大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備和轉(zhuǎn)化文檔資料

1、分分子子生生物物學學2008實實驗驗一一. . 實驗目的實驗目的學習學習sds-pagesds-page測定蛋白質(zhì)分子量測定蛋白質(zhì)分子量的原理。的原理。掌握垂直板電泳的操作方法。掌握垂直板電泳的操作方法。運用運用sds-pagesds-page測定蛋白質(zhì)分子量測定蛋白質(zhì)分子量及染色鑒定。及染色鑒定。分分子子生生物物學學2008實實驗驗 二二 . .實驗原理實驗原理帶電質(zhì)點在電場中向帶有異相電荷的電極移動，這種現(xiàn)帶電質(zhì)點在電場中向帶有異相電荷的電極移動，這種現(xiàn)象稱為電泳。象稱為電泳。電泳分類：移動界面電泳、區(qū)帶電泳、穩(wěn)態(tài)電泳。電泳分類：移動界面電泳、區(qū)帶電泳、穩(wěn)態(tài)電泳。區(qū)帶電泳是在半固相或膠狀介

2、質(zhì)上加一個點或一薄層樣區(qū)帶電泳是在半固相或膠狀介質(zhì)上加一個點或一薄層樣品溶液，然后加電場，分子在支持介質(zhì)上或支持介質(zhì)中品溶液，然后加電場，分子在支持介質(zhì)上或支持介質(zhì)中遷移。支持介質(zhì)的作用主要是為了防止機械干擾和由于遷移。支持介質(zhì)的作用主要是為了防止機械干擾和由于溫度變化以及大分子溶液的高密度而產(chǎn)生的對流。溫度變化以及大分子溶液的高密度而產(chǎn)生的對流。區(qū)帶電泳使用不同的支持介質(zhì)，早期有濾紙、玻璃珠、區(qū)帶電泳使用不同的支持介質(zhì)，早期有濾紙、玻璃珠、淀粉粒、纖維素粉、海砂、海綿、聚氯乙烯樹脂；以后淀粉粒、纖維素粉、海砂、海綿、聚氯乙烯樹脂；以后有淀粉凝膠、瓊脂凝膠、醋酸纖維素膜，現(xiàn)在則多用聚有淀粉凝膠

3、、瓊脂凝膠、醋酸纖維素膜，現(xiàn)在則多用聚丙烯酰胺（丙烯酰胺（pagepage）和瓊脂糖凝膠。）和瓊脂糖凝膠。分分子子生生物物學學2008實實驗驗pagepage根據(jù)其有無濃縮效應，分為連續(xù)系統(tǒng)根據(jù)其有無濃縮效應，分為連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)兩大類，連續(xù)系統(tǒng)電泳體系和不連續(xù)系統(tǒng)兩大類，連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中緩沖液中緩沖液phph值及凝膠濃度相同，帶電顆粒值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場作用下，主要靠電荷和分子篩效應。在電場作用下，主要靠電荷和分子篩效應。不連續(xù)系統(tǒng)中由于緩沖液離子成分，不連續(xù)系統(tǒng)中由于緩沖液離子成分，phph，凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性，帶電顆凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性，帶電顆粒在電場

4、中泳動不僅有電荷效應，分子篩粒在電場中泳動不僅有電荷效應，分子篩效應，還具有濃縮效應，因而其分離條帶效應，還具有濃縮效應，因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳。清晰度及分辨率均較前者佳。分分子子生生物物學學2008實實驗驗sds-sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳，是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中聚丙烯酰胺凝膠電泳，是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進引進sdssds（十二烷基磺酸鈉），（十二烷基磺酸鈉）， sdssds能斷裂分子內(nèi)和分能斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級和三級結構，強還原劑能使子間氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級和三級結構，強還原劑能使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂，蛋白質(zhì)在一定濃度的含有強半胱氨酸之間的二

