低聚木糖的模擬移動(dòng)床色譜分離研究

1、低聚木糖的模擬移動(dòng)床色譜分離研究孟 娜1，馮興元2，王成福3，路福平1，*（1.天津科技大學(xué)生物工程實(shí)驗(yàn)室 ，工業(yè)微生物省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ，天津 300457；2.黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心 ，黑龍江大慶 163319；3.山東福田藥業(yè)有限公司 ，山東禹城 251200）摘 要：研 究 了 用 模 擬 移 動(dòng) 床 色 譜 分 離 高 含 量 低 聚 木 糖 的 工 藝 。 首 先 通 過(guò) 單 柱 固 定 床 實(shí) 驗(yàn) 來(lái) 選 擇 適 合 低 聚 木 糖 分 離的 固 定 相 ， 比 較 了 不 同 類(lèi) 型 的 離 子 交 換 樹(shù) 脂 對(duì) 低 聚 木 糖 和 單 糖 混 合 液 的

2、 分 離 度 和 分 離 效 率 ，篩 選 出 diaion-ubk530na樹(shù) 脂 為 合 適 的 分 離 介 質(zhì) ；然 后 運(yùn) 用 真 實(shí) 移 動(dòng) 床 模 型 ，近 似 確 立 模 擬 移 動(dòng) 床 色 譜 分 離 工 藝 的 初 始 操 作 參 數(shù) ，在 理 論 分 離 原 理 的 指 導(dǎo) 下 ，優(yōu) 化 分 離 條 件 ，在 閥 切 換 時(shí) 間 為 300s、進(jìn) 料 流 量 和 洗 脫 流 量 分 別 為 3.5ml/min和 5ml/min、提 取 液 和 提 余 液 流 量 分 別 為 3.8ml/min和 4.7ml/min、同 時(shí) 循 環(huán) 流 量 控 制 在 8.9ml/min的

3、條 件 下 ，使 分 離 后 的 低 聚 木 糖 、單 糖 純 度 均 在90%以 上 ，收 率 分 別 達(dá) 到91.55%和92.18%。關(guān)鍵詞：模 擬 移 動(dòng) 床 色 譜 ，低 聚 木 糖 ，樹(shù) 脂 ，優(yōu) 化study on separation of xylooligosaccharides by simulated movingbed chromatographymeng na1, feng xing-yuan2, wang cheng-fu3, lu fu-ping1, *（1.key laboratory of industrial microbiology, ministry o

4、f education，college of biotechnology, tianjin university of science and technology, tianjin 300457, china；2.the agricultural products processing engineering research center, daqing 163319,china；3.futaste pharmaceutical company limited, yucheng 251200,china）abstract：the separation technique of xylool

5、igosaccharides with simulated moving bed chromatography wasexplored in this paper. first of all，the stationary phase was chosen which was perfect for the separation by the way of single column experiment. different types of ion-exchange resin were applied on the target of resolution and separation e

6、fficiency. and diaion -ubk530na resin was more effective compared to others. then the simulated moving bed chromatography operation was implemented. on the assistance of true moving bedmodel，the initial operating parameters were established. further additional optimization work was tried on thedirec

7、tion of theory. the optimum conditions were as follows：shift time interval was 300s， quantity of flow in the entrance and eluent were 3.5ml/min and 5ml/min，respectively. at the same time，the flux of the extract and raffinate were 3.8ml/min and 4.7ml/min，respectively. besides，the circulating flow was

8、 kept within 8.9ml/min. finally，we gained products with purity both more than 90%，yield coefficient of 91.55% and 92.18% respectively. key words：simulated moving bed chromatography；xylooligosaccharides；resin；optimization文 章 編 號(hào)：1002-0306（2011）10-0310-04中圖分類(lèi)號(hào)：ts241文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：b低聚木糖作為目前應(yīng)用最廣泛的功能性低聚糖之一，其獨(dú)特的生理

