營養(yǎng)因子對(duì)鐵皮石斛幼苗生長的影響

1、基金項(xiàng)目:國家杰出青年科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30325047作者簡介:孟志霞,女,助理研究員,碩士 *通訊作者:郭順星,男,研究員,博士生導(dǎo)師 Te:l (01062829619 E-m ai:l sxguo2006ya -hoo .co 營養(yǎng)因子對(duì)鐵皮石斛幼苗生長的影響孟志霞,房慧勇,郭順星*,陳曉梅,肖培根(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院-中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)藥用植物研究所,北京100094摘要:目的 研究營養(yǎng)因子對(duì)鐵皮石斛(D endrobiu m cand i du m W all 1Ex L ind1幼苗生長的影響。方法 以鐵皮石斛幼苗為外植體,以培養(yǎng)一個(gè)周期后的生物量、分蘗數(shù)或生根數(shù)為指標(biāo),采用單因素實(shí)驗(yàn)

2、分別考察不同培養(yǎng)基、碳源種類、氮源總濃度及兩種形態(tài)氮素配比和活性炭添加量5組因子對(duì)幼苗生長的影響,對(duì)生物量的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用單因素方差分析和q 檢驗(yàn)。結(jié)果 在幼苗生長過程中,20%馬鈴薯汁可顯著促進(jìn)植株分蘗形成,1/2M S(大量元素減半+20%馬鈴薯汁是鐵皮石斛幼苗分蘗和生長的適宜培養(yǎng)基。除乳糖外,30g #L -1蔗糖和葡萄糖均適合幼苗生長,且對(duì)其生物量的影響無顯著差異。培養(yǎng)基中氮源濃度過高抑制幼苗的生長,氮源以30mm o l #L -1總氮量,NH +4/NO -3的比例為0B 3或1B 2較適宜幼苗生長。培養(yǎng)基中3g #L -1的活性炭可使試管苗每株生根數(shù)提高為對(duì)照的3126倍,使干重

3、顯著提高(P 0105,且生長健壯。結(jié)論 適宜的營養(yǎng)條件可使鐵皮石斛幼苗的分蘗增殖培養(yǎng)與生根壯苗培養(yǎng)在同一種培養(yǎng)基上一步完成。關(guān)鍵詞:營養(yǎng)因子;鐵皮石斛幼苗;培養(yǎng)基;碳源;氮源;活性炭;分蘗;生物量中圖分類號(hào):S567 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):1001-2494(200809-0665-04Effects of Nutritional Factors on t he Grow t h of D endrobiu m candi d u m SeedlingsM ENG Zh-i x i a ,F ANG H u-i yong ,GUO Shun -x i n g *,C HEN X iao

4、-m e,i X IAO Pe-i gen (Instit ute of M edicinal P lant D evel -opm ent ,Chinese A cade my of M edical Sciences and Pek ing Un i on M edical Colle ge ,B eijing 100094,Ch i naAB STRACT :OB J ECT I VET o i nvesti ga te the e ffects o f nutr i tiona l factors on t he gro w th o f D endrobiu m cand i du

5、m seed -li ng s 1M ETHODS D endrobiu m cand i du m seedli ngs were used as exp l ants ,t he si ng le factor desi gn w as app lied t o esti m ate t he effects o f var i ous fac t o rs i nclud i ng cu lt ure med i u m,ca rbon source ,n itrogen source and active carbon on the grow th o f D endrob i u m

6、 cand i du m seed lings ,w ith its b i omass ,till e r number or average roo t number as i ndex 1The data of b i om ass were analyzed w ith O ne -w ay ANOVA and q test 1RESULTS A s for seedli ng grow th ,20%potato juice si gn ifican tly promo ted the till er f o r m ati on o f the in v itro p l antl

7、 e ts ,the suitable cu lture m ed i u m for seed li ng to till er and gro w th w as 1/2M S (half o f m acro -e le m entssupple m ented w ith 20%potato j u i ce 1Carbon source test i ndicated no sign ifi cant difference i n t he b i omass and g row th of seedli ng s bet w een sucrose and glucose exce

8、pt l ac -tose 1N itrog en source results show ed that the s u itable n itrogen concentration f o r t he grow th w as 30mm o l #L -11the best ratio o f a mm o -n i u m to n itrate we re 0B 3o r 1B 2,wh ile ex cessi ve concentration o f n itrog en source inh i bited seedli ng g row th 1T he concentrat

9、i on o f acti v e ca rbon added i n the m ed i u m w as 3g #L -1,w hich not only i ncreased si gnificantly the dry we i ght of t h is p l ant(P 0105but also m ade the average nu mber o f roo ts per p lantlet i ncrease to 3126ti m es co m pari ng w it h the contro ,l furt her m ore t he p l antl e ts