5、硫鍵斷裂，蛋白質(zhì)在一定濃度的含有強還原劑的還原劑的sdssds溶液中，與溶液中，與sdssds分子按比例結合，形成帶分子按比例結合，形成帶負電荷的負電荷的sds-sds-蛋白質(zhì)復合物，這種復合物由于結合大量蛋白質(zhì)復合物，這種復合物由于結合大量的的sdssds，使蛋白質(zhì)喪失了原有的電荷狀態(tài)形成僅保持原有，使蛋白質(zhì)喪失了原有的電荷狀態(tài)形成僅保持原有分子大小為特征的負離子團塊，從而降低或消除了各種蛋分子大小為特征的負離子團塊，從而降低或消除了各種蛋白質(zhì)分子之間天然的電荷差異，由于白質(zhì)分子之間天然的電荷差異，由于sdssds與蛋白質(zhì)的結合與蛋白質(zhì)的結合是按重量成比例的，因此在進行電泳時，蛋白質(zhì)分子的遷

6、是按重量成比例的，因此在進行電泳時，蛋白質(zhì)分子的遷移速度取決于分子大小。當分子量在移速度取決于分子大小。當分子量在15kd15kd到到200kd200kd之間之間時，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對數(shù)呈線性關系，符合下時，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對數(shù)呈線性關系，符合下式：式：logmw=k-bxlogmw=k-bx，式中：，式中：mwmw為分子量，為分子量，x x為遷移率，為遷移率，k k、b b均為常數(shù)，若將已知分子量的標準蛋白質(zhì)的遷移率均為常數(shù)，若將已知分子量的標準蛋白質(zhì)的遷移率對分子量對數(shù)作圖，可獲得一條標準曲線，未知蛋白質(zhì)在對分子量對數(shù)作圖，可獲得一條標準曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進行電泳

7、，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標準曲相同條件下進行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標準曲線上求得分子量。線上求得分子量。分分子子生生物物學學2008實實驗驗 sdssds電泳的成功關鍵之一是電泳過程中，特別電泳的成功關鍵之一是電泳過程中，特別是樣品制備過程中蛋白質(zhì)與是樣品制備過程中蛋白質(zhì)與sdssds的結合程度。的結合程度。影響它們結合的因素主要有三個：影響它們結合的因素主要有三個：溶液中溶液中sdssds單體的濃度，當單體濃度大于單體的濃度，當單體濃度大于1mmol/l1mmol/l時大多數(shù)蛋白質(zhì)與時大多數(shù)蛋白質(zhì)與sdssds結合的重量比結合的重量比為為1:1.41:1.4，如果單休濃度降到，如果

8、單休濃度降到0.5 mmol/l0.5 mmol/l以下以下時，兩者的結合比僅為時，兩者的結合比僅為1: 0.41: 0.4這樣就不能消除蛋這樣就不能消除蛋白質(zhì)原有的電荷差別，為保證蛋白質(zhì)與白質(zhì)原有的電荷差別，為保證蛋白質(zhì)與sdssds的的充分結合，它們的重量比應該為充分結合，它們的重量比應該為1:41:4或或1:31:3樣品緩沖液的離子強度。樣品緩沖液的離子強度。sdssds電泳的樣品緩沖電泳的樣品緩沖液離子強度較低，通常是液離子強度較低，通常是1010100mmol/l100mmol/l1)1)二硫鍵是否完全被還原二硫鍵是否完全被還原分分子子生生物物學學2008實實驗驗采用采用sds-sd

9、s-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測蛋白質(zhì)分子量時，只有完聚丙烯酰胺凝膠電泳法測蛋白質(zhì)分子量時，只有完全打開二硫鍵，全打開二硫鍵， 蛋白質(zhì)分子才能被解聚，蛋白質(zhì)分子才能被解聚，sdssds才能定量地結合才能定量地結合到亞基上而給出相對遷移率和分子量對數(shù)的線性關系。因此在到亞基上而給出相對遷移率和分子量對數(shù)的線性關系。因此在用用sdssds處理樣品同時往往用巰基乙醇處理，巰基乙醇是一種強處理樣品同時往往用巰基乙醇處理，巰基乙醇是一種強還原劑，它使被還原的二硫鍵不易再氧化，從而使很多不溶性還原劑，它使被還原的二硫鍵不易再氧化，從而使很多不溶性蛋白質(zhì)溶解而與蛋白質(zhì)溶解而與sdssds定量結合。定量結合。有許多

