逍遙散的抗抑郁研究畢業(yè)論文

1、 逍遙散的抗抑郁研究 摘要：探討逍遙散的抗抑郁作用，為其疏肝解郁功效及臨床應用提供藥理學參考。方法：采用小鼠的小鼠慢性溫和不可預知應激(cums)結(jié)合孤養(yǎng)抑郁模型的建立、小鼠體重測定 、糖水消耗量實驗 、小鼠自主活動測定、morris水迷宮等實驗觀察逍遙散的抗抑郁作用。關(guān)鍵詞 抗抑郁 抑郁癥是一種常見的精神疾病，近年來其發(fā)病率呈不斷上升趨勢，已成為全球性的主要精神衛(wèi)生問題之一，與其相關(guān)的治療藥物日益受到重視。逍遙散功用疏肝解郁、健脾養(yǎng)血，主治肝郁血虛脾弱之證，是調(diào)和肝脾的代表方藥。大量臨床資料顯示該方在精神科疾患治療中運用廣泛，特別是在抑郁癥的輔助治療中取得較好療效。已有報道顯示逍遙散可減少行

2、為絕望模型小鼠的不動時間，提高cums模型大鼠的糖水消耗量等，表現(xiàn)出抗抑郁效應。為進一步驗證其抗抑郁作用，本課題通過利用一系列輕、中等強度的不可預知刺激結(jié)合孤養(yǎng)方式對小鼠連續(xù)實施6周，造成cums結(jié)合孤養(yǎng)的小鼠抑郁模型，以小鼠體重變化、行為學指標和糖水消耗實驗來判定逍遙散的抗抑郁作用。糖水消耗量反映動物的獎賞反應程度，模型動物出現(xiàn)糖水飲用量下降的現(xiàn)象，稱之為快感缺失，是抑郁癥的核心癥狀。本次實驗結(jié)果表明：小鼠被施加慢性輕度不可預知應激結(jié)合孤養(yǎng)造模程序6周后，與空白組小鼠比較，其體重增長緩慢，小鼠的糖水飲用量明顯降低，陽性藥阿米替林給予后可逆轉(zhuǎn)上述變化。此外，實驗中采用morris水迷宮對模型小

3、鼠的空間學習記憶能力進行檢測，發(fā)現(xiàn)模型小鼠該能力明顯下降。morris水迷宮檢測的是動物的定向和搜索行為，能反應動物對陌生環(huán)境的學習和記憶能力。因此，可以認為cums結(jié)合孤養(yǎng)的造模方式不僅可干預小鼠的生長，降低小鼠的活動性、社會交往能力，使模型小鼠出現(xiàn)抑郁癥的核心癥狀-快感缺失，而且還能模擬臨床抑郁癥患者思維遲鈍、學習記憶能力下降的表現(xiàn)，表明本次實驗小鼠抑郁模型復制成功。模型動物在給予逍遙散治療后，逍遙散30、20gkg-1劑量組可不同程度逆轉(zhuǎn)上述變化，表明逍遙散具有抗抑郁作用。同時，研究采用小鼠自主活動實驗，檢測逍遙散在所試劑量下有無中樞興奮作用。實驗結(jié)果表明，逍遙散在所試劑量下對小鼠的自主

4、活動無影響，表明其無中樞興奮作用，進一步明確了該方在所試劑量下的抗抑郁作用。綜上，逍遙散不僅具有較好的抗抑郁作用，還可提高正常及抑郁模型小鼠空間學習記憶能力，其作用可能與影響單胺類遞質(zhì)及抗氧化、改善腦內(nèi)血液循環(huán)有關(guān)。1實驗材料1.1實驗藥品逍遙散水煎液：組成按照方劑學所載：柴胡9g，當歸9g 白芍9g，白術(shù)9g，茯苓9g，甘草4.5g，薄荷少許，生姜一塊。藥材均購自成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院老中醫(yī)門診部，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學中藥標本中心盧先明教授鑒定，柴胡為傘形科植物柴胡bupleurum chinense dc.的干燥根，當歸為傘形科植物當歸angelica sinensis (oliv.) die

5、ls.的干燥根，白芍為毛茛科植物芍藥paeonia lactiflora pall.的干燥根，茯苓為多孔菌科真菌茯苓poria cocos(schw.)wolf.的干燥菌核，白術(shù)為菊科植物白術(shù)atractylodes macrocephala koidz.的干燥根莖，甘草為豆科植物甘草glycyrrhiza uralensis fisch的干燥根及根莖，薄荷為唇形科植物薄荷menthae haplocalyx briq.的干燥地上部分。制備方法：按比例取以上藥材加8倍量水浸泡30min，加熱煮沸，文火煎煮1h，趁熱濾過；同法煎煮40min及30min；合并三次濾液，文火濃縮至含生藥1gml-1