9、活性和良好的理化特性已經(jīng)得 到普遍的認(rèn)可，在日本，超過(guò)半數(shù)的“特定保健食品” 種類(lèi)中添加了低聚木糖1，因?yàn)樗司哂幸话愎δ?性低聚糖的功效外，還有極好的耐熱性，并且在酸性 條件（ph2.5）下也不分解，幾乎100%到達(dá)腸道，對(duì)雙 歧桿菌的增殖能力更強(qiáng)2。在低聚木糖的生產(chǎn)中，分離提純一直是主要的技術(shù)難題之一，目前常用的方法有柱色譜分離法、膜分離法、酶分離法和微生物發(fā) 酵法等3。膜分離過(guò)程是依據(jù)濾膜孔徑的大小使物質(zhì) 通過(guò)或被截留于膜而達(dá)到物質(zhì)分離的目的。由于制膜技術(shù)的限制，膜的截留孔徑不是絕對(duì)的，而是一個(gè) 范圍的平均值，再加上被分離糖液的濃度較高，因此 要達(dá)到較高的分離度往往需要較長(zhǎng)的柱膜長(zhǎng)度，

10、使分離過(guò)程變得不經(jīng)濟(jì)。酶分離法和微生物發(fā)酵法均 是對(duì)糖液中某一種或幾種成分的去除，過(guò)程難以有 效控制，影響了工業(yè)化生產(chǎn)。色譜分離在糖類(lèi)及其衍 生物的生產(chǎn)中是一種廣為應(yīng)用的單元操作，模擬移收稿日期：20101115 * 通 訊 聯(lián) 系 人作者簡(jiǎn)介：孟娜（1984-），女，碩士研究生，研究方向：微生物與生化藥學(xué)。動(dòng)床色譜（smbc）是連續(xù)色譜的一種，該分離技術(shù)自度和收率作為衡量工藝條件優(yōu)劣的指標(biāo)，從而確定20世紀(jì)60年代發(fā)展以來(lái)，以其分離能力強(qiáng)、設(shè)備體積小、投資成本低、便于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)控制并特別有利于分 離熱敏性及難以分離的物質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)，在連續(xù)性大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛4。本文通過(guò)單柱固定床實(shí)

11、驗(yàn)，篩選出適合于低聚木糖分離的樹(shù)脂，再 利用模擬移動(dòng)床色譜（smbc）對(duì)預(yù)處理后的含有低 聚木糖的原料液進(jìn)行分離提純，確定了最佳工藝條 件，為進(jìn)一步擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模提供一定的參考。出較佳的操作條件。洗脫劑提取液區(qū)區(qū)區(qū)切換方向材料與方法11.1材料與儀器低聚木糖原料液 自制，玉米皮經(jīng)酶水解；木糖、阿拉伯糖對(duì)照品 禹城福田藥業(yè)有限公司；低聚木糖 對(duì)照品 95型，山東龍力生物科技有限公司；色譜分離 樹(shù) 脂 purolite -pcr642ca、amberlite -r1310na、 diaion-ubk530na；乙腈 色譜純；高純水。單柱固定床裝置 吸附柱（14mm2mm1200mm，不銹鋼材質(zhì)，帶恒

12、溫夾套）、平流泵、定量管、恒溫水浴槽（精度0.5）、壓力表、自動(dòng)收集器；高效液相色 譜儀 agilent1200，配有相應(yīng)的泵和示差折光檢測(cè)器 及色譜工作站；色譜柱 rezex7.8300mm，8m ca， 美國(guó)phenomenex公司；模擬移動(dòng)床分離設(shè)備 xz12z-提余液區(qū)圖1 smbc分離過(guò)程示意圖進(jìn)料液結(jié)果與討論22.1合適樹(shù)脂的選擇糖分子是呈電中性的，它不具有離子的特征。如 果糖分子要與樹(shù)脂發(fā)生作用，它首先要進(jìn)入樹(shù)脂中，一個(gè)葡萄糖分子的直徑約為5.13魡，木糖分子的還要更小，而木二糖、木三糖、木四糖、木五糖等低聚木糖分子均為線(xiàn)性分子，可以估計(jì)，大些的低聚木糖分子 直徑約在28魡左右。

