攜帶綠色熒光蛋白人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建

1、13第18卷第1期2005年1月醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)JournalofMedicalPostgraduatesVol.18No.1Jan.2005論著攜帶綠色熒光蛋白人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建成俊1,史曉峰1,謝森2,唐禮功2,夏穗生1(11華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院器官移植研究所,湖北武漢430030;21廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院泌尿外科,湖北武漢430070)摘要:目的:構(gòu)建攜帶綠色熒光蛋白(GFP)人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子基因真核表達(dá)載體。方法:應(yīng)用RT2PCR方法擴(kuò)增人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子基因,與GFP真核表達(dá)載體連接,構(gòu)建帶有標(biāo)記基因和人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子基因的真核表達(dá)載體,并用限制性內(nèi)切酶酶切鑒定。結(jié)果:構(gòu)建的

2、新質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定和DNA測(cè)序,證實(shí)新質(zhì)粒的構(gòu)建成功。結(jié)論:應(yīng)用RT2PCR方法擴(kuò)增目的DNA片段,簡(jiǎn)單快捷;雙酶切定向克隆可以保證構(gòu)建一步到位,免去正反向重組體篩選的問(wèn)題。關(guān)鍵詞:轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子;綠色熒光蛋白;真核表達(dá);載體中圖分類號(hào):Q782文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):100828199(2005)0120013204Constructionofeukaryoticexpressionvectorcontaininggreenfluorescentproteinand1genehumantransforminggrowthfactor2CHENGJun1,SHIXiao2feng1,XIESen2

3、,TANGLi2gong2,XIASui2sheng1(11InstituteofOrganTransplantation,TongjiHospital,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,Hubei,China;21DepartmentofUrinarySurgery,WuhanGeneralHospitalofGuangzhouCommand,Wuhan430070,Hubei,China)Abstract:Objective:Toconstructaneukaryoticexpressionvectorcarringg

4、reenfluorescentproteinandhu2mantransforminggrowthfactor2forminggrowthfactor21gene.Methods:Humantrans1genewasamplifiedbyRT2PCR,linkagedwitheGFPeukaryoticexpressionvector,andthenidentifiedtherecombinantplasmidbyrestrictionenzyme.Results:Therecombinantplasmidcarriedhuman2TGF21andGFPgenebyrestrictionenz

5、ymecuttinganalysisandDNAsequenceanalysisweresucceeded.Conclusion:ItissimpletoamplifyaimgenebyRT2PCRinonestep.Theorientationclonecanassuretherecombinantinonestepandavoidscreeningobverse2inverserecombinant.Thenewkindofeukaryoticvectorcanserveasanewtoolandthemethodinthetransplantationarea.Keywords:Tran

6、sforminggrowthfactor2Greenfluorescentprotein;Eukaryoticexpression;Vector1;排斥反應(yīng)或耐受的發(fā)生。T細(xì)胞在移植免疫起主導(dǎo)作用,免疫抑制性細(xì)胞因子轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transform2inggrowthfactor21,TGF21)可抑制移植物的免疫損傷和耐受的形成1。此外,對(duì)供、受者間細(xì)胞遷移和0引言器官移植后會(huì)引起供受者間復(fù)雜的免疫應(yīng)答,包括供受者免疫(非免疫)細(xì)胞的活化、遷移,可導(dǎo)致收稿日期:2004204214;修訂日期:2004206204作者簡(jiǎn)介:成俊(19722),男,湖北道山人,醫(yī)學(xué)博士,從事器官移植專業(yè)。14醫(yī)

7、學(xué)研究生學(xué)報(bào)2005年1月第18卷增殖周期變化的研究,可有效了解供者免疫系統(tǒng)的變化,標(biāo)記特定的細(xì)胞有助于研究移植排斥和耐受。因此,我們構(gòu)建攜帶綠色熒光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子基因的真核表達(dá)載體,為器官移植的基因治療和標(biāo)記提供適合的載體系統(tǒng)。1材料和方法111材料和試劑DH5菌株購(gòu)于天為時(shí)代公司;BamH限制性內(nèi)切酶,HinD限制性內(nèi)切酶,T4DNA連接酶購(gòu)于寶生物公司(TakaraBiotechnologyCo.,Ltd);GFP表達(dá)載體由同濟(jì)醫(yī)院泌尿外科郭新醫(yī)師惠贈(zèng);RNA抽提試劑盒購(gòu)于上海華舜公司,RT2PCR試劑盒和PCR引物由上海生工

