生化檢測基礎(chǔ)

1、生化檢測常識 關(guān) 關(guān)關(guān) 愛 愛愛 生 生生 命 命命 創(chuàng) 創(chuàng)創(chuàng) 新 新新 無 無無 限 限限 生生生生化化化化檢檢檢檢測測測測常常常常識識識識 生化檢測常識- 1 - 目錄目錄 第一章第一章 生化檢測基本常識生化檢測基本常識 1.1 標本的獲得 （2） 第二章第二章 常規(guī)生化檢測項目簡介常規(guī)生化檢測項目簡介 2.1 生化項目的臨床意義 （2） 第三章第三章 生化儀參數(shù)測量原理生化儀參數(shù)測量原理 3.1 自動生化儀的分類（3） 3.2 分立式生化儀結(jié)構(gòu)（5） 3.3 生化檢驗的原理和方法 （6） 3.4 生化分析儀測定方法的分類及應(yīng)用度的計算 （9） 3.5.測定值計算方程 （10） 3.6 定

2、標參數(shù)和濃度的計算（17） 第四章第四章 幾個重要概念幾個重要概念 51 試劑空白（21） 52 樣本空白（21） 53 水空白 （21） 54 樣本 （21） 55 質(zhì)控物質(zhì)（21） 56 底物控制（21） 生化檢測常識- 2 - 第一章第一章生化檢測基本常識生化檢測基本常識 生化檢測是醫(yī)院檢驗科（或化驗室）常用的檢測手段，通常以人的血清為標本，通過測量血清 中各生化成份的含量，為臨床診斷提供依據(jù)。 1.1 標本的獲得 一般要求病人空腹時采靜脈血（全血） 。全血經(jīng)過離心機離心，分層為血清和血細胞，正常情況下， 上層顏色淺且透明（血清） ，下層顏色深且不透明（血細胞） 。有的血清較為特殊，或分

3、層不明顯 （融血） ，或血清不透明（脂血，呈牛奶狀） 。 第二章第二章 常規(guī)生化檢測項目簡介常規(guī)生化檢測項目簡介 2.1 生化項目的臨床意義生化項目的臨床意義 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alt）：）：又稱為谷丙轉(zhuǎn)氨酶（gpt）是衡量肝功能的重要指標，許多低端 醫(yī)療機構(gòu)在做體檢時僅測此一項生化項目。正常人一般在 40u/l 以內(nèi)。干粉試劑復(fù)溶后為單試 劑，液體試劑一般為雙試劑，應(yīng)用動力學(xué)法可計算結(jié)果。 蛋白：蛋白：通常測白蛋白（alb）和總蛋白（tp） ，終點法。一般用單試劑，有的 tp 試劑為雙試劑， 可用兩點終點法測。蛋白質(zhì)是血清的主要成份，大部份由肝細胞合成。通過蛋白的測定可以協(xié)

4、 助某些疾病的診斷。 血糖：血糖：血液中的葡萄糖簡稱血糖（glu） 。常用于糖尿病的診斷。正常人空腹血糖一般為 3.96.1mmol/l。市場上單、雙試劑的商品化試劑盒都有，可用終點法（單試劑）或兩點終點法 測量（雙試劑） 。 門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ast）：又稱為谷草轉(zhuǎn)氨酶（got） ，主要用于心肌和肝膽疾病及骨骼肌 病的診斷。是肝功能測試的常用指標之一。正常人一般在 40u/l 以內(nèi)。同 alt 一樣，無論單、 雙試劑，用動力學(xué)法可計算結(jié)果。 堿性磷酸酶（堿性磷酸酶（alp）：主要用于肝膽疾病及骨骼病的診斷。是肝功能測試的常用指標之一。正 常人一般在 240u/l 以內(nèi)。

5、用動力學(xué)法計算結(jié)果。 -谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（ggt）：）：主要用于肝膽疾病診斷。是肝功能測試的常用指標之一。正常人一 般在 50u/l 以內(nèi)。用動力學(xué)法計算結(jié)果。 膽紅素（膽紅素（bil）：）：膽紅素的測定，能準確反映黃疸的程度，判斷黃疸的類型。一般測量總膽紅素 （tbil）和直接膽紅素（dbil） 。 甘油三酯（甘油三酯（tg）：）：其含量測定是血脂分析的重要內(nèi)容之一。 總膽固醇（總膽固醇（chol）：）：是游離膽固醇和膽固醇酯的總稱，其測定對高脂蛋白血癥和冠心病的診 斷及發(fā)病機理的研究有一定意義。 高密度脂蛋白膽固醇（高密度脂蛋白膽固醇（hdl-c）：）：主要在肝臟中合成，是血清中