6、和1.5gml-1，藥液4冰箱保存?zhèn)溆谩＜鍎┎捎酶咝б合嗌V法(中華人民共和國藥典2005年版)對其中的芍藥苷進行定量分析，制備滿足樣品含量范圍的標準曲線(見圖1)，計算樣品中芍藥苷的含量。結(jié)果表明：逍遙散1.5gml-1、1gml-1及0.5gml-1水煎液中分別含芍藥苷1.13mgml-1、0.75mgml-1和0.38mgml-1，色譜圖見圖2,3。fig1.standard cuve of peoniflorin9.991fig2.hplc chromatography of peoniflorin9.402fig3. hplc chromatography of xiaoyao po

7、wder decoction阿米替林：sigma公司，批號039k1600，臨用時用生理鹽水配成所需濃度溶液。1.2實驗試劑芍藥苷對照品：中國藥品生物制品檢定所，批號：110736-201026。0.9氯化鈉注射液：四川科倫藥業(yè)股份有限公司，批號b051030r苦味酸：臺山市眾城化工有限公司，批號20090701雀巢奶粉：批號20100412a1.3實驗動物及實驗場地icr小鼠，雄性，初始體重25-28g，四川省醫(yī)學科學院實驗動物研究所提供，合格證號：scxk（川）2008-24。實驗場地為國家中醫(yī)藥管理局成都中醫(yī)藥大學中藥藥理科研三級實驗室（no. tcm-03-043）。1.4實驗儀器po

8、star218高效液相色譜儀：美國瓦里安公司液相進樣針（25l）：美國hamilton companyvarian 325 uv/is檢測器：美國瓦里安公司mt-200 morris水迷宮視頻跟蹤系統(tǒng)：成都泰盟科技有限公司ba-200小鼠避暗儀：成都泰盟科技有限公司zz-6小鼠自主活動測定儀：成都泰盟科技有限公司101c-2型電熱鼓風干燥箱：上海實驗儀器廠有限公司 ld600-1型電子天平：沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司bs323s型電子天平：德國sartorious公司2 實驗方法2.1逍遙散抗抑郁作用研究2.1.1逍遙散對慢性溫和不可預知應激(cums)結(jié)合孤養(yǎng)抑郁模型動物的影響2.1.1.

9、1動物分組及給藥方法選取健康雄性icr小鼠，初始體重25-28g，適應性飼養(yǎng)1周，5只/籠，期間進行糖水訓練及開場實驗，于造模前1d采用morris水迷宮對小鼠進行學習記憶初篩(兩輪共8次)，以兩輪在1min內(nèi)找到平臺者為合格，否則予以淘汰。以上指標結(jié)合體重，隨機分為空白組，模型組，阿米替林組(10mgkg-1)與逍遙散高、中、低劑量組(30、20、10 gkg-1，分別為成人(70kg)臨床日用劑量的30、20、10倍)。除空白組5只/籠飼養(yǎng)外，其余各組均單籠飼養(yǎng)并實施造模程序。造模2周后開始給藥，藥物組灌胃給予相應藥液，模型組和空白組灌胃給予等體積蒸餾水，每天1次，連續(xù)4周。2.1.1.2

10、實驗方法2.1.1.2.1 小鼠慢性溫和不可預知應激(cums)結(jié)合孤養(yǎng)抑郁模型的建立實驗實施過程中，除空白組外，其余各組小鼠在6周內(nèi)每天以2-3次的頻率交替接受以下刺激：潮濕墊料(200ml水籠-1)、異物刺激、置于空籠、4冷刺激(冷水游泳)5min、45熱刺激5min(置于烘箱)、鼠籠450傾斜、1ma電刺激周期性噪音(10db)、明暗顛倒、禁食、禁水等。所有刺激隨機安排并盡量保證不在同一時間點進行，使小鼠不能預料刺激的發(fā)生。具體執(zhí)行安排見表1。tab1. protocol of chronic unpredictable mild stress 星期一星期二星期三星期四 星期五星期六星期

11、日1w10:30熱刺激17:00-22:00鼠籠傾斜 22:00-8:00潮濕墊料8:30-20:30禁食+合籠 22:39:00鼠籠傾斜10:00-次日6點明暗顛到10:00電刺激11:00-22:00沙子墊料10:00-12:004個明暗循環(huán)(30min/次)21:00熱刺激9:00冷刺激10:30-15:30潮濕墊料8:0022:00置空籠22:00次日16:00禁食禁水2w7:30電刺激18:00-21:00 6明暗循21:3011:00置于空籠.14:30冷刺激.18:30-9:00沙子墊料11:30熱刺激19:00-8:00鼠籠傾斜12:30-14:304個明暗循環(huán)7:00冷刺激1

