素等藥物生產(chǎn) 制備都涉及到蛋白質分離純化的問制備都涉及到蛋白質分離純化的問 題。蛋白質分離純化的工藝過程，題。蛋白質分離純化的工藝過程， 既要考慮盡可能的除去雜蛋白，又既要考慮盡可能的除去雜蛋白，又 要保持目的蛋白的產(chǎn)量，也就是要要保持目的蛋白的產(chǎn)量，也就是要 提高回收率提高回收率。 生工學院生命科學系 2021-7-834 一、提取 1.選材：新鮮、富含目的蛋白且來源方便 2.組織細胞的粉碎：胞內及膜中蛋白 1）物理法：如超聲、勻漿、加砂研磨、高壓 擠壓等 2）化學法：如EDTA、SDS等 3）酶法：如自溶法、外

21、加酶法（纖維素酶、 果膠酶、溶菌酶等） 3.提?。哼m當溶媒、適當條件、適當提取時間和 次數(shù)、溶菌酶處理（分解肽聚糖）或用表面活性、溶菌酶處理（分解肽聚糖）或用表面活性 劑處理。劑處理。 生工學院生命科學系 2021-7-835 二、分離純化 從組織細胞中提取的蛋白質溶液，含有 許多不同分子量的蛋白質，要獲取目 的蛋白，須進一步分離純化，將目的 蛋白質與其它蛋白質分開。 分離原理及原則：利用欲分離蛋白質的 溶解度、分子大小、電荷、吸附性質、 對配體分子的特殊的親和力。從混雜 蛋白質中分離出一個特殊蛋白質。 生工學院生命科學系 2021-7-836 基本步驟 選材 組織細胞破碎：機械法、物理法、化

22、學法、酶 法。 提?。哼x用適當?shù)娜軇?分離純化：根據(jù)等分離蛋白質的特異理化性質 設計分離純化方法。 結晶：結晶過程本身也伴隨著一定程度的純化。 鑒定、分析：純度、含量、相對分子質量等。 生工學院生命科學系 2021-7-837 （一）根據(jù)溶解度不同的分離方法 利用各種蛋白質的溶解度差異進行分利用各種蛋白質的溶解度差異進行分 離。影響蛋白質溶解度的因素有離。影響蛋白質溶解度的因素有PH 值、離子強度、溶液的介電常數(shù)等，值、離子強度、溶液的介電常數(shù)等， 各種蛋白質的溶解度取決于它們的分各種蛋白質的溶解度取決于它們的分 子結構，如：氨基酸組成、極性和非子結構，如：氨基酸組成、極性和非 極性基團的多少

23、等。極性基團的多少等。 生工學院生命科學系 2021-7-838 1.等電點沉淀 蛋白質在蛋白質在PI使溶解度最小，使溶解度最小， 此方法常與其它分離方法配合使此方法常與其它分離方法配合使 用。用。 生工學院生命科學系 2021-7-839 2.鹽析沉淀 不同蛋白質可通過加入不同飽和度的不同蛋白質可通過加入不同飽和度的 中式鹽分別沉淀出來（即分級沉中式鹽分別沉淀出來（即分級沉 淀）。淀）。 常用飽和硫酸銨來沉淀蛋白質。此法常用飽和硫酸銨來沉淀蛋白質。此法 可用于工業(yè)大規(guī)模分離?？捎糜诠I(yè)大規(guī)模分離。 生工學院生命科學系 2021-7-840 3.低溫有機溶劑有機溶劑沉淀 利用有機溶劑能降低在利

24、用有機溶劑能降低在Pro水中的溶水中的溶 解度，使蛋白質沉淀。解度，使蛋白質沉淀。 常用的有機溶劑有乙醇、甲醇、丙酮常用的有機溶劑有乙醇、甲醇、丙酮 等。在低溫下操作，有機溶劑一般等。在低溫下操作，有機溶劑一般 需預冷（需預冷（-40），緩慢加入。），緩慢加入。 生工學院生命科學系 2021-7-841 溫度對蛋白質溶解度的影響：在一溫度對蛋白質溶解度的影響：在一 定范圍內，定范圍內，040之間，大部分球之間，大部分球 狀蛋白質隨溫度升高而溶解度增大狀蛋白質隨溫度升高而溶解度增大 （血紅蛋白除外，（血紅蛋白除外，025隨隨溫度隨隨溫度 升高而溶解度降低）；在升高而溶解度降低）；在4050 以上