8、公司提供,其他均為國(guó)產(chǎn)試劑。112外周血單核細(xì)胞(PBMC)的收集和總RNA提取人抗凝血50ml,用淋巴細(xì)胞分離液梯度離心得到PBMC。采用酸性酚2硫氰酸胍2氯仿法提取細(xì)胞中的總RNA,異丙醇沉淀RNA,用去DEPC水溶解后紫外分光光度法定量,并于-70保存?zhèn)溆谩?13RT2PCR擴(kuò)增人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(hTGF21)cDNA根據(jù)文獻(xiàn)2和Genbank提供的mRNA序列設(shè)計(jì)引物,primer1為oligo(dT),primer2正鏈引物52TAAGCTTACACCAGCCCTGTTCG23,其5端添加HinD酶切位點(diǎn);primer3負(fù)鏈引物32ATTCCT2GTGGCACGGGGGATCCT25,

9、其5端添加BamH酶切位點(diǎn)。以primer1合成cDNA,primer2和primer3完成cDNA的擴(kuò)增。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng):取總RNA3.0g,按下列濃度體積加入反應(yīng)產(chǎn)物:10擴(kuò)增緩沖液2l、20mmol/L四種dNTP混合液、引物oligo(dT)0.5g、RNase抑制劑20U、50mmol/LMgCl2、200U/l反轉(zhuǎn)錄酶,加水至總體積20l。3760min、7010min滅活,置-20保存?zhèn)溆?。PCR擴(kuò)增:逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1l,正義、反義引物20mol/L,dNTP150mol/L,Taq聚合酶2U,MgCl21.5mmol/L,10PCR緩沖液2.5l,余量用雙蒸水補(bǔ)足25l。PCR擴(kuò)增條件

10、:941min、632min、723min,共34個(gè)循環(huán)。RT2PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分析。114目的片段和GFP真核表達(dá)載體雙酶切與新質(zhì)粒的構(gòu)建RT2PCR產(chǎn)物和GFP真核表達(dá)載體經(jīng)BamH和Hind雙酶切,1%瓊脂糖凝膠電泳,目的條帶1.2kbTGF21和4.7kbeGFP片段膠回收、純化,按TGF21與載體eGFP摩爾數(shù)101的比例,加入25l的連接反應(yīng)體系中,16連接過(guò)夜。取5l連接反應(yīng)產(chǎn)物與等體積的DH5感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)化后的DH5細(xì)胞接種于含卡那霉素(50mg/L)的LB平板中,37孵化過(guò)夜。115重組載體的篩選和鑒定選取上述LB平板中的單菌落接種于10ml含卡那霉素的L

11、B培養(yǎng)液搖菌過(guò)夜,采用SDS堿裂解法進(jìn)行質(zhì)粒的少量提取,經(jīng)BamH和Hind雙酶切,1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。酶切產(chǎn)物含約1.2kb和4.7kb片段條帶的即為陽(yáng)性重組體克隆,并對(duì)其進(jìn)行DNA人工測(cè)序,與Genbank提供的序列進(jìn)行分析比較。2結(jié)果211總RNA提取結(jié)果收集PBMC,應(yīng)用RNA抽提試劑盒一步法提取的RNA,其A260為1.771,A260/A280比值為1.884,RNA濃度為7.084g/l,總RNA純度高。212RT2PCR結(jié)果應(yīng)用設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的引物,RT2PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳,產(chǎn)生一約1.2kb的DNA片段(1173bp),見圖1。圖1反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增人T

12、GF21基因結(jié)果Figure1ResultsofamplificationhumanTGF21byRT2PCR第1、3泳道為DNA標(biāo)記物;第2、4泳道為RT2PCR產(chǎn)物213TGF212eGFPDNA重組克隆的鑒定TGF21DNA和eGFP載體連接后,經(jīng)卡那霉素篩選的陽(yáng)性菌落,與等濃度的eGFP載體、空載體比較,其轉(zhuǎn)化效率為5%。取10個(gè)單菌落進(jìn)行質(zhì)粒抽提,酶切電泳分析,有兩個(gè)克隆菌落經(jīng)BamH和Hind雙酶切后產(chǎn)生1.2kb和約4.7kb的條帶(圖2)。第1期成俊,等攜帶綠色熒光蛋白人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建15圖2雙酶切鑒定重組克隆TGF212cGFPDNAFigure2Eval

