實(shí)驗(yàn)三-微生物檢定法測定硫酸慶大霉素的效價(jià)(1)11頁

1、實(shí)驗(yàn)三 微生物檢定法測定硫酸慶大霉素的效價(jià)一、概述 由于抗生素多為結(jié)構(gòu)復(fù)雜的多組分物質(zhì)，異構(gòu)體多，且不穩(wěn)定，容易產(chǎn)生降解雜質(zhì)，故各國藥典均以微生物檢定法為主要含量測定法，因?yàn)榭股厮幤返尼t(yī)療作用主要是它的抗菌活力，而微生物檢定法正是以抗生素的抗菌活力為指標(biāo)來衡量抗生素效價(jià)的一種方法，其測定原理與臨床要求相一致，能直接反映抗生素醫(yī)療價(jià)值，因此一直為各國藥典所采用的主要測定方法。 微生物檢定法測定抗生素效價(jià)，一般可分為稀釋法、比濁法和瓊脂擴(kuò)散法三類。以瓊脂擴(kuò)散法應(yīng)用最廣泛，為目前國際上測定抗生素效價(jià)的通用方法。瓊脂擴(kuò)散法，亦稱管碟法。系采用抗生素在瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)的擴(kuò)散作用，采用量反應(yīng)平行線原理的設(shè)計(jì)

2、，比較標(biāo)準(zhǔn)品與供試品兩者對(duì)接種的試驗(yàn)菌產(chǎn)生抑菌圈的大小，以測定供試品效價(jià)的一種方法。二、基本設(shè)備、用具和試驗(yàn)材料1. 基本設(shè)備(1) 抗生素效價(jià)測定實(shí)驗(yàn)室：室內(nèi)應(yīng)為半無菌，裝有紫外線燈，有固定的效價(jià)測定臺(tái)，臺(tái)面要求水平、防震。該室應(yīng)與稀釋抗生素溶液的工作室隔離，以防止空氣、地面污染抗生素。(2) 超凈工作臺(tái)：超凈工作臺(tái)應(yīng)放置在潔凈工作室或半無菌室內(nèi)。(3) 抑菌圈面積測量分析儀：該儀器裝有微處理機(jī)，可自動(dòng)測量抑菌圈面積，并打印出統(tǒng)計(jì)分析的各種數(shù)據(jù)。2.用具（1） 玻璃雙碟：為硬質(zhì)玻璃制品，碟底內(nèi)徑約90mm，碟高16-17mm，碟底面應(yīng)平，厚薄均勻無凹凸現(xiàn)象。新購的雙碟應(yīng)按上述要求進(jìn)行檢查。檢

3、查時(shí)可將雙碟底平放在水平臺(tái)上，每碟內(nèi)加入2ml染料液，仔細(xì)觀察碟底反映的顏色深淺是否一致，挑選底部平的雙碟，洗凈晾干，置高溫烘箱內(nèi)140-160干熱滅菌2小時(shí)后備用。(2) 陶瓦圓蓋：應(yīng)平，無凹凸現(xiàn)象。(3) 不銹鋼小管：外徑7.80.1mm，內(nèi)徑6.00.1mm，高10.00.1mm，重量差異不超過25mg，鋼管內(nèi)外壁要求光潔，管壁厚薄要一致，兩端面要平坦光潔。(4) 小鋼管放置器：四孔，一臺(tái)。(5) 游標(biāo)卡尺：精密度0.02mm。(6) 滴管：管口應(yīng)細(xì)長平滑，不得有缺口。3. 試驗(yàn)材料(1) 培養(yǎng)基I：取胨5g、牛肉浸出粉3g、磷酸氫二鉀3g和蒸餾水1000ml，加熱融化，混合，調(diào)節(jié)pH使

4、其值比最終的pH值略高0.2-0.4，加入瓊脂20g，加熱溶化過后，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.8-8.0，在115滅菌30分鐘。(2) 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：取胨10g、氯化鈉5g和肉浸液1000ml，混合，調(diào)節(jié)pH使比最終的pH值略高0.2-0.4，加入瓊脂15-20g，加熱溶化過后，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.2-7.4，分裝，在115滅菌30分鐘，趁熱斜放使凝固成斜面。(3) 磷酸鹽緩沖液（pH7.8）：取磷酸氫二鉀5.59g與磷酸二氫鉀0.41g，加蒸餾水使成1000ml，在115滅菌30分鐘。(4) 試驗(yàn)用菌種：短小芽孢桿菌(CMCC(B)63 202). 短小芽孢桿菌菌懸液的制備和保存：取短小