6、顆粒數(shù)最多的脂蛋白。其含量 是冠心病診斷的重要依據(jù)之一。 肌酐（肌酐（crea）：）：是肌酸代謝的最終產(chǎn)物，由腎臟排出。是腎功能的重要指標之一。 尿素（尿素（urea）：是蛋白質(zhì)分解代謝的終產(chǎn)物。血尿素測定是腎功能的最敏感指標。 載脂蛋白載脂蛋白 a1(apoa1): 是高密度脂蛋白的主要組成成分，臨床上主要用于腦血管病風(fēng)險度的估 計。 載脂蛋白載脂蛋白 b(apob): 是低密度脂蛋白的主要組成成分，臨床上主要用于冠心病的風(fēng)險度的估計。 肌酸激酶（肌酸激酶（ck）：）：肌酸激酶通常存在于動物的心臟、肌肉以及腦等組織的細胞漿和線粒體中， 是一個與細胞內(nèi)能量運轉(zhuǎn)、肌肉收縮、atp 再生有直接關(guān)系

7、的重要激酶?？捎糜谠缙谠\斷急性 心肌梗，常見肌病(如進行性肌營養(yǎng)不良發(fā)作期、病毒性心肌炎、多發(fā)性肌炎、擠壓綜合征等嚴 生化檢測常識- 3 - 重肌肉損傷)及腦血管疾病的診斷。 -羥丁酸脫氫酶（羥丁酸脫氫酶（hbdh）：）：與肌酸激酶相同，用于診斷心肌梗死。 -淀粉酶（淀粉酶（amy）：）：在臨床應(yīng)用方面，-淀粉酶活力升高與急性胰腺炎、胰腺管道阻塞、腹 內(nèi)疾病、流行性腮腺炎及細菌性腮腺炎。 鈣、氯、鐵、鉀、鈉、鎂、磷：鈣、氯、鐵、鉀、鈉、鎂、磷：這 7 項都屬于離子組合，用于診斷人體中離子的含量。 常用檢測項目表常用檢測項目表 序號項目名稱縮寫組合參考值 1.白蛋白alb3555g/l 2.總蛋

8、白tp6080g/l 3.堿性磷酸酶alp15112u/l 4.門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶ast（got）837u/l 5.丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶alt（gpt）065u/l 6. -谷氨酰轉(zhuǎn)移酶 ggt050u/l 7.直接膽紅素db06umol/l 8.總膽紅素tb 肝功能 018umol/l 9.肌酐crea53115mol/l 10.尿酸ua210430umol/l 11.尿素urea 腎功能 2.56.4mmol/l 12.膽固醇chol3.66.5mmol/l 13.甘油三酯tg0.451.81mmol/l 14.高密度脂蛋白hdl0.91.68mmol/l 15.低密度脂蛋白ldl2.73.1

9、mmol/l 16.載脂蛋白 a1apoa11.01.6g/l 17.載脂蛋白 bapob0.61.1g/l 18.脂蛋白lp（a） 血脂 030mg/dl 19.肌酸激酶ck21190u/l 20.肌酸激酶同工酶ck-mb025u/l 21. -羥丁酸脫氫酶 hbdh70180u/l 22.乳酸脫氫酶ldh 心肌酶類 114240u/l 23.鈣ca2.02.6mmol/l 24.氯cl95105mmol/l 25.鐵fe930mol/l 26.鉀k3.55.5mmol/l 27.鎂mg0.61.1mmol/l 28.鈉na135145mmol/l 29.磷p 離子 0.81.6mmol/l

10、 30. -淀粉酶 amy100220u/l 31.葡萄糖glu 其它 3.95.8mmol/l 生化檢測常識- 4 - 第三章 生化儀參數(shù)測量原理 3.1 自動生化儀的分類自動生化儀的分類 3.1.1 連續(xù)流動式自動化分析儀 連續(xù)流動式自動化分析儀也叫管道式分析儀，其特點是測定項目相同的各待測樣本與試劑 混合后的化學(xué)反應(yīng)，是在同一管道中經(jīng)流動過程完成的。這類儀器一般可分為空氣分段系統(tǒng)式和 非分段系統(tǒng)式。所謂空氣分段系統(tǒng)是指在吸入管道的每一個樣品、試劑以及混合后的反應(yīng)液之間， 均由一小段空氣間隔開；而非分段系統(tǒng)是靠試劑空白或緩沖液來間隔每個樣品的反應(yīng)液。在管道 式分析儀中，以空氣分段系統(tǒng)式最多