13、用來(lái)分離單糖或低聚糖等分子量 較小物質(zhì)的樹(shù)脂，一般都為凝膠型樹(shù)脂。凝膠型樹(shù)脂 具有均相凝結(jié)的結(jié)構(gòu)，在溶脹狀態(tài)下才顯示出孔穴， 樹(shù)脂顆粒的毛細(xì)孔徑很小，一般為30魡以下，因此，不同的孔徑就對(duì)不同的糖分子產(chǎn)生了選擇，從而起到一種體積排阻效應(yīng)；除此以外，樹(shù)脂還通過(guò)靜電固定 在強(qiáng)酸陽(yáng)離子交換樹(shù)脂上的金屬陽(yáng)離子和糖上的羥 基形成給體受體配合物。本 實(shí) 驗(yàn) 以 purolite -pcr642ca、amberlite - cr1310na、diaion-ubk530na三種離子交換樹(shù)脂作 為分離介質(zhì)，在相同的分析條件下比較其分離效果。 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為35%的進(jìn)料液經(jīng)高效液相分析得低聚木 糖69.4%、木糖22

14、.4%、阿拉伯糖8.1%、雜糖0.1%，在進(jìn) 樣量為10ml，柱溫70，高純水做流動(dòng)相，流速為1.4ml/min條件下得到的分離流出曲線(xiàn)如圖2圖4。1.2l，大慶宏源分離技術(shù)研究所；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀eyela；阿貝折光儀。1.2hplc檢測(cè)條件日本流動(dòng)相：高純水100% ；流速：0.6ml/min；柱溫：38；進(jìn)樣量：10l。固定床吸附與洗脫實(shí)驗(yàn)將預(yù)處理后的樹(shù)脂裝入單柱中，開(kāi)啟平流泵向 其中注水，待將柱中空氣排盡后，調(diào)節(jié)泵行程至所需 流速，同時(shí)開(kāi)啟恒溫水浴和循環(huán)水泵，使吸附柱夾套 溫度恒定于70，在六通切換閥取樣位置，將質(zhì)量分 數(shù)為35%的低聚木糖原料液加入定量管，把切換閥 切換至進(jìn)料，同時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)

15、，當(dāng)進(jìn)料至10ml時(shí)，切換 閥切回，停止進(jìn)料，以高純水作為洗脫劑開(kāi)始洗脫分離，待流出液中有分離組分流出時(shí)，開(kāi)始采樣，每管采 樣體積3ml，直至流出液中糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于0.5%。1.4 模擬移動(dòng)床分離低聚木糖的工藝本實(shí)驗(yàn)所用的模擬移動(dòng)床分離設(shè)備是四區(qū)十二 柱系統(tǒng)，各區(qū)柱數(shù)分布不同，其示意圖如圖1，不同分 區(qū)的功能不同：區(qū)是洗脫區(qū)，其功能是將強(qiáng)吸附組分解吸；區(qū)是精餾區(qū)，在未進(jìn)樣條件下，繼續(xù)用流 動(dòng)相沖洗，相當(dāng)于精餾；區(qū)是吸附區(qū)，其功能是將 強(qiáng)吸附組分吸附；區(qū)作用是將弱組分吸附，再生洗脫液（d），也相當(dāng)于精餾。其中起主要分離作用的是 區(qū)和區(qū)，它們承擔(dān)基本的分離任務(wù)，所以柱數(shù)相 對(duì)較多。柱色譜系統(tǒng)在相

16、應(yīng)管路和驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)、傳動(dòng)系 統(tǒng)的銜接配合下，通過(guò)多通旋轉(zhuǎn)分配閥的定子盤(pán)與轉(zhuǎn)子盤(pán)來(lái)實(shí)現(xiàn)模擬移動(dòng)與兩相逆流的效果，達(dá)到分 離的目的。高濃度的進(jìn)料液（f）從、區(qū)之間進(jìn)入 smb系統(tǒng)，提余液（r）為弱吸附組分低聚木糖溶液， 提取液（e）為強(qiáng)吸附組分，即含有木糖、阿拉伯糖等的單糖溶液，分別取樣進(jìn)行高效液相色譜分析，以純1.33530252015105低聚木糖 木糖 阿拉伯糖 雜糖024 27 30 33 36 39 42 45 48 51 54 57 60 63 66 69 72 75 78流出體積（ml）圖2 purolite-pcr642ca樹(shù)脂分離流出曲線(xiàn)在低聚木糖純度達(dá)到90%以上的時(shí)候，不同樹(shù)