5、芽孢桿菌試驗(yàn)用菌種斜面1支，按無菌操作要求加入滅菌水2ml，將菌苔洗下，搖勻，取出1ml接種于盛有30ml營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的100ml 三角瓶中，在35-37培養(yǎng)7日，用革蘭氏染色法涂片鏡檢，應(yīng)有芽孢85%以上，用滅菌水20ml將芽孢洗下，制成懸液，在65水浴中加熱30分鐘，即得，置5冰箱中保存，可使用6個(gè)月。4. 雙碟的制備：取直徑約90mm、高16-17mm的平底雙碟，分別注入加熱融化的培養(yǎng)基I 20ml,使在碟底內(nèi)均勻攤布，放置水平臺(tái)上使凝固，作為底層。另取培養(yǎng)基適量加熱融化后，放冷至50-60，加入菌懸液適量（能得清晰的抑菌圈為度）,搖勻，在每1雙碟中分別加入5ml，使在底層上均勻攤布，

6、作為菌層。放置水平臺(tái)上冷卻后，在每1雙碟中以等距離均勻安置不銹鋼小管（內(nèi)徑6.00.1mm，高10.00.1mm，外徑7.80.1mm）4個(gè)，用陶瓦圓蓋覆蓋備用。三、二劑量檢定法取照上述方法制備的雙碟不得少于4個(gè)，在每1雙碟中對(duì)角的2個(gè)不銹鋼小管中分別滴裝高濃度及低濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，其余2個(gè)小管中分別滴裝相應(yīng)的高低兩種濃度的供試品溶液；高、低濃度的劑距為2：1或4：1。在35-37條件下培養(yǎng)14-16小時(shí)后，測量各個(gè)抑菌圈的直徑（或面積），照生物檢定統(tǒng)計(jì)法中的(2.2)法進(jìn)行可靠性測驗(yàn)及效價(jià)計(jì)算。四、硫酸慶大霉素的效價(jià)測定：1. 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制：精密稱取硫酸慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品適量，加乙醇溶解后，

7、用滅菌水制成每1ml中含1000單位的溶液，作為貯備液，置5以下的冰箱中保存，可使用7日。將貯備液加pH7.8磷酸鹽緩沖液稀釋，使標(biāo)準(zhǔn)品高劑量溶液和低劑量溶液每ml中分別含硫酸慶大霉素10U和5U。2. 供試品溶液的配制：取硫酸慶大霉素腸溶片4片，研細(xì)，用乙醇適量（硫酸慶大霉素約0.25g，用乙醇25ml），分次研磨使硫酸慶大霉素溶解，并用水稀釋成每1ml中約含1000單位的溶液，搖勻，靜置，精密量取上清液適量，按（1）法 同法配制，使供試品高劑量溶液和低劑量溶液按標(biāo)示量計(jì)算每ml中含硫酸慶大霉素分別為10U和5U。3. 測定法：按二劑量檢定法測定效價(jià)，計(jì)算出供試品中含硫酸慶大霉素相當(dāng)于標(biāo)示量

8、的百分?jǐn)?shù)。附錄：生物檢定統(tǒng)計(jì)法中的（2.2）法 抗生素微生物檢定法是以微生物為工具，不可避免地存在著較大的生物差異性，因此，必須借助于生物統(tǒng)計(jì)方法來減少生物差異對(duì)檢定結(jié)果的影響，使結(jié)果達(dá)到一定的精確度。英、美、日等國家藥典附錄中都詳細(xì)地制定了生物檢定方法的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)分析，并根據(jù)生物統(tǒng)計(jì)的要求規(guī)定了各個(gè)品種的誤差范圍。中國藥典從1985年版起增加了生物檢定法的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和可靠性測驗(yàn)及誤差估計(jì)等內(nèi)容，這對(duì)判斷檢驗(yàn)質(zhì)量及促使檢驗(yàn)方法的改進(jìn)等方面都具有重要意義。1.可靠性測驗(yàn) 抗生素微生物檢定法按照觀察的方法和生物反應(yīng)的類型屬量反應(yīng)，即觀察每一反應(yīng)本身所表現(xiàn)的程度，可以用量來表示。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)采用供試品