11、，且較典型，整套儀器是由樣品盤、比例泵、混合管、透析 器、恒溫器、比色計和記錄器幾個部件所組成。管道內(nèi)的圓圈表示氣泡，氣泡可將樣品及試劑分 隔為許多液柱，并起一定的攪拌作用。但氣泡影響比色，必須在比色前除去。 將幾個單通道管道式分析儀結(jié)合起來，對一個樣品同時測定幾個項目。著名的有 12 通道分 析儀，命名為順序多項自動分析儀（sequential multiple auto analyzer）簡稱 sma12/60。同時發(fā)展 為 smac，c 為計算機（computer）的縮寫。這類大型分析儀至今仍有使用者。它對每個樣品可同 時分析 12 個項目，每小時可分析 60 個樣品。后來發(fā)現(xiàn)不加入空氣

12、泡，更有利于結(jié)果的檢測，發(fā) 展為流動注射分析法（flow injection analysis） 。試劑的流動仍用比例泵驅(qū)動，樣品用轉(zhuǎn)動閥加入 液流，反應(yīng)后比色檢測。 3.1.2 離心式生化分析儀 離心式分析儀是 1969 年以后發(fā)展起來的一種分析儀，由 anderson 設(shè)計，其特點是化學(xué)反應(yīng) 器裝在離心機的轉(zhuǎn)子位置，該圓形反應(yīng)器稱為轉(zhuǎn)頭，先將樣品和試劑分別置與轉(zhuǎn)頭內(nèi)，當(dāng)離心機 開動后，圓盤內(nèi)的樣品和試劑受離心力的作用而相互混合發(fā)生反應(yīng)，最后流入圓盤外圈的比色槽 內(nèi)，通過比色計進行檢測。 離 心式分 析儀主 要由兩 部分組 成，一為 加樣部 分，二為 分析部 分。加樣 部分包 括樣品 盤、試

13、劑 盤、吸樣臂（或管） 、試劑臂（加液器）和電子控制部分（鍵盤和顯示器等） 。加樣時轉(zhuǎn)頭置于加 樣部分。加樣完畢后將轉(zhuǎn)頭移至離心機上。分析部分，除安裝轉(zhuǎn)頭的離心機外，還有溫控和光學(xué) 檢測系統(tǒng)，并有微機信息處理和顯示系統(tǒng)。 13 分立式生化分析儀 所謂分立式，是指按手工操作的方式編排程序，并以有節(jié)奏的機械操作代替手工，各環(huán)節(jié)用 生化檢測常識- 5 - 傳送帶連接起來，按順序依次操作。分立式分析儀與管道式分析儀在結(jié)構(gòu)上的主要區(qū)別為：前者 各個樣品和試劑在各自的試管中起反應(yīng)，而后者是在同一管道中起反應(yīng)；前者采用由采樣器和加 液器組成的稀釋器來取樣和加試劑，而不用比例泵；前者一般沒有透析器，如要除蛋白

14、質(zhì)等干擾， 需另行處理。恒溫器必須能容納需保溫的試管和試管架，所以比管道式分析儀的體積要大。除此 以外，其它部件與管道式的基本相似。分立式分析儀的基本結(jié)構(gòu)如下圖所示。depout 公司還推 出一種袋式分析儀，即試管變?yōu)樗芰洗磻?yīng)在袋內(nèi)進行，也以袋作比色杯。這種袋只能一次性 使用。 3.1.3 干片式分析儀 干片式分析儀是 80 年代問世的。首先 eastman kodak 公司以其精湛的化學(xué)工藝造出了測定 血清中血糖、尿素、蛋白質(zhì)、膽固醇等的干式試劑片。當(dāng)加上定量的血清后，在干片的前面產(chǎn)生 顏色反應(yīng)，用反射光度計檢測即可進行定量。這類方法完全革除了液體試劑，故稱干化學(xué)法。 boehringe

15、r mannheim 公司推出了用全血的干征試劑。即將血細胞排除于濾膜之外，而血漿與試 劑發(fā)生反應(yīng)后顯色檢測。 生化檢測常識- 6 - 3.1.4 模塊式自動化系列 7600 系列全自動生化分析儀是日立公司于 1998 年開發(fā)出來的系列分析儀。它是由各種不同 功能的模塊組合而成，功能模塊包括有樣本投入部、電解質(zhì)測定的 ise 模塊、常規(guī)實驗項目測定 的 d 模塊、特殊實驗項目測定的 p 模塊、復(fù)查樣本緩沖部和樣本收納部。根據(jù) d 模塊和 p 模塊 數(shù)目組合成不同型號的分析儀。 模塊組合式實驗室自動化系統(tǒng)包括： 樣品前處理系統(tǒng)，樣品輸送系統(tǒng)和樣品后處理系統(tǒng)（生化分析，電解質(zhì)分析，血液分析等） 。