10、蛋白質(zhì)是由亞基（如血紅蛋白）或兩條以上肽鏈（如胰有許多蛋白質(zhì)是由亞基（如血紅蛋白）或兩條以上肽鏈（如胰凝乳蛋白酶）組成的，它們在凝乳蛋白酶）組成的，它們在sdssds和巰基乙醇作用下，解離成和巰基乙醇作用下，解離成亞基或單條肽鏈，因此這一類蛋白質(zhì)，測定時只是它們的亞基亞基或單條肽鏈，因此這一類蛋白質(zhì)，測定時只是它們的亞基或單條肽鏈的或單條肽鏈的mwmw。已發(fā)現(xiàn)有些蛋白質(zhì)不能用已發(fā)現(xiàn)有些蛋白質(zhì)不能用sds-pagesds-page測定分子量。如電荷異常測定分子量。如電荷異?；驑嬒螽惓５牡鞍踪|(zhì)，帶有較大輔基的蛋白質(zhì)（某些糖蛋白）或構象異常的蛋白質(zhì)，帶有較大輔基的蛋白質(zhì)（某些糖蛋白）以及一些結構蛋白

11、，如膠原蛋白等。以及一些結構蛋白，如膠原蛋白等。一般至少采用兩種方法測定未知樣品的分子量，互相驗證。一般至少采用兩種方法測定未知樣品的分子量，互相驗證。分分子子生生物物學學2008實實驗驗三三. . 實驗試劑和器材實驗試劑和器材 1.材料：材料： 低分子量標準蛋白試劑盒低分子量標準蛋白試劑盒: 低分子量標準蛋白：低分子量標準蛋白： 兔磷酸化酶兔磷酸化酶b mw=97,400 牛血清白蛋白牛血清白蛋白 mw=66,200 兔肌動蛋白兔肌動蛋白 mw=43,000 牛碳酸酐酶牛碳酸酐酶 mw=31,000 胰蛋白酶抑制劑胰蛋白酶抑制劑 mw=20,100 雞蛋清溶菌酶雞蛋清溶菌酶 mw=14,40

12、0 根據(jù)說明書處理標準蛋白根據(jù)說明書處理標準蛋白 樣品：稱樣品：稱3mg樣品，加樣品，加2 ml蒸餾水溶解。蒸餾水溶解。分分子子生生物物學學2008實實驗驗2.實驗試劑實驗試劑 (1) 30%丙烯酰胺（丙烯酰胺（acr）：稱）：稱acr30g，甲叉雙丙烯酰胺，甲叉雙丙烯酰胺 （bis）0.8g，加蒸餾水至，加蒸餾水至100ml，過濾后置棕色瓶中，過濾后置棕色瓶中， 4貯存可用貯存可用1-2月。月。（2）10%sds（十二烷基磺酸鈉）（十二烷基磺酸鈉）（3）1.5mol/l ph8.8 tris-hcl緩沖液：稱取緩沖液：稱取tris18.2g， 加入加入50ml水，用水，用1mol/l鹽酸調(diào)鹽

13、酸調(diào)ph8.8， 最后用蒸餾最后用蒸餾 水定容至水定容至100ml。（4）1.0mol/lph6.8tris-hcl緩沖液：稱取緩沖液：稱取tris12.1g，加，加 入入50ml水，用水，用1mol/l鹽酸調(diào)鹽酸調(diào)ph6.8， 最后用蒸餾水最后用蒸餾水 定容至定容至100ml。（5）0.05mol/lph8.0tris-hcl緩沖液：稱取緩沖液：稱取tris0.6g，加，加 入入50ml水，用水，用1mol/l鹽酸調(diào)鹽酸調(diào)ph8.0，最后用蒸餾水定，最后用蒸餾水定 容至容至100ml。分分子子生生物物學學2008實實驗驗（7）10%過硫酸銨過硫酸銨(ap)（8）temed（四甲基乙二胺）（四

14、甲基乙二胺）（9）樣品溶解液：）樣品溶解液：sds（100mg）+巰基乙醇（巰基乙醇（0.1ml）+ 溴酚藍（溴酚藍（2mg）+甘油（甘油（2g） +0.05mol/l ph8.0tris- hcl（2ml），最后定容至），最后定容至10ml。（10）固定液：?。┕潭ㄒ海喝?0%甲醇甲醇454ml，冰乙酸，冰乙酸46ml混勻?；靹颉＃?1）染色液：稱取考馬斯亮藍）染色液：稱取考馬斯亮藍r250 0.125g，加上述固定液，加上述固定液 250ml， 過濾后備用。過濾后備用。（12）脫色液：冰乙酸）脫色液：冰乙酸75ml，甲醇，甲醇50ml，加蒸餾水定容至，加蒸餾水定容至1000ml。（13）電