9、（T）和已知效價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)品（S）對(duì)比試驗(yàn)的平行線原理。由于平行線測定的計(jì)算原理是在一定劑量范圍內(nèi)T和S的對(duì)數(shù)劑量與反應(yīng)或反應(yīng)的特定函數(shù)呈直線關(guān)系以及在T和S兩條直線互相平行（當(dāng)T和S的活性組分基本相同時(shí)）的基礎(chǔ)上，因此，可靠性測驗(yàn)就是運(yùn)用統(tǒng)計(jì)方法來驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否符合量反應(yīng)的平行線設(shè)計(jì)原理，是否顯著偏離了直線性和平行性，以便評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。對(duì)不是顯著偏離平行偏離直線（在一定的概率水平下）的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，認(rèn)為可靠性成立，方可按有關(guān)公式計(jì)算供試品的效價(jià)和可信限。(1)可靠性測驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)方法抗生素微生物檢定法的可靠性測驗(yàn)采用F測驗(yàn)，即實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方差分析。方差分析為測驗(yàn)多組均數(shù)之間的差別是否顯著。通過統(tǒng)

10、計(jì)運(yùn)算求得試品間、回歸、偏離平行、劑間及碟間項(xiàng)的方差，并以統(tǒng)計(jì)得的以上各項(xiàng)方差和誤差項(xiàng)方差（S2）的比值稱F值（各項(xiàng)F值=）作為指標(biāo)來觀察其差別的顯著性程度。將實(shí)驗(yàn)結(jié)果求得的F值，按相應(yīng)各項(xiàng)的自由度及誤差項(xiàng)的自由度查F值表來判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果求得的F值是大于還是小于F值表上和的F值。若大于的F值，則P0.05,表示差別有顯著意義。若大于的F值，則P0.05,表示差別無顯著意義。P稱概率，即某一事件在一定條件下可能發(fā)生的機(jī)會(huì)，P就是機(jī)會(huì)的定量表現(xiàn)形式，用數(shù)量的形式來反映出事情必然性的規(guī)律，它是生物統(tǒng)計(jì)的基礎(chǔ)，一般在統(tǒng)計(jì)中評(píng)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠程度以P表示，P=0.05，即表示可靠性有95%的把握，P=0.

11、01，即表示可靠性有99%的把握。可靠性測驗(yàn)一般分為下述兩個(gè)步驟：實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方差分析：從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的總變異差方和中分出劑間變異和碟間變異的差方和后，即為誤差項(xiàng)的差方和，其方差以S2表示。首先按劑量組將各反應(yīng)值y（抑菌圈的直徑）列成方陣見表1。表1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果雙碟數(shù)劑 量 組總 和總和平方(1)(2)(3)（K）ymym2123my1(1)y2(1)y3(1)ym(1)y1(2)y2(2)y3(2)ym(2)y1(3)y2(3)y3(3)ym(3)y1(k)y2(k)y3(k)ym(k)y1y2y3ymy12y22y32ym2總 和y(k)y(1)y(2)y(3)y(k)y總 和ym2總和平方y(tǒng)(k

12、)2y(1)2y(2)2y(3)2y(k)2總 和y(k)2y2的總和y2表1中，K為S和T的劑量組數(shù)，m為各組內(nèi)y的個(gè)數(shù)（即雙碟數(shù)），各組的m應(yīng)相等，n為反應(yīng)的總個(gè)數(shù)，n=mk。各項(xiàng)變異的差方和及自由度（f）的計(jì)算差方和（總）=y2 f(總)=n 1式中 =校正數(shù)差方和（劑間）= 校正數(shù) f(劑間)=K1差方和（碟間）= 校正數(shù) f(碟間)=m 1差方和（誤差）=差方和（總）差方和（劑間）差方和（碟間） f(誤差)=f(總)f(劑間)f(碟間)=（k1）（m1）方差=S2=或S2=劑間變異的分析：劑間變異的顯著性測驗(yàn)主要包括S和T試品間、回歸、平行性及直線性等變異內(nèi)容。各項(xiàng)變異的差方和及自由