13、uationofrecombinationcloneplasmidbyrestrictionendonucleasedoubledigestion第8泳道為1kbDNA,第3泳道可見約1.2kb和4.7kb的條帶,第7泳道為eGFP空載體質(zhì)粒重組克隆DNA序列的測(cè)定結(jié)果與Genbank提供的序列是一致的,均為正向連接。重組質(zhì)粒中hu2man2TGF21測(cè)序結(jié)果如下:3討論人TGF21基因編碼是一個(gè)含390個(gè)氨基酸的多肽分子,相對(duì)分子質(zhì)量為44341。TGF21在第278個(gè)氨基酸位置斷開形成二聚體,碳端形成一個(gè)112114個(gè)氨基酸的單體。在哺乳動(dòng)物中TGF21高度保守,為重要的看家基因,不同哺乳

14、動(dòng)物TGF21基因序列幾乎100%相同。人和鼠TGF21蛋白的不同僅差一個(gè)氨基酸。TGF21通過(guò)細(xì)胞膜絲氨酸/蘇氨酸激酶受體傳導(dǎo)信號(hào),在細(xì)胞分化中起重要的調(diào)節(jié)作用,在器官移植領(lǐng)域有重要作用和功能。在多種類型細(xì)胞(上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞)中,TGF21的中心作用是抑制細(xì)胞增殖4。在細(xì)胞周期中TGF21抑制細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期和G2期進(jìn)入M期,其機(jī)制主要是誘導(dǎo)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin2dependentkinases,CDK)抑制劑的產(chǎn)生,從而抑制CDK活化,使細(xì)胞正常周期受阻5。有研究表明,TGF21可誘導(dǎo)增強(qiáng)Kipp15INK4B、p16、p21waf1/Cip1、

15、p27kip1基因的表達(dá);下調(diào)c2myc、cyclineA、cyclineD1、cyclineE、cdk2、cdk4和cdc25A基因的表達(dá)6,阻止細(xì)胞進(jìn)入S期和M期。因此,TGF21是誘導(dǎo)耐受、下調(diào)宿主免疫應(yīng)答的一種重要細(xì)胞因子。GFP產(chǎn)生熒光無(wú)需任何底物或輔助因子,并可耐受光漂白及甲醛固定。較傳統(tǒng)的報(bào)告基因如b2半乳糖苷酶(Lacz)等有明顯的優(yōu)越性7。在器官移植領(lǐng)域中利用報(bào)告基因可動(dòng)態(tài)觀察不同來(lái)源的細(xì)胞(供者、受者或第三方)動(dòng)力學(xué)和周期變化,細(xì)胞功能的改變。因此,構(gòu)建同時(shí)帶TGF21和eGFP基因的真核表達(dá)載體可同時(shí)起治療(干預(yù))和標(biāo)記的功能。重組質(zhì)粒表達(dá)融合蛋白,既避免了動(dòng)物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

16、過(guò)程不同質(zhì)粒反復(fù)轉(zhuǎn)導(dǎo)的麻煩和不便,又滿足了研究的需求和方便。在構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí),我們充分利用定向克隆的優(yōu)勢(shì),在分析TGF21全長(zhǎng)序列和eGFP載體圖譜的基礎(chǔ)上,在PCR引物上分別引入BamH(G2GATCC)和HinD(A2AGCTT)酶切位點(diǎn)。該兩種內(nèi)切酶酶切產(chǎn)生不同的3凸出末端,使目的基因和載體實(shí)現(xiàn)定向連接克隆,這種方法的優(yōu)點(diǎn)有:外源DNA只以一個(gè)方向插入至重組質(zhì)粒中,減少了正、反向連接的篩選問(wèn)題;由于載體的兩個(gè)突出末端不互補(bǔ),因而載體片段不能環(huán)化,假陽(yáng)性重組克隆少,多數(shù)為含目的基因的克隆轉(zhuǎn)化菌;目的基因和載體連接處的限制性酶切位點(diǎn)常得以保留,便于進(jìn)一步鑒定8。此外,在連接時(shí),我們按TGF2

