胚胎移植技術(shù)在山羊良種生產(chǎn)中的研究與應(yīng)用

1、胚胎移植技術(shù)在山羊良種生產(chǎn)中的研究與應(yīng)用 洪瓊花 金衛(wèi)華 袁躍云 等摘要家畜胚胎移植技術(shù)是家畜繁殖領(lǐng)域的一項(xiàng)高新生物技術(shù)。本研究通過對不同品種、季節(jié)、年齡和重復(fù)超排對山羊超排反應(yīng)的影響，胚齡和移植方法對移植產(chǎn)羔率的影響及不同孕激素制劑對同期發(fā)情效果的影響等因素進(jìn)行分析，為山羊胚胎移植產(chǎn)業(yè)化提供理論和技術(shù)依據(jù)。本研究于2000年9月2005年6月分別對883只（次）波爾山羊、95只黑山羊、78只努比山羊和31只薩能奶山羊采用孕激素+fsh法進(jìn)行超排處理，結(jié)果表明：努比山羊的超排反應(yīng)好于其它三個(gè)品種，其次是波爾山羊、薩能奶山羊和黑山羊，波爾山羊與努比山羊，黑山羊與薩能奶山羊在回收胚胎數(shù)、受精卵數(shù)、

2、可用胚數(shù)間差異不顯著（p0.05），而波爾山羊、努比山羊與黑山羊、薩能奶山羊在以上三者間差異顯著或極顯著（p0.05或p0.01）；超排具有重復(fù)性，第二次超排回收胚數(shù)顯著高于第一次（p0.05）；經(jīng)產(chǎn)羊超排后只均回收胚胎數(shù)明顯高于育成羊（p0.05)，可用胚率育成羊高于經(jīng)產(chǎn)羊，分別為6.01%和81.15%，但差異也不顯著（p0.05）；對12080只受體黑山羊埋置cidr或孕酮海綿栓并分別注射folligon的方法進(jìn)行同期發(fā)情處理，24h內(nèi)的同期發(fā)情率差異極顯著（p0.05)，說明使用cidr+folligon對山羊進(jìn)行同期發(fā)情，發(fā)情較集中；薩能奶山羊的胚胎移植產(chǎn)羔率高于波爾羊、黑山羊和努比

3、山羊，分別為54.86、52.16、50.59和52.93，但差異不顯著（p0.05）。囊胚的移植產(chǎn)羔率顯著高于桑椹胚和孵化囊胚的移植產(chǎn)羔率（p0.05）；手術(shù)法和腹腔鏡法胚胎移植的產(chǎn)羔率分別為52.66和52.19，兩種方法移植產(chǎn)羔率差異不顯著（p0.05）；在云南，春秋兩季對波爾山羊超排效果無顯著差異（p0.05）。關(guān)鍵詞山羊胚胎移植超數(shù)排卵同期發(fā)情山羊業(yè)是畜牧業(yè)生產(chǎn)的重要組成部分，優(yōu)良羊種的選育、擴(kuò)繁是迅速提高養(yǎng)羊經(jīng)濟(jì)效益的主要途徑。云南省草山草坡、山羊資源豐富，存欄數(shù)量多(2004年存欄近800萬只)，具有發(fā)展山羊生產(chǎn)得天獨(dú)厚的自然條件。建國以來，羊種改良和選育是云南省發(fā)展養(yǎng)羊業(yè)提高質(zhì)

4、量的主要技術(shù)措施。近幾年，先后引進(jìn)了努比山羊、波爾山羊、薩能奶山羊?qū)Φ胤狡贩N山羊進(jìn)行改良，對云南省山羊業(yè)的發(fā)展起到了巨大的推動(dòng)作用。家畜胚胎移植技術(shù)是家畜繁殖領(lǐng)域的一項(xiàng)高新生物技術(shù)，可充分利用具有優(yōu)秀遺傳性狀及生產(chǎn)性能的品種或個(gè)體，或利用從國外引進(jìn)的珍稀品種及育種核心群，迅速擴(kuò)大其后代數(shù)量。山羊胚胎移植的成功依賴于一套完善、成熟的技術(shù)體系，是一項(xiàng)嚴(yán)密的系統(tǒng)工程。只有把好每一個(gè)技術(shù)環(huán)節(jié)，才能降低各種變化因素對胚胎移植效率的影響，本研究通過對不同品種、季節(jié)、年齡和重復(fù)超排對山羊超排反應(yīng)的影響，不同胚齡、不同移植方法對移植產(chǎn)羔率的影響及不同孕激素制劑對同期發(fā)情效果的影響等因素進(jìn)行分析，為山羊胚胎移植