16、 樣品前處理系統(tǒng)由能獨立工作，不同功能的各模塊以同一標準來連接，通過計算機控制運行。由 樣品投入部，離心分離部，開栓部，在線分注部，非在線分注部，貼條碼部，蓋栓部，樣品分注 收存部，標本接收部等模塊構(gòu)成前處理系統(tǒng)，每一模塊既是系統(tǒng)的一部分，又是獨立的單元，可 根據(jù)不同需要選擇使用，具有靈活性和擴展性。 后處理系統(tǒng)有電解質(zhì)分析系統(tǒng)，生化分析系統(tǒng)以及血液分析系統(tǒng)等。 16 全實驗室自動化分析系統(tǒng) 從檢驗標本處理開始，即標本的識別、傳輸、處理（分離血清等） 、分注、分類（按項目分 類） 、檢測和收費的自動化流水作業(yè)，到分析后自動儲存標本，檢驗結(jié)果的自動分析、報告與傳 送，自動提示異常值或危險值，申請

17、檢驗醫(yī)師隨時查詢檢驗結(jié)果的全過程實現(xiàn)自動化、網(wǎng)絡(luò)化。 3.2 分立式生化儀結(jié)構(gòu)分立式生化儀結(jié)構(gòu) 生化檢測常識- 7 - 全自動生化分析儀一般由以下部分構(gòu)成：探針系統(tǒng)、攪拌和沖洗系統(tǒng)、恒溫系統(tǒng)、反應(yīng)盤、 光路系統(tǒng)構(gòu)成。 21 探針系統(tǒng) 液面檢測技術(shù)：通過檢測阻抗或電容、電流的變化，感知到空氣和液面，可保證探 針的感應(yīng)裝置至液面時會自動停止下降，即可增加速度也可減少污染，防止堵塞。 22 攪拌和沖洗系統(tǒng) 攪拌系統(tǒng)是讓樣品和試劑混合后迅速分布均勻，保障測試正常進行。常用的攪拌方 法為沖入空氣、攪拌、振蕩等，但是都容易產(chǎn)生氣泡和外溢等問題。目前最好的方法是 螺旋式攪拌棒附著特富龍涂層，一方面減少氣泡，

18、另一方面減少攜帶和污染。 清洗系統(tǒng)一般包括試劑針的內(nèi)外臂清洗、樣本針的內(nèi)外臂清洗、比色杯的清洗。 23 恒溫系統(tǒng) 全自動生化儀一般都設(shè)有 30 和 37 度兩種溫度。目前常見的有水浴、空氣浴，最新 的是恒溫液循環(huán)加溫方式。 水浴的優(yōu)點是溫度均勻、穩(wěn)定；缺點是升溫緩慢，開機預(yù)熱時間長，因水質(zhì)化（微 生物、礦物質(zhì)沉積）影響測定，因此要定期換水和比色杯。 空氣浴的優(yōu)點是升溫迅速，無需保養(yǎng)；缺點是溫度易受外界環(huán)境影響。 恒溫液循環(huán)加溫集干式空氣浴和水浴的優(yōu)點，即有水浴溫度穩(wěn)定、均勻的優(yōu)點，又 有空氣浴升溫迅速、無需維護保養(yǎng)的優(yōu)點。 24 反應(yīng)盤 現(xiàn)在大多數(shù)采用硬質(zhì)玻璃比色杯（石英杯） ，其透光性好，易

19、清潔，不易磨損。 25 光路系統(tǒng) 光源：光源分為鹵素?zé)艉透邏洪W爍氙燈。相對而言鹵素?zé)魤勖L，價格低，是大部分 生化儀的首先。 3.3 生化檢驗的原理和方法生化檢驗的原理和方法 臨床生化檢驗，主要在技術(shù)方面的應(yīng)用方面上探討生化檢驗新技術(shù)以及新的標記物的選擇 和評價，用于幫助診斷，又稱“診斷生化” 。主要應(yīng)用于下列技術(shù)：光譜技術(shù)、電化學(xué)分析技 術(shù)、層析技術(shù)、電泳技術(shù)、離心技術(shù)、抗原抗體特異性反應(yīng)和標記技術(shù)、核酸擴增、雜交及序 列分析技術(shù)等，其中生化分析儀主要運用了光譜技術(shù)中的吸收光譜法和比濁法。分別介紹如下： 31 吸收光譜法 311 光譜范圍和電子躍遷 波長從 200nm400nm 的電磁輻射，