10、 g rew hea lthy and strong 1CONCLU SI ON T iller propagati on ,roo ting and g row th -pro m oti ng o f D endrob i um cand i du m seedli ng s could be carried out in the sa m e med i u m under su itab l e nu tritiona l cond iti ons 1K EY W ORDS :nu tritiona l factors ;D endrobiu m cand i du m seedli

11、ngs ;cu lture m ediu m;carbon source ;n itrogen sou rce ;active ca rbon ;til-l e r ;b i om ass鐵皮石斛(D endrobiu m candidum W all 1Ex L i n d l 1是蘭科石斛屬多年生附生型草本植物,生于海拔21002500m 的林中樹上或林緣巖石上,并常與苔蘚植物伴生,在我國主要分布于廣西、云南、貴州等地1。鐵皮石斛是2005年版5中國藥典6收錄的3種石斛原植物之一2,是石斛藥材中最珍貴品種,具有滋陰清熱、養(yǎng)胃生津、潤肺止咳等功效3,它所含的多糖類成分具有增強(qiáng)人體免疫功能、防

12、癌抗癌、恢復(fù)嗓音等顯著功效1。由于大量采挖,近年來鐵皮石斛野生資源逐年減少并處于瀕危狀態(tài),已被國家列為重點(diǎn)保護(hù)的野生藥材品種。另外,由于鐵皮石斛人工栽培繁殖力低等緣故,使其產(chǎn)量與質(zhì)量的提高也受到較大限制。用組織培養(yǎng)的方法可以實(shí)現(xiàn)鐵皮石斛的工廠化生產(chǎn),有關(guān)這方面的研究國內(nèi)已有許多文獻(xiàn)發(fā)表4,但大多是在影響其種子萌發(fā)、原球莖生長及壯苗因素等方面取得了一定的進(jìn)展,并在簡化培養(yǎng)基及降低生產(chǎn)成本方面進(jìn)行了探索。但未見有以鐵皮石斛無菌幼苗為外植體進(jìn)行規(guī)?；瘮U(kuò)繁的報(bào)道。在試管苗階段,鐵皮石斛幼苗生長緩慢,制約了生產(chǎn)速度,加大了生產(chǎn)成本。本實(shí)驗(yàn)以鐵皮石斛幼苗為外植體,研究在其分蘗擴(kuò)繁過程中培養(yǎng)基種類、碳源、氮

13、源、不同形態(tài)氮素配比、活性炭等營養(yǎng)因子對(duì)其生長的影響,為鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供可行性依據(jù)。1材料與方法111材料無菌培養(yǎng)誘導(dǎo)莖節(jié)腋芽萌發(fā)和增殖獲得的完整小植株作為本實(shí)驗(yàn)的材料,接種時(shí)鐵皮石斛幼苗高約2c m、含12個(gè)節(jié)、34片葉、12條不定根。112方法11211培養(yǎng)基對(duì)幼苗生長和分蘗形成的影響實(shí)驗(yàn)共5種供試培養(yǎng)基,分別為培養(yǎng)基A:MS培養(yǎng)基;培養(yǎng)基B:M S培養(yǎng)基大量元素減半;培養(yǎng)基C:B5培養(yǎng)基;培養(yǎng)基D:67-V培養(yǎng)基;培養(yǎng)基E:M S培養(yǎng)基大量元素減半。除培養(yǎng)基E作對(duì)照不添加馬鈴薯汁以外,其余4種均添加20%馬鈴薯汁,5種培養(yǎng)基均加入蔗糖30g#L-1,瓊脂810g#L-1,p H51

14、8。觀察培養(yǎng)過程中幼苗在5種培養(yǎng)基上生長及分蘗情況。11212活性炭濃度對(duì)幼苗生長和根系形成的影響實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基為1/2M S(大量元素減半+20%馬鈴薯汁+30g#L-1蔗糖。以不添加活性炭為對(duì)照,質(zhì)量濃度分別為1,2,3,5g#L-1。11213碳源對(duì)幼苗生長的影響實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基為1/ 2M S(大量元素減半+20%馬鈴薯汁+2g#L-1活性炭,碳原分別采用蔗糖、葡萄糖和乳糖,質(zhì)量濃度均為30g#L-1。11214氮源濃度及配比對(duì)幼苗生長的影響實(shí)驗(yàn)5在去除KNO3與NH4NO3的1/2M S(大量元素減半+20%馬鈴薯汁+30g#L-1蔗糖+2g#L-1活性炭培養(yǎng)基上,添加(NH42SO4與KNO