17、脂作為分離介質(zhì)分離后的收率情況如表1所示。因?yàn)椴煌再|(zhì)、不同分子量的糖與金屬陽(yáng)離子形成配位絡(luò)合物的情況不同，由以上對(duì)照可以看出， 不同樹(shù)脂表現(xiàn)出了差異的分離效果。配合物越穩(wěn)定， 此類(lèi)糖分子就越受阻滯，而不形成配合物或是形成 很弱的配合物的糖分子很快就從柱中流出。于是，固 定在樹(shù)脂上的陽(yáng)離子形式成為影響低聚木糖分離過(guò)311 2011年第10期干物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）程的一個(gè)重要參數(shù)。不論哪種樹(shù)脂，均是低聚木糖先式中：q流量，ml/min；上下標(biāo)：d洗脫液；分離出，說(shuō)明低聚木糖是弱吸附組分，木糖、阿拉伯糖等單糖的性質(zhì)相近，保留時(shí)間相對(duì)長(zhǎng)，作為強(qiáng)吸附 組分后分離出；在達(dá)到90%純度的前提下，diaion

18、- ubk530na樹(shù)脂的分離度較好，得到的低聚木糖收率 也相對(duì)較高。所以選擇該樹(shù)脂作為模擬移動(dòng)床色譜 柱中的填料，進(jìn)一步探討smbc的分離效果。35f進(jìn)料液；r提余液；e提取液；re循環(huán)液。2.2.2 smbc分離提純低聚木糖的條件優(yōu)化 從經(jīng) 濟(jì)觀點(diǎn)來(lái)看，操作參數(shù)的優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)就是在提取液和提余液保持所需純度和收率的前提下，使固定相和流動(dòng)相的耗費(fèi)量最少，即使單位產(chǎn)品的分離成本降 到最低水平6。設(shè)弱吸附組分低聚木糖（a）從提余液（r）出口 收集，強(qiáng)吸附組分單糖（b）從提取液（e）出口收集，并 分別定義其純度和收率如下：a低聚木糖 木糖 阿拉伯糖 雜糖30252015105100c提余液中a的純度：

19、pr=ra bcr+crbe100c024 27 30 33 36 39 42 45 48 51 54 57 60 63 66 69流出體積（ml）提取液中b的純度：pe=a bce+cea圖33530252015105amberlite-cr1310na樹(shù)脂分離流出曲線(xiàn)100c qr提余液中a的收率：pr=racf qf低聚木糖 木糖 阿拉伯糖 雜糖b 100c qe提取液中b的收率：pe=ebcf qf式中：pr提余液純度，%；pe提取液純度，%；c組分在液相中的濃度；q流量，ml/min；上下標(biāo)：a弱吸附組分；b強(qiáng)吸附組分；f進(jìn)料液；r提 余液；e提取液。優(yōu)化的目的在于確定各區(qū)最佳固液相

20、流量，以達(dá)到較高的生產(chǎn)效率，為了在提余液中回收弱吸附 組分低聚木糖（a），在提取液中回收強(qiáng)吸附組分木糖、 阿拉伯糖等單糖（b），必須滿(mǎn)足一些約束條件：區(qū) 是組分b的解析區(qū)，洗脫劑會(huì)將固定相沖洗干凈，使 其不將單糖帶入?yún)^(qū)，因此要使q大于單糖隨固定 相移動(dòng)的速度；區(qū)作為精餾區(qū)，要使q介于低聚木 糖和單糖的移動(dòng)速度之間，從而可在提取液出口得 到不含低聚木糖的單糖；區(qū)作為b組分的吸附區(qū)，要 控制q使僅a組分低聚木糖隨流動(dòng)相移動(dòng)，從而在 提余液出口得到較純的低聚木糖；位于洗脫劑入口 和提余液出口之間的區(qū)有兩方面的作用：一是吸 附組分a，使洗脫劑與新鮮的洗脫劑一起進(jìn)入?yún)^(qū)， 達(dá)到循環(huán)利用的目的；二是將區(qū)和區(qū)