20、稱為紫外光，波長從 400nm760nm 的電磁輻射，稱 為可見光。 312 吸收曲線 以波長（）為橫坐標，以吸光度為縱坐標而繪制出的一條曲線稱為吸收曲線。 生化檢測常識- 8 - 在一段波長范圍內(nèi)，有最大吸收波長 max和最小吸收波長 min在最大吸收波長處測定可獲 得最大的測定靈敏度。 313 吸光度的定義 一束強度為 io的平行單色光通過一 個含有濃度為 c 的吸光物質(zhì)、厚度為 l 的吸收池時，如 上圖，一些光子被吸收，光強從 io衰減為 it，則該溶液的吸光度 a 等于： 314lamber-beer 定律 a=cl 其中 為吸光系數(shù)，有兩種表示方法摩爾吸光系數(shù)和比吸光系數(shù)，摩爾吸光系

21、數(shù)的意義為 1 摩 爾濃度的溶液在厚度為 1cm 時的吸光度，比吸光系數(shù)的意義為濃度為 1%（w/u）的溶液在厚度為 1cm 時的吸光度；c 為溶液的濃度；l 為吸收池的厚度（單位為 cm，亦稱光徑） 。 lamber-beer 定律的意義為：某溶液的吸光度等于該物質(zhì)的吸光系數(shù) 、濃度 c 和光徑 l（cm） 的乘積，當(dāng)光徑不變時，濃度和吸光度成正比，這是生化分析儀利用吸收光譜法進行定量測定的基 礎(chǔ)，見下圖： lamber-beer 定律成立的前提條 件是：（1）被吸收光為單色平行光， （2）待測 定溶液為稀溶液。 除特種蛋白外的大部分臨床生化項目，配以相應(yīng)的試劑，均可利用吸收光譜法在生化分析

22、儀上 進行測定。如： 酶類：包括 alt、ast、alp、acp、r-gt、a-hbdh、ldh、ck、ck-mb、a-amy、等。 底物/代謝產(chǎn)物類：包括 tg、tc、hdl-c、ldl-c、ua、urea、cr、glu、tp、alb、t- bil、d-bil、nh4+、co2 等。 無機離子類：包括 ca、p、mg、cl 等。 32 比濁法 321 比濁法分兩類：透射比濁法和散射比濁法。 帶有小粒的懸浮液和膠體溶液都具有向四面八方散射入射光的性質(zhì)，當(dāng)一束平行光通過含有懸 浮質(zhì)點的懸浮液或膠體溶液時，同時受到散射和吸收兩個因素的影響，使光的強度減弱。在光源的 光路方向上測量透射光（實際上還包

23、括散射光）強度與入射光強度比值，并通過該比值測定出懸浮 液或膠體溶液中質(zhì)點的溶度，稱為投射比濁法；在光路的其他方向上測量散射光強度，從而測定出 懸浮液或膠體溶液中質(zhì)點的濃度，稱為散射比濁法。 生化檢測常識- 9 - 322 測定原理 透射比濁法 一束強度為 i0的平行單色光通過一個含有懸浮質(zhì)點（顆粒大小與光源波長接近）的懸浮液或膠 體溶液時，如上圖，其透射光強度 i 可用下式表示： i=ioe- l 式中,l 為懸浮液或膠體溶液在光前進方向上的長度， 為濁度系數(shù)，與懸浮質(zhì)點的濃度 c 成線 性關(guān)系。令 =2.3kc，則： 該式與 lamber-beer定律相似，這是生化分析儀利用投射比濁法進行

24、定量測定的基礎(chǔ)，該法可以 與吸收光譜法共用一個檢測器，所以生化分析儀，不需增加任何部件，均可利用此法進行測定。大 部分特種蛋白，如載脂蛋白類（apoai,apob 等） 、補體類（c3，c4 等）免疫球蛋白類（igg,igm 等） 等，配以相應(yīng)的試劑，可利用此法在生化分析儀上進行測定。 散射比濁法 一束強度為 io平行單色光通過一個含有懸浮質(zhì)點（顆粒大小遠小于光源波長）的懸浮液或膠體溶液 時，如上圖，與入射光垂直方向上，其散射光強度 i 可用下式表示： 式中，n1,n2 分別表示質(zhì)點與介質(zhì)的折射率，v 表示單位 體積內(nèi)的質(zhì)點數(shù)，r 表示質(zhì)點半徑?？梢娚⑸涔鈴姸扰c懸浮質(zhì)點的濃度成正比，這是利用散