5、產(chǎn)業(yè)化提供理論和技術(shù)依據(jù)，從而提高胚胎移植技術(shù)在山羊良種擴(kuò)繁和育種中的應(yīng)用效率。1材料和方法1.1時(shí)間和地點(diǎn)2000年9月2005年6月，在云南省7個(gè)種羊場對883只次波爾山羊、95只黑山羊、78只努比山羊和31只薩能奶山羊進(jìn)行超排處理，對12080只受體黑山羊采用不同的孕酮制劑實(shí)施同期發(fā)情處理的結(jié)果進(jìn)行了觀察。1.2供體母羊的選擇及飼養(yǎng)管理供體母羊?yàn)?998年從澳大利亞引進(jìn)及自繁的純種波爾山羊、云南地方良種黑山羊、努比山羊、薩能奶山羊，年齡為1-4歲，健康、無繁殖疾病。供體母羊除正常的飼養(yǎng)管理外，在超排處理前一個(gè)月加強(qiáng)補(bǔ)飼富含維生素、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)的配合飼料。1.3受體羊的準(zhǔn)備及飼養(yǎng)管理受體

6、羊?yàn)樵颇系胤搅挤N黑山羊，年齡25歲，經(jīng)產(chǎn)、健康、繁殖機(jī)能正常。購入后用氯前列烯醇進(jìn)行流產(chǎn)處理，并加強(qiáng)補(bǔ)飼和管理，使其盡快適應(yīng)新的環(huán)境和飼養(yǎng)管理，膘情達(dá)到中等以上。1.4藥品垂體促卵泡素（ofsh,ovagen）：新西蘭immunochemicalproductsltd.生產(chǎn)；folligon和progestin：澳大利亞intervetpty.ltd.生產(chǎn)；cidr：新西蘭pharmacia&upjohnpty.ltd.生產(chǎn)，0.3g/支；孕酮海綿栓：澳大利亞intervetpty.ltd.生產(chǎn)，每個(gè)含孕酮40mg；氯前列烯醇（i.c.i80996）：上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所生產(chǎn)。1.5供體羊

7、超數(shù)排卵采用孕激素+fsh法進(jìn)行超排處理，即在供體羊發(fā)情周期的任意一天陰道埋置第一個(gè)cidr（第1d），第10d換第二個(gè)cidr，第16d開始連續(xù)4d等量注射ofsh（2次/d），經(jīng)產(chǎn)羊的總劑量為7.04mg/只、育成羊的為5.28mg/只，第7次注射ofsh時(shí)，取出cidr，并準(zhǔn)確記錄取栓時(shí)間；取栓后第二天發(fā)情，發(fā)情后開始第1次配種，之后間隔12h進(jìn)行第2、3次配種。在發(fā)情后第4d注射progestin（2次/d）。1.6受體羊的同期發(fā)情處理采用埋置cidr或孕酮海綿栓和注射folligon對受體羊進(jìn)行同期發(fā)情處理。在受體羊發(fā)情周期的任意一天埋置cidr或孕酮海綿栓（與供體羊同步進(jìn)行），撤栓

8、時(shí)每只羊注射folligon200iu。1.7胚胎的采集及移植超排羊自發(fā)情后第7d用手術(shù)法從子宮中沖取致密桑椹胚或囊胚，用于鮮胚移植或冷凍保存。采用常規(guī)手術(shù)法和腹腔鏡法進(jìn)行胚胎移植，供、受體羊發(fā)情同步差在12h的可進(jìn)行移植。移植部位除與供體羊采胚部位相對應(yīng)外，還應(yīng)選擇有黃體且黃體發(fā)育良好側(cè)的子宮角移植。1.8統(tǒng)計(jì)分析采用t檢驗(yàn)。2結(jié)果與討論2.1不同品種山羊超數(shù)排卵效果比較表1不同品種山羊超排結(jié)果比較品種供體羊數(shù)回收胚胎數(shù)受精卵數(shù)未受精卵數(shù)平均獲可用胚數(shù)波爾山羊88314.376.58a14.217.13a0.163.2012.166.49a黑山羊958.833.88b8.403.84b0.4