12、3:00-15:00合籠 19:00-7:00潮濕墊料8:00-21:00沙子墊料 22:00-次日9:00鼠籠傾斜9:30電刺激22:00次日16:00禁食禁水3w11:00-22:潮濕墊22:15-10:15沙子墊料12:30電刺激21:00熱刺激7:00-20:00禁水.9:00-15:00合籠.21:00冷刺激8:00熱刺激12:30-22:30沙子墊料 22:30-18:30明暗顛倒(10h/10h)20:30電刺激 22:30-8:00鼠籠傾斜20:00-22:00 4個明暗循環(huán)9:30冷刺激。11:00-22:00置空籠22:00-16:00禁食、水4w9:30-12:00合籠2

13、0:30電刺激8:00-20:00置于空籠 20:30熱刺激 22:30-9:00沙子墊料9:00-21:00置空籠 22:008:30潮濕墊料10:00-22:00鼠籠傾斜禁水7:00-11:00 8個明暗循環(huán)13：00冷刺激 20:008:00禁食9:30-21:00潮濕墊料 22:00-10:00明暗顛倒18:30電刺激22:00-16:00禁食+禁水5w11:00-13:00明暗循環(huán)17:00-22:3籠傾斜+潮濕墊料7;00-19:00禁水 20:00-8:00明暗顛(12h/12h)9:00冷刺激6:30電刺激20:30-8:30鼠籠傾斜10:00-22:30沙子墊料7:00熱刺激

14、14:00冷刺激22:30-9:00置于空籠9;30-21:30潮濕墊料+合籠1h 22:00-9:00置空籠 16:30電刺激 22:00次日16:00禁食禁水6w10:00-22:00潮濕墊料7:00-19:00禁食21:30電刺激8:00熱刺激12:30-10:30鼠籠傾斜8:00-20:00禁食20:30-10:30明暗循環(huán) 10;30-10:00異物刺激12:30-22:30潮濕墊料9:30熱刺激12:00-22:00異物刺激8:30冷刺激14:00-15:00合籠21:30電刺激2.1.1.2.2 小鼠體重測定 分別在造模前1d，造模2、4和6周進行小鼠體重測定，計算小鼠體重增長數(shù)

15、（造模后體重-造模前體重，g）。2.1.1.2.3 糖水消耗量實驗 實驗前，在環(huán)境安靜的條件下訓練小鼠使其適應含糖飲水，2d/次，訓練3次，然后在造模前1d和造模后的每周星期一測定糖水飲用量：小鼠禁食禁水18h后，每只小鼠給予2個已稱重(初重，g)的喂水瓶(1瓶1蔗糖水,1瓶白水)，1h后，取走水瓶并稱量剩余液體重量(末重，g)，計算小鼠的糖水消耗量(初重-末重，g)。2.1.1.2.4 小鼠自主活動測定分別在造模前1d和造模結(jié)束后1d進行小鼠自主活動測定，在環(huán)境安靜的條件下將小鼠放入zz-6小鼠自主活動測定儀中，適應2min后觀察4min內(nèi)的活動次數(shù)。2.2逍遙散對小鼠學習記憶能力的影響2.

16、2.1實驗方法2.2.1.1morris水迷宮實驗方法morris水迷宮視頻跟蹤分析系統(tǒng)由水池、休息平臺、記錄裝置和分析軟件組成。水池外有固定參照物如門、窗，掛件等。實驗者每次試驗位置保持不變。水中加牛奶至不透明，水溫為22-24，水面高于休息平臺約1cm。將水池平均分為四個象限(ne，nw，se，sw)，平臺放于se象限中央。檢測時，將小鼠頭部及背部用苦味酸涂成黃色以做跟蹤分析。morris水迷宮測試程序主要包括定位航行試驗和空間探索試驗兩個部分：定位航行實驗(place navigation)：每天每鼠訓練4次。將小鼠分別從4個象限面向池壁輕輕放入池中，測其60s內(nèi)找到平臺所需的時間(即逃

17、避潛期,escape latency，el)。如在60s內(nèi)小鼠不能觸到平臺，則實驗者將其引上平臺并令其停留15s，記錄逃避潛伏期為60s，計算4次潛伏期的平均值作為每天的成績。以第3天訓練的成績作為小鼠的學習記憶成績?？臻g探索試驗(spacial probe test)：于第4天測定。撤除平臺，從原平臺象限對側(cè)池壁中點將小鼠放入水中，記錄60s內(nèi)小鼠首次穿越原平臺的時間、穿越原平臺的次數(shù)及原平臺象限游泳時間占總時間的百分比，以反映小鼠空間工作記憶能力。2.2.1.2逍遙散對抑郁模型小鼠空間學習記憶能力的影響采用morris水迷宮觀察逍遙散對抑郁模型小鼠空間學習記憶能力的影響。選取2.1.1項中