25、射比濁法 進行定量測定的基礎(chǔ)，因另需在光路垂直方向上增加一檢測器，目前只有極少數(shù)生化分析儀可利用 散射比濁法進行定量測定，而幾乎所有的特種蛋白分析儀、免疫分析儀等都能利用散射比濁法進行 定量測定。 323 方法學(xué)分析 （1）散射比濁法與透射比濁法： 散射比濁法靈敏度高，線性范圍寬，但干擾因素多。 （2）比濁法與吸收光譜法： 比濁法特異性差，靈敏度低。 3.43.4 生化分析儀測定方法的分類及應(yīng)用度的計算生化分析儀測定方法的分類及應(yīng)用度的計算 4.4.1 終點法 4.4.1 概述 指經(jīng)過一段時間（一般為 10 分鐘左右）的反應(yīng)，整個反應(yīng)達到平衡，由于反應(yīng)的平衡常數(shù)很大， 可認為所有的被測定物已轉(zhuǎn)

26、變?yōu)楫a(chǎn)物，反應(yīng)液的吸光度不在增加（或降低） ，吸光度的增加（或降低） 程度與被測定物的濃度成正比。如下圖： 顆粒大小與光源波長接近 顆粒大小遠小于光源波長 生化檢測常識- 10 - 如圖所示：t1 時刻加入試劑（體積為 v） ， t2 時刻加入樣本（體積為 s） ，然后攪拌并反應(yīng)，之后測量反應(yīng)液的吸光度，在 t3 時刻反應(yīng)達到終 點。t2 t3 為測定時間。 442 反應(yīng)度 r（response）的計算 結(jié)果的計算包括三個部分：反應(yīng)度 r（response）的計算、定標參數(shù)的計算和濃度（或活性）的 計算。這里僅介紹 r 的計算，定標參數(shù)的計算和濃度（或活性）的計算在后面專門討論。 1）單試劑單

27、波長終點法 反應(yīng)度 r=t3 時刻吸光度- t2 前一時刻吸 光度 （體積校正因子) 或 r=t3 時刻吸光度-單試劑空白吸光度。 2）雙試劑單波長終點法 t1 時刻加入第一試劑（體積為 v1） ，t2 時刻加入樣本（體積為 s） ，之后攪拌，t3 時刻加入第二 試劑（體積為 v2）并立即攪拌，t4 時刻反應(yīng)打到終點。t3-t2 為孵育時間，t4-t3 為測定時間。 反應(yīng)度 r= t4 時刻吸光度-雙試劑空白吸光度 4.4.2 一級動力學(xué) 4.4.2 概述 一級動力學(xué)是指在被測物參與反應(yīng)的條件下，在一定的反應(yīng)時間內(nèi)，反應(yīng)速度與反應(yīng)物濃度的 一次方成正比，由于反應(yīng)物在不斷的消耗，因此整個反應(yīng)速度

28、在不斷的減小，表現(xiàn)為吸光度的增加 （或降低）速度越來越小，由于這類反應(yīng)達到平衡的時間很長，且平衡常數(shù)不算很大，必需在特定 時間段內(nèi)進行監(jiān)測，該段時間內(nèi)吸光度的增加（或）降低與被測定物的濃度成正比，見下圖。一級 動力學(xué)法又被稱為初速率法、固定時間法、二點動力學(xué)等。 生化檢測常識- 11 - 如圖所示：t1 時刻加入試劑（體積為 v） ，之后測量試劑空白的吸光度，t2 時刻加入樣本（體積 為 s） ，t3 時刻反應(yīng)穩(wěn)定，t4 時刻停止對反應(yīng)進行監(jiān)測；t2-t3 為延遲時間，t3-t4 為測定時間。 4.2.2 反應(yīng)度 r 的計算（單、雙試劑相同） 反應(yīng)度 r=t4 時刻吸光度t3 時刻吸光度 4.