21、隔開(kāi)，以免 提余液中的低聚木糖進(jìn)入?yún)^(qū)而降低收率，起到了 一定的緩沖作用，因此要控制q使其小于組分a的 移動(dòng)速度，從而不會(huì)污染區(qū)。由此確定了一組分離 操作的初始條件，如表2所示，經(jīng)檢測(cè)分析ad、bd出 口中的a、b組分純度都較低，收率也相對(duì)小，即兩組 分分離程度不理想，然后按照smbc的分離原理進(jìn)行 了如下優(yōu)化:優(yōu)化1：增大循環(huán)流量，也就是區(qū)流量，改善低 聚木糖的吸附，使不進(jìn)入?yún)^(qū)，分析發(fā)現(xiàn)兩種組分的純度均有所提高，但收率變化不大；優(yōu)化2：減小ad流量，由流量關(guān)系公式可知q增 大，提高了低聚木糖隨流動(dòng)相移動(dòng)的速度，從而側(cè)面 改善了提取液中單糖的純度，使兩種組分的分離度 有所提高；優(yōu)化3：提高洗脫劑

22、流量，在循環(huán)流量不變的情024 27 30 33 36 39 42 45 48 51 54 57 60 63 66 69 72流出體積（ml）圖4 diaion-ubk530na樹(shù)脂分離流出曲線(xiàn)表1 不同樹(shù)脂對(duì)低聚木糖和單糖分離性能的影響流速（ml/min）低聚木糖收率（%）樹(shù)脂類(lèi)型分離度purolite-pcr642caamberlite-cr1310na0.430.5556.4566.901.4 diaion-ubk530na 0.55 68.33 2.2 模擬移動(dòng)床實(shí)驗(yàn)2.2.1 smb模型的選擇 模擬移動(dòng)床色譜分離過(guò)程 的基礎(chǔ)是柱過(guò)程，柱過(guò)程在高濃度進(jìn)料條件下為非線(xiàn)性過(guò)程，考慮各種擴(kuò)散

23、及相間傳質(zhì)阻力，其特征為非理想非平衡，而smb是柱的串聯(lián)組合，是一個(gè)多區(qū) 帶系統(tǒng)，每帶流速不同，系統(tǒng)周期性地連續(xù)運(yùn)行，所 以總體來(lái)說(shuō)，是一個(gè)非線(xiàn)性、非理想、非平衡、多自由 度的周期過(guò)程。對(duì)于這類(lèi)復(fù)雜的連續(xù)過(guò)程，無(wú)論是初 始分離條件的選擇，還是中間過(guò)程的控制，都要通過(guò) 多個(gè)參數(shù)的調(diào)節(jié)來(lái)實(shí)現(xiàn)，而實(shí)現(xiàn)這種選擇與調(diào)節(jié)都 必須依賴(lài)smb的數(shù)學(xué)模型5。精確的smb模型需要明確考慮循環(huán)切換操作， 其數(shù)學(xué)關(guān)系式復(fù)雜，為分析方便，本實(shí)驗(yàn)采用不計(jì)孔內(nèi)過(guò)程的色譜模型，即采用基于等價(jià)的真實(shí)移動(dòng)床（tmb）近似，把切換時(shí)間轉(zhuǎn)換成固相流速，忽略循環(huán) 口的切換，得各分區(qū)流量關(guān)系如下：qfqd=qeqrq=qreqd q=q

24、reqdqe q=qreqdqfqe q=qre312 2011年第10期干物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）干物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）況下，區(qū)流量增大，從而將強(qiáng)吸附組分單糖充分解diaion-ubk530na樹(shù)脂作為固定相，高純水作為流吸，提高了其收率和純度。優(yōu)化4：在純度和收率滿(mǎn)足一定標(biāo)準(zhǔn)的前提下， 為了提高生產(chǎn)效率，就可以適當(dāng)加大進(jìn)料流量，從而 體現(xiàn)smbc作為連續(xù)操作工藝優(yōu)于分批操作的特點(diǎn)， 為工業(yè)化大規(guī)模應(yīng)用提供一定的參考。表2 smbc分離提純低聚木糖條件優(yōu)化過(guò)程動(dòng)相，分離預(yù)處理后的含有低聚木糖的溶液，通過(guò)優(yōu)化分離條件，在閥切換時(shí)間為300s、進(jìn)料流量和洗脫 流量分別為3.5ml/min和5ml/min