25、，大部分蛋白質不穩(wěn)定，開始以上，大部分蛋白質不穩(wěn)定，開始 變性。所以大多數(shù)蛋白質的分離在變性。所以大多數(shù)蛋白質的分離在 低溫下操作。低溫下操作。 生工學院生命科學系 2021-7-842 （二）根據(jù)蛋白質分子大小不同的分離方 法 1.透析:是將待提純的是將待提純的Pro溶液在裝在半透溶液在裝在半透 膜的透析袋里，放入膜的透析袋里，放入 蒸餾水中進行的，蒸餾水中進行的， 透析液可以進行更換，直至透析袋內無透析液可以進行更換，直至透析袋內無 機小分子物質降到最低點為止。機小分子物質降到最低點為止。 超濾:是利用壓力或離心力，強行使水和是利用壓力或離心力，強行使水和 其他小分子物質通過半透膜。而蛋白

26、質其他小分子物質通過半透膜。而蛋白質 截留在膜上。市場上有各種規(guī)格的半透截留在膜上。市場上有各種規(guī)格的半透 膜出售，可根據(jù)目的蛋白的分子量選擇膜出售，可根據(jù)目的蛋白的分子量選擇 不同孔徑的膜。不同孔徑的膜。 生工學院生命科學系 2021-7-843 2.分子篩層析（凝膠過濾、排阻層析） 又稱又稱凝膠過濾、分子排阻層析，它是根據(jù)分、分子排阻層析，它是根據(jù)分 子量大小分離混合物最有效的方法之一。子量大小分離混合物最有效的方法之一。 凝膠過濾所用的介質是凝膠珠，內部是多孔凝膠過濾所用的介質是凝膠珠，內部是多孔 的網(wǎng)狀結構。凝膠的膠聯(lián)度或孔度（網(wǎng)孔大的網(wǎng)狀結構。凝膠的膠聯(lián)度或孔度（網(wǎng)孔大 小）決定凝膠

27、的分級范圍，即能被該凝膠分小）決定凝膠的分級范圍，即能被該凝膠分 離開來的離開來的Pro混合物的分子量范圍?；旌衔锏姆肿恿糠秶?。 生工學院生命科學系 2021-7-844 3.密度梯度離心 每種蛋白質顆粒沉降到與自身密度相等的介 質密度梯度時，即停止不前，在離心管中被 分離成各自獨立的區(qū)帶。 常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度等。 密度梯度在管內分布是管底的密度大，向上 逐漸減少，待分離混合物平鋪在梯度的頂端， 離心采用水平轉頭高速進行。 生工學院生命科學系 2021-7-845 （三）根據(jù)蛋白質帶電性的分離方法 在一定在一定PH下，不同蛋白質所帶的電荷數(shù)量和性下，不同蛋白質所帶的電荷數(shù)量和

28、性 質不同。質不同。 生工學院生命科學系 2021-7-846 1.電泳 在外電場作用下，帶電顆粒向與其電性在外電場作用下，帶電顆粒向與其電性 相反的電極移動。帶電顆粒在電場中的相反的電極移動。帶電顆粒在電場中的 泳動速度取決于它所帶的凈電荷量以及泳動速度取決于它所帶的凈電荷量以及 顆粒的大小和形狀。顆粒的大小和形狀。 常用電泳的方法有：常用電泳的方法有： 1）醋酸纖維薄膜電泳：）醋酸纖維薄膜電泳：2）聚丙烯酰胺）聚丙烯酰胺 凝膠電泳凝膠電泳 3）等電點聚焦電泳：、）等電點聚焦電泳：、4）免疫電泳：、）免疫電泳：、 生工學院生命科學系 2021-7-847 2.離子交換層析 指一個溶液中的某一

29、種離子與另一種具有相同指一個溶液中的某一種離子與另一種具有相同 電荷的離子相互調換位置，即溶液中的離子電荷的離子相互調換位置，即溶液中的離子 跑到固體上，把固體上的離子替換下來。這跑到固體上，把固體上的離子替換下來。這 里的溶液稱流動相，固體稱固定相。里的溶液稱流動相，固體稱固定相。 在離子交換層析中，蛋白質對離子交換在離子交換層析中，蛋白質對離子交換 劑的結合力取決于彼此間相反電荷的靜劑的結合力取決于彼此間相反電荷的靜 電吸引，電吸引， 常用交換劑：離子交換纖維素、離子交常用交換劑：離子交換纖維素、離子交 換凝膠和離子交換樹脂。換凝膠和離子交換樹脂。 生工學院生命科學系 2021-7-848