9、32.057.544.77b努比山羊7817.267.22a16.676.43a0.591.7614.976.35a薩能奶山羊3112.736.91b11.255.94b0.872.7110.124.79b注：同一欄數(shù)值中具有不同字母上標(biāo)示差異顯著或極顯著（p0.05或p0.05）從表1可看出，四個(gè)品種山羊通過回收胚胎數(shù)、受精卵數(shù)、可用胚數(shù)的比較，表明努比山羊的超排反應(yīng)好于其它三個(gè)品種，其次是波爾山羊、薩能奶山羊和黑山羊，經(jīng)t檢驗(yàn)分析，波爾山羊與努比山羊、黑山羊與薩能奶山羊在回收胚胎數(shù)、受精卵數(shù)、可用胚數(shù)間差異不顯著（p0.05），而波爾山羊、努比山羊與黑山羊、薩能奶山羊在以上三者間差異顯著或

10、極顯著（p0.05或p0.01），由此說明，不同品種山羊使用同一激素劑量所獲得的超排反應(yīng)、可用胚數(shù)不同，說明遺傳因素對超排反應(yīng)影響較大，繁殖力高的山羊其超排后回收胚數(shù)和可用胚數(shù)亦多。從不同品種超排結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差可看出，超排反應(yīng)在個(gè)體間也存在較大差異，這可能與處理羊?qū)ν庠醇に夭幻舾谢蛉鄙賹sh敏感的卵泡有關(guān)。在實(shí)驗(yàn)過程中還發(fā)現(xiàn)，排卵數(shù)較多的山羊個(gè)體存在排卵不同步的現(xiàn)象，從而導(dǎo)致胚胎的發(fā)育階段不一致，降低了胚胎的質(zhì)量，這可能與超排激素制劑中fsh和lh的比例有關(guān)。2.2重復(fù)超排對波爾山羊超排效果的影響表2.重復(fù)超排對波爾山羊超排效果的影響超排次數(shù)供體羊數(shù)回收胚胎數(shù)受精數(shù)未受精數(shù)平均獲可用胚數(shù)第一次

11、23713.097.39b12.676.450.513.4311.136.42a第二次23715.216.54a14.487.160.785.9412.977.31a注：同一欄數(shù)值中具有不同字母上標(biāo)示差異顯著或極顯著（p0.05或p0.05）分別對237只波爾山羊進(jìn)行重復(fù)超排處理，即于第一次超排后使供體羊自然繁殖一胎，然后進(jìn)行第二次超排。兩次超排所用的ofsh劑量和超排方法相同。從表2可看出，第二次超排回收胚數(shù)明顯高于第一次超排（p0.05），但第二次超排的可用胚數(shù)高于第一次，且采胚過程中發(fā)現(xiàn)，由于第一次手術(shù)較成功，第二次回收胚胎時(shí)，子宮很少發(fā)生粘連。由此表明，在超排后，讓母羊自然繁殖一胎，超

12、排反應(yīng)和胚胎回收率不受重復(fù)超排的影響。另外，在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)注意選擇超排效果較好的母羊進(jìn)行重復(fù)超排，以提高胚胎移植的效率，也更能加速遺傳改良進(jìn)程，這對山羊moet育種的實(shí)施極為有利；重復(fù)超排的總體成功率不僅取決于排卵數(shù)量的多少，且取決于以后幾次重復(fù)采胚的胚胎回收率，所以應(yīng)盡量安排采胚技術(shù)熟練的技術(shù)人員進(jìn)行手術(shù)操作，以提高對母羊的重復(fù)利用率和超排效率。2.3育成和經(jīng)產(chǎn)波爾山羊超排效果比較表3.育成和經(jīng)產(chǎn)波爾山羊超排效果比較組別供體羊數(shù)回收胚胎數(shù)平均獲可用胚數(shù)可用胚%育成羊18512.085.42a10.395.67a86.01a經(jīng)產(chǎn)羊37915.976.77b12.966.85a81.15a注：同

13、一欄數(shù)值中具有不同字母上標(biāo)示差異顯著或極顯著（p0.05或p0.05）用經(jīng)產(chǎn)羊3/4劑量的ofsh、相同的超排方案對育成羊進(jìn)行超排，從表3可看出，經(jīng)產(chǎn)羊超排后每只平均回收胚胎數(shù)明顯高于育成羊（p0.05)，雖然育成羊的可用胚率高于經(jīng)產(chǎn)羊，分別為86.01和81.15，但平均可用胚數(shù)經(jīng)產(chǎn)羊高于育成羊2.57枚。說明在生產(chǎn)實(shí)際中應(yīng)盡量選擇經(jīng)產(chǎn)母羊做供體。2.4受體黑山羊同期發(fā)情效果同期發(fā)情是山羊胚胎移植計(jì)劃中的一項(xiàng)重要技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)分別用cidr+folligon和孕酮海綿栓+folligon對本地黑山羊進(jìn)行同期發(fā)情處理，表4表明，受體羊在24h內(nèi)和2432h內(nèi)同期發(fā)情率差異極顯著（p0.05)，說