13、度（f）按表2二劑量法和表3三劑量法可靠性測驗(yàn)正交多項(xiàng)系數(shù)表計(jì)算。表2 二劑量法可靠性測驗(yàn)正交多項(xiàng)系數(shù)表變異來源y(k) 差 方 和自 由 度S1S2T1T2正交多項(xiàng)系數(shù)（Ci）試 品 間-1-1111回 歸-11-111偏離平行1-1-111表中正交多項(xiàng)系數(shù)用Ci表示，y（k）為各劑量組反應(yīng)值之和。各項(xiàng)變異的差方和=，除以該項(xiàng)的自由度即等于方差。以各變異項(xiàng)的方差與誤差項(xiàng)的方差（S2）的比值作為指標(biāo)，進(jìn)行F測驗(yàn)，以判斷各項(xiàng)變異來源差異是否有顯著意義。（2）可靠性測驗(yàn)結(jié)果分析 試品間：驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)品（S）和供試品（T）的結(jié)果是否有差別，如P0.05，即表示差別無顯著意義。 回歸：驗(yàn)證S和T兩條對(duì)數(shù)劑

14、量反應(yīng)直線是否偏離直線性，因?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)采用的劑量間距是等比級(jí)數(shù)，故反應(yīng)應(yīng)隨劑量的增加而有規(guī)律的增加，若各反應(yīng)點(diǎn)均勻的分布在一條直線上，就表明實(shí)驗(yàn)的直線性好，當(dāng)該項(xiàng)統(tǒng)計(jì)得的P0.05，即證明偏離平行不顯著，從而說明S和T兩條直線互相平行。 劑間：二劑量法和三劑量法，各有二個(gè)劑量和三個(gè)劑量，不同劑量所致的反應(yīng)應(yīng)有明顯的差別，如無差別則說明劑量反應(yīng)不在直線范圍內(nèi)，應(yīng)重新調(diào)整劑量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，使該項(xiàng)統(tǒng)計(jì)得的P0.05時(shí)，則表示無顯著差別。但在一般情況下，雙碟之間的差別總是存在的，故在統(tǒng)計(jì)公式中已適當(dāng)?shù)姆殖g差異。綜上所述，實(shí)驗(yàn)最可靠的結(jié)論歸納如下：試品間差別不顯著，P0.05?；貧w顯著，0.05。二次曲線

15、與反向二次曲線均不顯著，0.05。劑間差異顯著，0.05。.效價(jià)計(jì)算測得供試品的效價(jià)單位數(shù)（U/mg或ml）；供試品的標(biāo)示量效價(jià)或估計(jì)效價(jià)； 測得的供試品（）的效價(jià)相當(dāng)于的百分率。 log-1M M=：高、低劑量比值的對(duì)數(shù)二劑量法： （）（）本法計(jì)算所得效價(jià)，如低于估計(jì)效價(jià)的或高于估計(jì)效價(jià)的時(shí)，則應(yīng)調(diào)整其估計(jì)效價(jià)，重新進(jìn)行測定。.可信限計(jì)算由于生物差異性的存在，生物檢定的實(shí)驗(yàn)誤差一般都比較大，故實(shí)驗(yàn)結(jié)果只是對(duì)于真正結(jié)果的一個(gè)估計(jì)值，它對(duì)真正結(jié)果還有一段距離，可信限（L）就是對(duì)真正結(jié)果的一個(gè)估計(jì)范圍。因此，可信限是精密度的一個(gè)標(biāo)志，常用來表示實(shí)驗(yàn)誤差，一般以概率水平0.95時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信限高限和低限的范圍來表示，即“實(shí)際結(jié)果可信限”，在生物檢定中，每個(gè)品種，根據(jù)所規(guī)定的檢驗(yàn)方法，都可總結(jié)出一個(gè)正常的可信限率（如英國藥典規(guī)定抗生素生物檢定法的可