30、 （四）根據(jù)配體特異性的分離方法 利用蛋白質等高分子化合物能和某些相利用蛋白質等高分子化合物能和某些相 些相對應的特異分子可逆結合的特性些相對應的特異分子可逆結合的特性, 通過親和層析法將不同的蛋白質分開。通過親和層析法將不同的蛋白質分開。 通常把特異分子稱為配基，它能被大分通常把特異分子稱為配基，它能被大分 子物質識別并與之結合，如抗原子物質識別并與之結合，如抗原抗抗 體、酶與底物、激素與受體蛋白質等。體、酶與底物、激素與受體蛋白質等。 生工學院生命科學系 2021-7-849 親和層析 是利用蛋白質分子對其配體分子特有的識 別能力 也即生物學親和力，建立起來的一種有效 的純化方法。 親和層

31、析的原理：先將待提純的某一Pro 的配基通過適當?shù)幕瘜W反應共價的連接 到類似瓊脂糖凝膠這類載體表面的功能 基團上，一般在配基與多糖基質上接 入一段連接臂，使配基與凝膠之間保持 足夠的距離，不致于因載體表面的空間 而阻礙待分離分子與配基的結合。 生工學院生命科學系 2021-7-850 三、鑒定三、鑒定 1、層析法：用層析法檢測樣品，若是純的蛋白、層析法：用層析法檢測樣品，若是純的蛋白 質，應是單一的洗脫峰。質，應是單一的洗脫峰。 2、電泳法：純的蛋白質它穩(wěn)定的范圍內，在一、電泳法：純的蛋白質它穩(wěn)定的范圍內，在一 系列不同系列不同PH條件下進行電泳時都以單一的泳動條件下進行電泳時都以單一的泳動

32、速度移動，在電泳圖譜上只有一個峰。速度移動，在電泳圖譜上只有一個峰。 3、免疫化學法：根據(jù)抗原與抗體反應的特異性，、免疫化學法：根據(jù)抗原與抗體反應的特異性， 用已知抗體檢查抗原或已知抗原檢查抗體。用已知抗體檢查抗原或已知抗原檢查抗體。 上述測定方法僅是從一個方面反映蛋白質純度，上述測定方法僅是從一個方面反映蛋白質純度， 具一定局限性，所以對某一種蛋白質純度的鑒定，具一定局限性，所以對某一種蛋白質純度的鑒定， 必須采用多種方法，綜合分析判斷。必須采用多種方法，綜合分析判斷。 生工學院生命科學系 2021-7-851 等電點沉淀和等電點沉淀和電電泳：泳： 等電點沉淀：遷移率與凈電荷量、等電點沉淀：

33、遷移率與凈電荷量、 分子大小、分子形狀等有關分子大小、分子形狀等有關 電泳：電泳：帶電粒子在電場中移動的帶電粒子在電場中移動的 現(xiàn)象稱為現(xiàn)象稱為電電泳泳 生工學院生命科學系 2021-7-852 五、蛋白質的呈色反應 蛋白質的呈色反應就是氨基酸某些基團蛋白質的呈色反應就是氨基酸某些基團 及肽鍵與一定試劑所產(chǎn)生的化學反應。及肽鍵與一定試劑所產(chǎn)生的化學反應。 利用這些反應，可對蛋白質進行定量測利用這些反應，可對蛋白質進行定量測 定。但是這些化合反應不是蛋白質的特定。但是這些化合反應不是蛋白質的特 征反應，在鑒定蛋白質時，除利用這些征反應，在鑒定蛋白質時，除利用這些 方法外，還必須結合蛋白質的其它性質方法外，還必須結合蛋白質的其它性質 考慮?？紤]。 生工學院生命科學系 2021-7-853 2.福林試劑反應（酚試劑反應） 福林試劑：磷鉬酸福林試劑：磷鉬酸- -磷鎢酸磷鎢酸 在堿性條件下，蛋白質與硫酸銅發(fā)生反應在堿性條件下，蛋白質與硫酸銅發(fā)生反應 蛋白質蛋白質- -銅絡合物，將福林試劑還原，產(chǎn)銅絡合物，將福林試劑還原，產(chǎn) 生磷鉬藍和磷鎢藍混合物生磷鉬藍和磷鎢藍混合物 生工學院生命科學系