18、小鼠于造模完畢后進行，方法同2.2.2。3 結(jié)果與討論3.1逍遙散抗抑郁作用研究3.1.1逍遙散對慢性溫和不可預知應激（cums）結(jié)合孤養(yǎng)抑郁模型動物的影響3.1.1.1逍遙散對抑郁模型小鼠體重的影響結(jié)果見表2及圖4。結(jié)果表明：與空白組比較，模型小鼠體重增長數(shù)明顯減少(p0.05或p0.01)，灌胃給藥3周后，逍遙散各劑量組表現(xiàn)出一定提高模型小鼠體重增長的趨勢；在給藥4周后，逍遙散高劑量組(30gkg-1)小鼠體重增長已明顯高于模型組(p0.05)，中、低劑量(20、10gkg-1)均表現(xiàn)出一定提高趨勢。阿米替林(10mgkg-1)對模型小鼠體重增長無明顯作用。tab2. effect of

19、xiaoyao powder on weight increasing in cums model mice (s)groupmice(n)dose(gkg-1)weight increasing (g)week 2week 4week 6control10-5.641.72* 8.711.95*11.382.25*model10-4.081.494.562.136.463.13amitriptyline100.013.992.024.672.356.922.34xiaoyao powder10304.041.985.262.35 8.002.52*xiaoyao powder10204.11

20、1.645.061.277.182.24xiaoyao powder10104.022.155.432.027.361.86notes: compared with model group: *p0.05, *p0.01fig4. effect of xiaoyao powder on weight increasing in cums model mice3.1.1.2逍遙散對抑郁模型小鼠糖水消耗量的影響結(jié)果見表3和圖5。結(jié)果表明：與空白組比較，模型小鼠從造模第2周起，其糖水消耗量便持續(xù)減少（p0.05或p0.01），提示造模程序能引起小鼠的快感缺失。灌胃給藥3周后，阿米替林(10mgkg-

21、1)及逍遙散高劑量(30gkg-1)明顯提高模型組小鼠糖水消耗量(p0.05)，逍遙散中劑量(20gkg-1)表現(xiàn)出了一定提高趨勢。給藥4周后，除阿米替林，逍遙散高劑量組外，逍遙散中劑量(20gkg-1)也使模型小鼠糖水消耗量明顯升高（p0.05），低劑量(10gkg-1)僅有提高的趨勢。tab3. effect of xiaoyao powder on sweet water consumption in cums model mice (s)groupmice(n)dose(gkg-1)base lineweek 1week 2week 3week 4week 5week 6control

22、10-2.450.762.050.612.230.62*2.100.91*2.330.56*2.460.62*2.030.43*model10-2.390.781.630.521.260.921.210.811.510.551.480.491.090.57amitriptyline100.012.350.221.750.651.220.581.430.941.830.862.090.80*1.971.21*xys10302.411.061.780.511.260.941.480.421.760.642.070.54*1.740.62*xys10202.370.911.600.751.270.9

23、01.491.161.610.521.700.741.710.60*xys10102.430.611.730.721.240.741.130.361.400.741.360.801.390.54notes: compared with model group: *p0.05, *p0.01.xys means xiaoyao powder. fig5. effect of xiaoyao powder on sweet water consumption in cums model mice3.1.1.3逍遙散對抑郁模型小鼠自主活動的影響結(jié)果見表4結(jié)果表明：與空白組比較造模前后小鼠自主活動無顯

24、著性差異，表明逍遙散在所試劑量下對cums小鼠自主活動無明顯影響。tab4. effect of xiaoyao powder on locomotor activity in cums mice (s)groupmice(n)dose(gkg-1)number of moving /4minnumber of rearing/4minbase lineweek 6base lineweek 6control10-101.3016.9092.517.7754.5014.1757.801.77model10-106.6026.33104.809.6655.2015.6062.618.02amitriptyline100.0190.4018.6394.811.0257.4020.559.839.43xys1030102.1025.7496.403.0252.6010.0056.808.11xys102095.1023.6997.005.7259.5021.1056.673.21xys101096.0029.6188.258.6354.6012.9057.504.53綜上，逍遙散可緩解cums小鼠的體重增長緩慢，提高其運動能力及探索能力，并能拮抗cums小鼠的快感缺失，表現(xiàn)出良好的抗抑郁作用。同時，在其有效劑量下，不會影響小鼠自主活動。3.2