實(shí)驗(yàn)三基因的PCR擴(kuò)增技術(shù)精選文檔

1、一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊弧?shí)驗(yàn)?zāi)康膙學(xué)習(xí)學(xué)習(xí)pcr反應(yīng)的基本原理與實(shí)驗(yàn)技術(shù)反應(yīng)的基本原理與實(shí)驗(yàn)技術(shù)v從從bcg基因組基因組dna中中pcr擴(kuò)增擴(kuò)增rv1791（pe19）基因）基因二、基本原理二、基本原理vpcr類似于類似于dna的天然復(fù)制過程。的天然復(fù)制過程。v將待擴(kuò)增的將待擴(kuò)增的dna片段與其兩側(cè)互補(bǔ)的兩段寡核苷酸片段與其兩側(cè)互補(bǔ)的兩段寡核苷酸引物，經(jīng)變性、退火和延伸若干個(gè)循環(huán)后，引物，經(jīng)變性、退火和延伸若干個(gè)循環(huán)后，dna擴(kuò)擴(kuò)增倍數(shù)可達(dá)增倍數(shù)可達(dá)2n倍。倍。 復(fù)溫 三、實(shí)驗(yàn)材料三、實(shí)驗(yàn)材料vbcg基因組基因組dnav10 pcr反應(yīng)緩沖液、反應(yīng)緩沖液、4 dntps、taq dna聚合酶、聚合酶、

2、模板模板dna、引物、引物 （p1、p2）、超純水）、超純水swvpcr反應(yīng)管、移液器、反應(yīng)管、移液器、 pcr儀、離心機(jī)儀、離心機(jī)四、實(shí)驗(yàn)步驟四、實(shí)驗(yàn)步驟v引物設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)v準(zhǔn)備準(zhǔn)備pcr反應(yīng)溶液反應(yīng)溶液vpcr擴(kuò)增反應(yīng)擴(kuò)增反應(yīng)v結(jié)果檢測(cè)結(jié)果檢測(cè)vrv1791-f： atgaattcaggaagacagcatgtcgttc（ecor i）vrv1791-r：vatctcgagtgttccccctctccttcagv（xhoi）（二）準(zhǔn)備（二）準(zhǔn)備pcr反應(yīng)溶液反應(yīng)溶液 10pcr反應(yīng)緩沖液反應(yīng)緩沖液 2.5l 4dntps 2.0l 引物引物p1 1l（10nm） 引物引物p2 1l 模板模

3、板dna 2l taq dna聚合酶聚合酶 0.2l 用無菌去離子水至用無菌去離子水至 25l 用手指輕彈用手指輕彈pcr反應(yīng)管管底部，使溶液混勻反應(yīng)管管底部，使溶液混勻 在臺(tái)式離心機(jī)中離心在臺(tái)式離心機(jī)中離心2秒以集中溶液于管底秒以集中溶液于管底 在在pcr儀中設(shè)計(jì)如下反應(yīng)程序：儀中設(shè)計(jì)如下反應(yīng)程序：94 c、5min；94 c、30sec，61 c、40sec，72 c、30sec，30個(gè)循環(huán)；個(gè)循環(huán)；72 c、5min（三）（三）pcr擴(kuò)增反應(yīng)擴(kuò)增反應(yīng)將已混勻的將已混勻的pcr反應(yīng)管置于反應(yīng)管置于pcr儀儀的反應(yīng)孔中，蓋好蓋子的反應(yīng)孔中，蓋好蓋子進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)完畢，將樣品取出進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)完畢，將樣品取出置于冰浴中待用置于冰浴中待用（四）結(jié)果檢測(cè)（四）結(jié)果檢測(cè) v本本pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物擴(kuò)增的產(chǎn)物dna片段長(zhǎng)度為片段長(zhǎng)度為300bp，適合于，適合于在在1.5%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測(cè)。從每個(gè)反應(yīng)管瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測(cè)。從每個(gè)反應(yīng)管中取中取5ul pcr產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)。產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)。 12345循環(huán)94 30s56.5 40s72 60s94 30s57.7 40s72 6094 30s58.6 40s72 60s94 30s59.9