肝炎病毒核酸檢測及臨床診療最新進展

1、匯報人： Part 1 肝病PCR檢測國內外需求及現(xiàn)狀 Part 2 肝病PCR檢測最新解決方案 Part 3 肝病PCR檢測的發(fā)展趨勢 Part 1 肝病PCR檢測國內外需求及現(xiàn)狀 Part 2 肝病PCR檢測最新解決方案 Part 3 肝病PCR檢測的發(fā)展趨勢 l 2008年美國肝病協(xié)會CHB防治指南：持久消除HBV是乙肝的治療終點， HBV DNA病毒載量盡可能小于或等于10 IU/ ml。 l 歐洲肝病研究學會EASL2010年指南指出：將HBV DNA病毒載量盡可能控 制在10-15 IU/ ml，能有效防止疾病的復發(fā)。 l歐洲肝病研究學會EASL2011指南指出：丙肝患者治療的目標

2、需HCV RNA病 毒載量低于50 IU/ ml。 （一）（一） 核苷核苷( (酸酸) )類似物治療慢性乙肝路線圖類似物治療慢性乙肝路線圖 治療第治療第12周周 評估原發(fā)性治療失敗評估原發(fā)性治療失敗 HBV-DNA水平較基線水平下降幅度水平較基線水平下降幅度1log/ml 開始治療開始治療 HBV-DNA基線水平監(jiān)測基線水平監(jiān)測 病毒學完全應答病毒學完全應答 HBV-DNA2000 IU/ml 增加增加/更換有效的藥物治療更換有效的藥物治療 監(jiān)測監(jiān)測HBV-DNA/6個月個月 治療第治療第24周周 評估抗病毒療效的早期預測因子評估抗病毒療效的早期預測因子 60IU/ml如何檢測？ * * 由美

3、國坦福大學醫(yī)學中心由美國坦福大學醫(yī)學中心KeeffeKeeffe教授（專家組）提供教授（專家組）提供 n國家SFDA技術審評中心“863”課題 HBV DNA定量試劑 技術審評指導原則中指出： l HBV DNA建議最低檢測限應30 IU/mL。 l DNA提取純化方法不建議采用煮沸法進行DNA提取。 內標全程參與！ 核酸上樣量20 ul！ 加熱煮加熱煮 沸沸 高速離高速離 心心 過柱吸過柱吸 附附 n 陳舊的技術 n 繁瑣的過程 國內HBV DNA檢測方法多為煮沸法，試劑靈敏度 均為500IU/ml或1000IU/ml。 國內大部分HCV RNA檢測方法多為柱提法，試劑 靈敏度1000IU/

4、ml。 n 令人揪心的性能 五種乙型肝炎病毒核酸熒光定量檢測試劑盒的比較,中華傳染病雜志， 2009年 第3期吳星,黃維金, 周誠 ,莊輝 等(中國藥品生物制品檢定所, 北京大學醫(yī)學部) 國家“十一五”科技重大專項 “乙型和丙型病毒性肝炎診斷及臨床監(jiān) 測的研究” 魯鳳民教授 北京大學肝炎試劑研究中心 n 專家呼吁：高精度，超敏感的核酸診斷試劑的開 發(fā)是目前肝炎診療中的關鍵步驟！ 面對當前肝病毒 核酸檢測技術的 現(xiàn)狀，我們真沒 有辦法了嗎？ Part 1 肝病PCR檢測國內外需求及現(xiàn)狀 Part 2 肝病PCR檢測最新解決方案 Part 3 肝病PCR檢測的發(fā)展趨勢 臨床核酸提取技術的發(fā)展：臨床

5、核酸提取技術的發(fā)展： 煮沸法煮沸法 酚氯仿法酚氯仿法 旋轉離心柱法旋轉離心柱法 玻璃粉吸附法玻璃粉吸附法 二氧化硅吸附法二氧化硅吸附法 磁珠法磁珠法 國內主流方法國內主流方法 國際主流方法國際主流方法 p 高精度高精度 p 高品質高品質 p 高科技高科技 磁珠（電子顯微鏡） 磁珠分離器 p 磁珠法磁珠法 -核酸診斷領域新方向。核酸診斷領域新方向。 DNA 磁珠與DNA的結合 -通過超順磁性顆粒富集通過超順磁性顆粒富集 核酸，實現(xiàn)樣品高純度、高核酸，實現(xiàn)樣品高純度、高 靈敏度的檢測。靈敏度的檢測。 p 原理原理 l磁珠法提取核酸效率高，純度高，特異性好。 l采用最新一代的磁珠提取核酸技術，無需加

6、熱、無 需高速離心、靈敏度極高，能夠很好的滿足臨床診療 的需求。 l抗干擾能力強，能勝任高血脂、強溶血以及藥物治 療標本的檢測，是臨床疾病檢測的有力手段。 l極易實現(xiàn)自動化。 靈敏度可達靈敏度可達10IU/ml，是國產(chǎn)主流試劑的，是國產(chǎn)主流試劑的50-100倍；倍； 準確定量線性范圍為準確定量線性范圍為20IU/ml2.0109IU/ml 可檢測可檢測HBV A、B、C、D、E、F、G、H共共8個基因型。個基因型。 設置了監(jiān)控內標設置了監(jiān)控內標IC,有效避免假陰性。有效避免假陰性。 設置內參比熒光設置內參比熒光ROX，定量更準確。，定量更準確。 u以湖南圣湘乙肝磁珠法為例 u以湖南圣湘乙肝磁珠

7、法為例 * 9例定值在12 50 IU/ml之間 圣湘磁珠法技術在靈敏度方面存在明顯優(yōu)勢，與進口試劑具有很好的一致圣湘磁珠法技術在靈敏度方面存在明顯優(yōu)勢，與進口試劑具有很好的一致 性，能夠很好的勝任臨床藥物療效的觀察和治療終點的確定。性，能夠很好的勝任臨床藥物療效的觀察和治療終點的確定。 Sansure-HBV ：圣湘HBV磁珠法 Roche-HBV ：羅氏 AmpliPrep-Cobas TaqMan HBV Test X-HBV：國內一家上市公司的HBV產(chǎn)品（濃縮煮沸法） Part 1 肝病PCR檢測國內外需求及現(xiàn)狀 Part 2 肝病PCR檢測最新解決方案 Part 3 肝病PCR檢測的

8、發(fā)展趨勢 （2533+2883）15=？ n簡單化的要求 一步法技術：最簡便的PCR技術 一步操作即可實現(xiàn)核酸提取。 一步法技術優(yōu)勢： l快速，處理96個樣本僅需 30min。 l成本低，僅需一套移液器即可實現(xiàn)病毒檢測。 l操作步驟少，減少誤差發(fā)生率，提高準確性。 l極易掌握，對操作人員要求低，方便科室的人 員安排。 n準確化的要求 -內標監(jiān)測系統(tǒng)， 假陰性的克星。 內標參與核酸提取與擴增，通過檢測內標是否正常來監(jiān) 測核酸提取和核酸擴增的有效性，試驗結果是否有效， 避免PCR假陰性。 FAM:525nm HEX:555nm 目的基因目的基因 內標內標 真陰性真陰性 HEX曲線曲線 FAM曲線曲線 設置了參比熒光ROX，用于校正槍的誤差、