14、明使用cidr+folligon對山羊進(jìn)行同期發(fā)情，發(fā)情較集中，提高了發(fā)情的同期性和胚胎移植的效率。這可能與孕激素的載體不同有關(guān)，cidr是用硅膠作為載體，能保證孕酮的量與釋放速度，而用海綿栓做載體，孕酮在操作過程中易損失，且釋放的量在不同時(shí)間應(yīng)該有差異。表4.用cidr和孕酮海綿栓對受體羊同期發(fā)情的效果比較方法處理羊數(shù)24h內(nèi)發(fā)情率（）24-32h內(nèi)發(fā)情率（）同期發(fā)情率（）cidr+folligon814593.87a3.48a97.35a海綿栓+folligon393571.22b24.15b95.37a注：同一欄數(shù)值中具有不同字母上標(biāo)示差異顯著或極顯著（p0.05或p0.05）2.5不同

15、供體山羊胚胎移植產(chǎn)羔結(jié)果比較從表5可看出，來自于三個(gè)山羊品種的胚胎移植后，產(chǎn)羔率差異不顯著（p0.05），薩能奶山羊的胚胎移植產(chǎn)羔率高于其它三個(gè)品種，分別為54.86、50.59、52.16和52.93。表5.不同品種山羊胚胎移植產(chǎn)羔結(jié)果比較胚源胚胎數(shù)移植受體數(shù)產(chǎn)羔數(shù)產(chǎn)羔數(shù)/胚胎數(shù)(%)黑山羊71671136250.59a波爾山羊100239892522852.16a努比山羊72976740652.93a薩能奶山羊39422612454.86a注：同一欄數(shù)值中具有相同字母上標(biāo)示差異不顯著（p0.05）2.6不同胚齡對胚胎移植產(chǎn)羔率的影響不同發(fā)育階段的胚胎在受體羊發(fā)情后第7d移植。從表6可看出，

16、囊胚的移植產(chǎn)羔率高于桑椹胚、擴(kuò)張囊胚和孵化囊胚，經(jīng)t檢驗(yàn)分析，囊胚的移植產(chǎn)羔率顯著高于桑椹胚和孵化囊胚的移植產(chǎn)羔率（p0.05）。表6.不同胚齡對胚胎移植產(chǎn)羔率的影響胚期胚胎數(shù)移植受體數(shù)產(chǎn)羔數(shù)產(chǎn)羔數(shù)/胚胎數(shù)(%)桑椹胚35033718653.14a囊胚29728518461.95b擴(kuò)張囊胚1551398756.13ab孵化囊胚47422451.06a注：同一欄數(shù)值中具有不同字母上標(biāo)示差異顯著或極顯著（p0.05或p0.05）2.7不同胚胎移植方法對移植產(chǎn)羔率的影響表7.不同胚胎移植方法對移植產(chǎn)羔率的影響移植方法胚胎數(shù)移植受體數(shù)羔數(shù)產(chǎn)羔數(shù)/胚胎數(shù)()手術(shù)法82198211432852.66a腹腔

17、鏡法37523377176252.19a注：同一欄數(shù)值中具有相同字母上標(biāo)示差異不顯著（p0.05）表7所示，通過手術(shù)法和腹腔鏡移植法對胚胎移植產(chǎn)羔率的影響比較，兩種方法移植產(chǎn)羔率分別為52.66和52.19，經(jīng)t檢驗(yàn)分析，移植產(chǎn)羔率差異不顯著（p0.05），腹腔鏡法略低于手術(shù)法，但腹腔鏡法節(jié)省了移植的時(shí)間，減少了對受體的損傷，從而提高了受體的利用率。2.8季節(jié)對波爾山羊超排效果的影響表8.季節(jié)對波爾山羊超排效果的影響季節(jié)供體羊數(shù)回收胚胎數(shù)平均獲可用胚數(shù)春季33913.747.15a11.656.42a秋季54414.776.23a12.495.81a注：同一欄數(shù)值中具有相同字母上標(biāo)示差異不顯著（p0.05）山羊是季節(jié)性的繁殖動(dòng)物，且繁殖旺季出現(xiàn)在秋季；季節(jié)對山羊的超排反應(yīng)是有影響的，盡管用