15、極緩沖液（內(nèi)含）電極緩沖液（內(nèi)含0.1%sds，0.05mol/ltris- 0.384mol/l甘甘氨酸緩沖液氨酸緩沖液ph8.3）：稱）：稱tris6.0g，甘，甘 氨酸氨酸28.8g，加入，加入sds1g，加，加蒸餾水使其溶解后定容至蒸餾水使其溶解后定容至1000ml。分分子子生生物物學學2008實實驗驗3. 實驗器材實驗器材垂直板電泳裝置垂直板電泳裝置直流穩(wěn)壓電源直流穩(wěn)壓電源移液管移液管濾紙濾紙 微量注射器微量注射器大培養(yǎng)皿大培養(yǎng)皿分分子子生生物物學學2008實實驗驗各部分凝膠配制各部分凝膠配制分分子子生生物物學學2008實實驗驗四四. . 實驗過程實驗過程 1.1.將玻璃板用蒸餾水洗

16、凈晾干將玻璃板用蒸餾水洗凈晾干, , 準備準備2 2個干凈的個干凈的錐形瓶錐形瓶. .2.2.把玻璃板在灌膠支架上固定好把玻璃板在灌膠支架上固定好. .固定玻璃板時，兩邊用力一定要均勻，防止夾固定玻璃板時，兩邊用力一定要均勻，防止夾壞玻璃板壞玻璃板. .3.3.按比例配好分離膠按比例配好分離膠, ,用移液管快速加入用移液管快速加入, ,大約大約5 5厘米左右厘米左右, ,之后加少許蒸餾水之后加少許蒸餾水, ,靜置靜置4040分鐘分鐘. .凝膠配制過程要迅速凝膠配制過程要迅速, , 催化劑催化劑temedtemed要在注膠要在注膠前再加入前再加入, ,否則凝結無法注膠否則凝結無法注膠. .注膠過

17、程最好一次注膠過程最好一次性完成性完成, ,避免產(chǎn)生氣泡避免產(chǎn)生氣泡. .分分子子生生物物學學2008實實驗驗 水封的目的是為了使分離膠上延平直，并隔絕水封的目的是為了使分離膠上延平直，并隔絕空氣空氣 凝膠聚合好的標志是膠與水層之間形成清晰的凝膠聚合好的標志是膠與水層之間形成清晰的界面界面. .4.4.倒出水并用濾紙把剩余的水分吸干倒出水并用濾紙把剩余的水分吸干, ,按比例配好按比例配好濃縮膠濃縮膠, ,連續(xù)平穩(wěn)加入濃縮膠至離邊緣連續(xù)平穩(wěn)加入濃縮膠至離邊緣5mm5mm處處, ,迅速迅速插入樣梳插入樣梳, ,靜置靜置4040分鐘分鐘. . 樣梳需一次平穩(wěn)插入樣梳需一次平穩(wěn)插入, ,梳口處不得有氣

18、泡梳口處不得有氣泡, ,梳底梳底需水平需水平. .分分子子生生物物學學2008實實驗驗5.5. 在上槽內(nèi)加入緩沖液后在上槽內(nèi)加入緩沖液后, ,拔出樣梳拔出樣梳。 要使鋸齒孔內(nèi)的氣泡全部排出要使鋸齒孔內(nèi)的氣泡全部排出, ,否則會影響加樣效果否則會影響加樣效果. .6 6、加樣加樣（1）取取10l標準蛋白溶解液于標準蛋白溶解液于ep管內(nèi)，再加入管內(nèi)，再加入10l 2倍樣品緩沖液，上樣量為倍樣品緩沖液，上樣量為10l。 （2）取取10l樣品溶液，再加入樣品溶液，再加入10l 2倍樣品緩沖液，上樣倍樣品緩沖液，上樣量分別為量分別為5l和和3l。7.7.用微量注射器距槽底三分之一處進樣用微量注射器距槽底