29、4.3 零級動力學(xué)法 4.4.31 概述 指反應(yīng)速度與被測定物濃度的零次方成正比，也就是與被測定物濃度無關(guān)，因此，在整個反應(yīng) 過程中，反應(yīng)物可以勻速地生成某個產(chǎn)物，導(dǎo)致被測定溶液在某一波長下吸光度均勻地減小或增加， 減小或增加的速度（a/min）與被測物的活性或濃度成正比。零級動力學(xué)法即通常所說的動力學(xué)法， 也被稱為連續(xù)監(jiān)測法，主要用于酶活性的測定。 實際上，由于底物濃度不可能足夠大，隨著反應(yīng)的進行，底物消耗到一定的程度后，反應(yīng)速度 不再與酶活性成正比，因此，零級動力學(xué)法是針對于特定時間段而言的，各試劑商對這段時間有嚴 格規(guī)定，見下圖中的 t3-tn: t1 時刻加入試劑（體積為 v） ，t2

30、 時刻加如樣本（體 積為 s） ，t3 時刻反應(yīng)穩(wěn)定，tn 時刻停止對反應(yīng)進行監(jiān)測；t3 到 tn 之間的時間內(nèi)，吸光度勻速變化， 變化的速率和反應(yīng)物的濃度成線性關(guān)系。t3-t2 為延遲時間 ，tn-t3 為測定時間。 432 反應(yīng)度 r 的計算（單、雙試劑相同） 其中 n=t3 到 tn 間的數(shù)據(jù)個數(shù) ti=時間 ai=某一時間的吸光度 3.5.3.5.測定值計算方程測定值計算方程 以下為各種方法學(xué)的測定值計算方程及監(jiān)察參數(shù)定以下為各種方法學(xué)的測定值計算方程及監(jiān)察參數(shù)定 三種基本方法的應(yīng)用如下: - 終點法 - 兩點法 - 動力法 3.5.13.5.1 終點法終點法- -單試劑單試劑, ,

31、單波長及樣本空白扣除單波長及樣本空白扣除 生化檢測常識- 12 - 測定值 x 單位因子 截距 最後報告結(jié)果最後報告結(jié)果 = _ 斜率 每個終點, 儀器均測取三個讀數(shù)t0, t1 - 18及 t1. 測定值 = 因子 x abs (t1) - *rb1r 標準濃度 因子 = _ abs (t1) - *rb1r(試劑空白值) * rbl 試劑空白值, 可在定標數(shù)據(jù)程序內(nèi)查看 延時時間 時間 t0 吸光度 (abs) 加入樣本 rblr abs (t1) t1-18” 生化檢測常識13 3.5.23.5.2 反應(yīng)控制反應(yīng)控制 是用來監(jiān)察在終點法中反應(yīng)是否己到終點. abs (t1) - abs

32、( 1) 反應(yīng)控制反應(yīng)控制 abs = abs (t1) - abs ( 1) = 0.3336 - 0.3319 = 0.0017 反應(yīng)控制反應(yīng)控制 終點法時：指反應(yīng)終點的吸光度與前一點的吸光度差值要小于儀器給出的反應(yīng)控制反應(yīng)控制，否則反應(yīng)到 達終點時會報警終點不穩(wěn)定。 固定時間法：判斷參與計算的兩點線性，例如： 時間 1 t1 吸光度 (abs) 加入樣本 兩測的吸光 度差值. abs 14 3.5.33.5.3 試劑試劑白白波動波動 試劑試劑白白波動波動是試劑本身在測讀時間內(nèi)的吸光度變化值. 3.5.43.5.4 兩點法（兩點法（i.r.)i.r.) 單試劑單試劑 測定值 x 單位因子

33、截距 最后報告結(jié)果最后報告結(jié)果 = _ 斜率 時間 吸光度 (abs) rgt 波動 rbl t0t1 時間 t0 吸光度 ( abs) abs (t1) 樣本或 標準 t1 abs (t0) 試劑空白 abs (t1) 試劑空白 abs (t0) 樣本或 標準 15 測定值測定值= 因子 x abs 樣本-rgt 波動 abs 樣本= abs 樣本 (t1) - abs 樣本(t0) rgt 波動 = abs 試劑空白= abs 試劑(t1) - abs 試劑(t0) 標準濃度 因子 = _ abs 標準 rgt 波動 3.5.53.5.5 兩點法（兩點法（i.ri.r）試劑）試劑 測定值測

34、定值= 因子 x abs 樣本-rgt 波動 標準濃度 時間 吸光度 ( abs) t3 r1 t1 延遲時間 h20/std/ 樣本 t2 讀數(shù)時間加入 r2 延遲時間 rgt 漂移 abs 樣本/標本 abs (t2) abs (t3) r2 16 因子 = _ abs 標準 rgt 波動 起時極限起時極限 afp = abs (t0) - abs (t0 - 18) asp = abs (t1) - abs (t1 - 18) 若比值不符合以下條件: afp 線性因子 x asp 起始極限 測結(jié)果會有報警反應(yīng)不符合線性. 線性因子線性因子 afp 比值 _ =線性因數(shù) 時間 吸光度 (