25、、提取液和提余液 流量分別為3.8ml/min和4.7ml/min、同時(shí)循環(huán)流量控 制在8.9ml/min 的工藝操作下，使分離后的低聚木 糖、單糖純度均在90%以上，收率分別達(dá)到91.55%和92.18%。由此得到的低聚木糖純度高、收率大，且工 藝操作簡(jiǎn)單，處理量大，生產(chǎn)成本相對(duì)較低，適合于 工業(yè)化規(guī)模的應(yīng)用。參考文獻(xiàn)初始 條件操作參數(shù)優(yōu)化1優(yōu)化2優(yōu)化3優(yōu)化4切換時(shí)間（s）進(jìn)料流量（ml/min） 洗脫流量（ml/min） ad流量（ml/min） bd流量（ml/min） 循環(huán)流量（ml/min） 低聚木糖（%）30034.52.94.68.421.8475.3520.7582.4887.

26、647.3111.7530034.52.94.68.916.0881.9819.7583.9192.714.4813.0085.2730034.52.84.78.914.583.3219.388.7590.355.8713.2590.04300353.84.28.96.1388.1118.2593.4592.436.9213.190.973003.553.84.78.97.8390.0518.2592.1891.655.7413.0091.551 張 軍 華 ，徐 勇 ，勇 強(qiáng) ，等 .低聚木糖分離純化的研究進(jìn)展 j.中國(guó)生物工程雜志 ，2004，24（8）：25-28.2 石 波 ，李 里

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28、-304.單糖（%）濃度（brix%） 單糖收率（%） 低聚木糖（%） 單糖（%） 濃度（brix%）adbd低聚木糖收率（%） 83.25結(jié)論本實(shí)驗(yàn)采用模擬移動(dòng)床色譜 （smbc） 技術(shù)，以3!（上 接 第309頁(yè) ）度、時(shí)間和料液比對(duì)?；撬崽崛×康挠绊懚歼_(dá)到了極顯著水平（p0.01），加酶量在實(shí)驗(yàn)因素水平范圍 內(nèi)對(duì)實(shí)驗(yàn)沒(méi)有顯著性影響。正交實(shí)驗(yàn)中最適宜酶解工藝組合為a1b2c2d2，因素a、c、d對(duì)?；撬崽崛×慷?有顯著性影響，因此因素a取40，因素c取7.2，因素d 取19（g/l）；因素b對(duì)實(shí)驗(yàn)無(wú)顯著性影響，且加酶量從1000u/g到1200u/g，?；撬岷肯嗖畈淮螅用噶繛?000u

29、/g時(shí)?；撬崽崛×繛?.623mg/g，加酶量為1200u/g時(shí)?；撬崽崛×繛?.628mg/g），考慮到節(jié)省成本，選 取加酶量為1000u/g（鮮肉）。綜上所述，中性蛋白酶酶 解提取牛磺酸的最適宜工藝為：溫度40，加酶量1000u/g（鮮肉），ph7.2，料液比19（g/l）。表3 中性蛋白酶酶解實(shí)驗(yàn)方差分析條件下水解5h，?；撬崽崛×繛?.623mg/g（鮮肉）。參考文獻(xiàn)1 鮑 建 民.?；撬岬纳锕δ苎?究 進(jìn) 展 j.食 品 與 藥 品 ，2006，8（5）：18-20.2 譚 樂(lè) 義 ，章 超 樺 ，薛 長(zhǎng) 湖 .?；撬岬纳锘钚约捌湓诤Ｑ笊?物 中 的 分 布j.湛江海洋大學(xué)學(xué)報(bào) ，2000，20（3）：75-79.3 staplcton p p，oflahcrty l，rcdmond h p，et al. jpen j p