19、三分之一處進樣, ,加樣前加樣前, ,樣品在樣品在 沸水中加熱沸水中加熱3 3分鐘，去掉亞穩(wěn)態(tài)聚合。分鐘，去掉亞穩(wěn)態(tài)聚合。 注射器不可過低注射器不可過低, ,以防刺破膠體以防刺破膠體, ,也不可過高也不可過高, ,在樣下在樣下 沉時會發(fā)生擴散沉時會發(fā)生擴散. . 為避免邊緣效應為避免邊緣效應, ,最好選用中部的孔注樣最好選用中部的孔注樣. .分分子子生生物物學學2008實實驗驗8.8.電泳槽中加入緩沖液電泳槽中加入緩沖液，接通電源，進行電泳接通電源，進行電泳，開始電流恒，開始電流恒定在定在10ma，當進入分離膠后改為，當進入分離膠后改為20ma，溴酚藍距凝膠邊緣，溴酚藍距凝膠邊緣約約5mm時，

20、停止電泳。時，停止電泳。 9.9.凝膠板剝離凝膠板剝離與與染色染色：電泳結束后，撬開玻璃板，將凝膠板：電泳結束后，撬開玻璃板，將凝膠板做好標記后放在大培養(yǎng)皿內(nèi)，加入染色液，染色做好標記后放在大培養(yǎng)皿內(nèi)，加入染色液，染色1小時左右。小時左右。10.10.脫色：染色后的凝膠板用蒸餾水漂洗數(shù)次，再用脫色液脫脫色：染色后的凝膠板用蒸餾水漂洗數(shù)次，再用脫色液脫色，直到蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰。色，直到蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰。 剝膠時要小心剝膠時要小心, ,保持膠完好無損保持膠完好無損, ,染色要充分染色要充分.11.11.實驗結果分析實驗結果分析。分分子子生生物物學學2008實實驗驗五五. .分析計算分析計算繪制標準曲線

21、：繪制標準曲線： 按下式計算相對遷移率：按下式計算相對遷移率： 以每個蛋白標準的分子量對數(shù)對它的以每個蛋白標準的分子量對數(shù)對它的相對遷移率作圖得標準曲線，量出未相對遷移率作圖得標準曲線，量出未知蛋白的遷移率即可測出其分于量，知蛋白的遷移率即可測出其分于量，這樣的標難曲線只對同一塊凝膠上的這樣的標難曲線只對同一塊凝膠上的樣品的分子量測定才具有可靠性。樣品的分子量測定才具有可靠性。= 蛋白樣品距加樣端遷移距離（cm）溴酚藍區(qū)帶中心距加樣端距離（cm） 相對遷移率分分子子生生物物學學2008實實驗驗六六. .思考題思考題在不連續(xù)體系在不連續(xù)體系sds-pagesds-page中中, ,當分離膠加完當

22、分離膠加完后后, ,需在其上加一層水需在其上加一層水, ,為什么為什么? ?樣品溶解液中各種試劑的作用是什么樣品溶解液中各種試劑的作用是什么? ?在不連續(xù)體系在不連續(xù)體系sds-pagesds-page中中, ,分離膠與濃縮分離膠與濃縮膠中均含有膠中均含有temedtemed和和ap,ap,試述其作用試述其作用? ?分分子子生生物物學學2008實實驗驗注意事項注意事項丙烯酰胺具有中等毒性。常人每天允許的丙烯酰胺具有中等毒性。常人每天允許的最大暴露量不超過最大暴露量不超過0.5g/kg，皮膚接觸可，皮膚接觸可致中毒，癥狀為紅斑、脫皮、眩暈、動作致中毒，癥狀為紅斑、脫皮、眩暈、動作機能失調(diào)、四肢無力等。機能失調(diào)、四肢無力等。丙烯酰胺是神經(jīng)毒劑，可以透過皮膚丙烯酰胺是神經(jīng)毒劑，可以透過皮膚不要接觸皮膚，戴手套、口罩操作不要接觸皮膚，戴手套、口罩操作分分子子生生物物學學2008實實驗驗沒有聚合的丙烯酰胺不要傾倒到水源附近沒有聚合的丙烯酰胺不要傾倒到水源附近一定要催化充分，使之完全聚合一定要催化充分，使之完全聚合集中處理，實