35、abs) t0-18 t0 t1-18 t1 afp asp 17 asp 3.5.63.5.6 底物消耗值底物消耗值 正反應(yīng) 負反應(yīng) 3.5.73.5.7 動力學(xué)因數(shù)的計算：動力學(xué)因數(shù)的計算： vt x 1000 時間 吸光度 ( abs) t0 t1 底物消耗極限 abs (t0) abs (t1) 沒有報警 報警底物耗盡 時間 吸光度 ( abs) t0 t1 底物消耗極限 abs (t0) abs (t1) 沒有警號 報警底物耗 盡 18 因數(shù) = _ vs x o.t. x x t vt =反應(yīng)總量 (樣本量 + 試劑量) vs= 樣本量 o.t.= 光徑的長度(cm). = 消光系

36、數(shù) 1000= 單位轉(zhuǎn)換-由 ml 轉(zhuǎn)換為 ul 測定測定值值 = 因數(shù) x abs/ 分. = 因數(shù). x abs(t0) - abs(t1) x 60 /(t0)- (t1) 3.63.6 定標參數(shù)和濃度的計算定標參數(shù)和濃度的計算 3.6.1 定標參數(shù)的計算 定標方法分為兩大類，即線性定標和非線性定標，其中線性定標又包括單點線性定標 （又稱因數(shù)法） 、兩點線性定標（又稱線性法）和多點（大于 3 點）線性定標（又稱線性回 歸法） ，主要適用于比色法測定的項目；非線性定標主要適用于比濁法測定的項目，下面分 別予于介紹。 3.6.23.6.2 幾點說明幾點說明 （1）三種測定方法（終點法、固定時

37、間法和動力學(xué)法）可以和上述的定標方法任意 對應(yīng)。 （2）后面的定標公式中： r 表示反應(yīng)度（詳見上文“r 的計算” ） c 表示標準液的濃度（或活性） 。 k、ro、a、b、c、d 表示定標參數(shù)。 標準液標準液 亦稱基準溶液，是濃度已經(jīng)準確測知的溶液。 3.6.33.6.3 線性定標線性定標 （1）單點線性定標 定標公式：r=kc，只有 1 個定標參數(shù)k， 定標曲線如下圖： 19 只需提供 1 個標準品。大多數(shù)酶學(xué)項目可以不定標而直接輸入因數(shù)（輸入值 f=1/k） （2）兩點線性定標 定標公式：r=dc+b，有 2 個定標參數(shù)，k 和 b 其中 要求提供兩個標準品，c1、c2 為標準品 1 和

38、 2 的濃度，r1、r2 為標準品 1 和 2 的反 應(yīng)度。定標曲線如下圖： （3）多點線性定標 定標公式：r=kc+b,有兩個定標參數(shù)，k 和 b，其中： 要求提供 n（n3）個標準品，ci 為標準品 i 的濃度，ri 為標準品 i 的反應(yīng)度。 20 313 非線性定標 （1）logistic-log4p 定標公式：有 4 個 參數(shù)，即 r0、k、a 和 b。 要求提供至少 4 個標準品，其中第一個標準品的濃度（活性）為零，其對應(yīng)的 r 就等 于 r0，用最速下降法+擬牛頓法求解。適用于隨著濃度增加，其反應(yīng)度增加越來越小的定 標曲線，如圖： （2）logistic-log5p 定標公式：有

39、5 個定標參數(shù)即 r0、k、a 、 b 和 c。要求提供至少 5 個標準品，其中第 1 個標準品的濃度（活性）為零，其對應(yīng)的 r 就 等于 r0,用最速下降法+擬牛頓法求解，使用范圍同 logistic-log4p，只是曲線擬和程度更 高。 （3）exponential5p 定標公式：r=r0+kexpalnc+b(lnc)2+c(lnc)3,有 5 個參數(shù) r0、k、a 、b 和 c 要求提 供至少 5 個標準品，其中第 1 個標準品的濃度（活性）為零，其對應(yīng)的 r 就等于 r0,用最 速下降法+擬牛頓法求解。適用于濃度增加到一定程度后，其反應(yīng)度增加越來越大的定標曲 線，如圖： （4）polynomial5p 定標公式：有 5 個參數(shù) r0、k、 a 、b 和 c 要求提供至少 5 個標準品，其中第 1 個標準品的濃度（活性）為零，其對應(yīng)的 r 就等于 r0,用最速下降法+擬牛頓法求解。 （5）parabola 定標公式：r=ac2+bc+c,有 3 個參數(shù)，即 a、b 和 c。要求提供至少 3 個標準品，解 3 元線性方程組，用