17、1與載體eGFP摩爾數(shù)101的比例進(jìn)行連接,進(jìn)一步減少載體自身環(huán)化的可能。構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定和序列分析,證實(shí)TGF21序列和方向的正確,為下一步TGF21在器官移植中的治療作用和對(duì)細(xì)胞影響的研究奠定了基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn):1QinL,ChavinKD,DingYetal.Genetransferfortransplantation:prolongationofallograftsurvivalwithtransforminggrowthfactor21J.16AnnSurg,1994,220(4):5082519.2醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)2005年1月第18卷cellcyclearrestJ.Gene

18、sDev,1994,8(1):9222.6DerynckR,JarrettJA,ChenEYetal.Humantransforminggrowthfactor2betacomplementaryDNAsequenceandexpressioninnormalandtransformedcellsJ.Nature,1985,316:7012705.RavitzMJ,WennerCE.Cyclin2dependentkinaseregulationduringG1phaseandcellcycleregulationbyTGF2b1J.AdvCancerRes,1997,71:1652207.3

19、4BarnardJA,LyonsRM,MosesHL.ThecellbiologyoftransforminggrowthfactorJ.BiochemBiophysActa,1990,1032(1):79287.7MisteliT,SpectorDL.ApplicationofthegreenfluorescentproteinincellbiologyandbiotechnologyJ.NatBiotechnol,1997,15(10):9612964.SpornMB,RobertsAB.Transforminggrowthfactor2beta:Recentprogressandnewc

20、hallengesJ.JCellBiol,1992,119(5):101721021.8黃培堂,王嘉璽,米厚礎(chǔ)等譯.JoeS,DavidR編.分子克隆試驗(yàn)指南M.第三版.北京:科學(xué)出版社,2002.8.5PolyakK,KatoJY,SolomonMJetal.p27Kip1,acyclin2Cdkin2hibitor,linkstransforminggrowthfactor2betaandcontactinhibitionto(責(zé)任編輯:魯立;英文編輯:吳世寬)(上接第12頁(yè))法采用引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)或SOE、SDL拼接,不僅操作繁雜,而且有時(shí)還會(huì)影響解讀三聯(lián)密碼的正確性。我們以非分泌型

21、內(nèi)皮抑素質(zhì)粒為模板,合成含信號(hào)肽的加長(zhǎng)肽鏈(96bp)作為上游引物,用PCR的方法構(gòu)建人分泌型內(nèi)皮抑素質(zhì)粒,所獲645bp的內(nèi)皮抑素基因片段,經(jīng)與GenBank中人膠原cDNA和內(nèi)皮抑素基因比較,基因序列基本一致。所克隆的內(nèi)皮抑素基因序列的第537位氨基酸編碼堿基由圖3內(nèi)皮抑素基因測(cè)序結(jié)果Figure3SequencingofsecretivehumanendostatingeneG突變?yōu)锳,但編碼的氨基酸都是精氨酸,屬于沉默方框內(nèi)為突變堿基突變型,不影響后續(xù)表達(dá)。本研究為應(yīng)用人內(nèi)皮抑素基因治療腫瘤奠定了初步實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn):3討論1OReillyMS,BoehmT,ShingYetal.E

22、ndostatin:AnendogenousinhabitorofangiogenesisandtumorgrowthJ.Cell,1997,88(2):2772285.腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴于新生血管形成,抑制血管生成治療可能是限制腫瘤生長(zhǎng)和防止轉(zhuǎn)移的有效策略,已成為近年來(lái)腫瘤治療的研究熱點(diǎn)。內(nèi)皮抑素是一種強(qiáng)力內(nèi)源性血管生成抑制因子,但內(nèi)皮抑素蛋白本身不具有直接抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用,它的靶細(xì)胞是血管內(nèi)皮細(xì)胞,需要在表達(dá)后分泌至細(xì)胞外而發(fā)揮其抗血管生成活性。這就要求在內(nèi)皮抑素蛋白的N末端連接一個(gè)分泌信號(hào)肽,作用是介導(dǎo)分泌蛋白到達(dá)細(xì)胞外,且不影響分泌蛋白的活性。國(guó)外進(jìn)行表達(dá)所采用的分泌信號(hào)包括:與蛋白同源的分泌信號(hào);與宿主表達(dá)細(xì)胞同源的分泌信號(hào);機(jī)體內(nèi)高效表達(dá)的分泌蛋白的分泌信號(hào),如血清清蛋白和IgG的分泌信號(hào)5。本