15、3分別作為銨態(tài)氮和硝態(tài)氮供試的唯一氮源。方法一:固定銨態(tài)氮和硝態(tài)氮比例為1B2,調(diào)節(jié)總氮濃度分別為6,15, 30,60,90mm o l#L-1;方法二:在總氮濃度為30 mmo l#L-1水平下,調(diào)節(jié)銨態(tài)氮和硝態(tài)氮比例分別為0B3,1B2,1B1,2B1和3B0。11215培養(yǎng)條件和實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的測(cè)定以上4組實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)基均添加8g#L-1瓊脂,p H518。每個(gè)250mL錐形瓶裝固體培養(yǎng)基60mL,每瓶接種3株幼苗,接種量017019g,接種量間無顯著差異。各組每個(gè)處理重復(fù)6次。培養(yǎng)溫度(23?2e,光照強(qiáng)度15002000lx,光照時(shí)間1012h#d-1,所有處理組均于培養(yǎng)的第16周收獲,將

16、收獲的鐵皮石斛苗除去培養(yǎng)基,以瓶為單位稱量并記錄苗的鮮重,統(tǒng)計(jì)單株分蘗數(shù)(指在一個(gè)培養(yǎng)周期內(nèi)平均每轉(zhuǎn)接1株幼苗可形成的分蘗數(shù)、每株平均生根數(shù)和根的生長情況等。收獲的鐵皮石斛苗50e干燥恒重后,以瓶為單位稱量并記錄苗的干重,根據(jù)每瓶苗的鮮重和干重計(jì)算鐵皮石斛組培苗的折干率,各處理取平均值。11216統(tǒng)計(jì)學(xué)處理對(duì)鐵皮石斛的鮮重、干重和折干率進(jìn)行單因素方差分析,如果F檢驗(yàn)各均數(shù)間存在顯著或極顯著差異,再對(duì)各均數(shù)以q檢驗(yàn)(Ne w-m an-Keu ls檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較,結(jié)果以/均值?標(biāo)準(zhǔn)差0(x?s的形式表示6。2結(jié)果211不同培養(yǎng)基對(duì)鐵皮石斛幼苗分蘗和生長的影響在不同培養(yǎng)基上,鐵皮石斛幼苗(含12

17、條根的莖基部節(jié)處都可分蘗繁殖不斷生出新的植株成叢生長。培養(yǎng)至16周時(shí),各培養(yǎng)基中新分蘗的幼苗大多含46片葉、34個(gè)節(jié)、118315c m高、每株平均根數(shù)12條。從植株的生長勢(shì)來看,A和B培養(yǎng)基中幼苗長勢(shì)明顯好于其余3種培養(yǎng)基,植株葉色碧綠,生長健壯,根綠色或白色,B培養(yǎng)基中原接種幼苗平均每株可分蘗新植株7122株,是5種培養(yǎng)基中平均單株分蘗數(shù)最高的一種;C培養(yǎng)基上植株葉色綠,莖粗一般,根細(xì)、綠色;D培養(yǎng)基上植株葉色濃綠,莖較粗,根綠色;E培養(yǎng)基上植株色澤較深、葉墨綠色無光澤,生長一般,根綠色或白色。A、B、C和D4種培養(yǎng)基中原接種幼苗的單株分蘗數(shù)都高于E培養(yǎng)基,表明在培養(yǎng)基中添加20%馬鈴薯汁

18、可促進(jìn)幼苗的生長和分蘗形成,這從B和E培養(yǎng)基中單株分蘗數(shù)的比較也可以看出,添加馬鈴薯汁的1/2M S培養(yǎng)基是對(duì)照1/2MS培養(yǎng)基的2193倍。見表1。表1不同培養(yǎng)基對(duì)鐵皮石斛幼苗分蘗和生長的影響T ab11Effects o f d ifferent cu lture med i u m on t he tiller and gro w th of D1candidu m seedli ngsGroup Cult ure m edi umT ill er numberpe r pl antletP la nt he i g h t/c mRoo t nu m berPe r pl antlet

19、A M S41692103100193B1/2M S71222153151119C B541781182151119D67-V31581182151189E1/2M S(CK2146117-2131189212活性炭對(duì)鐵皮石斛幼苗生根和生長的影響活性炭在誘導(dǎo)某些植物生根方面具有非常明顯的作用7。幼苗根系的形成及根的生長與培養(yǎng)基中活性炭濃度密切相關(guān)。當(dāng)培養(yǎng)基中不添加活性炭時(shí),平均每株形成根數(shù)相對(duì)較少,不足1條。隨培養(yǎng)基中添加活性炭濃度的提高(15g#L-1,新分蘗植株平均每株生根數(shù)也相應(yīng)增加。當(dāng)活性炭濃度最高達(dá)5g#L-1時(shí),平均株根數(shù)最多為4149條,是對(duì)照組的5110倍,新生根數(shù)量雖多且粗壯

20、,但根生長較慢,平均根長只有約3c m,而其他3組處理中以2和3g#L-1濃度作用下幼苗的根生長最快,根長平均可達(dá)7c m。與對(duì)照組相比,活性炭的不同濃度對(duì)幼苗生物量的影響不同,培養(yǎng)基中5g#L-1的活性炭可極顯著提高組培苗的鮮重(P0101,提高了3113倍;可極顯著提高組培苗的干重(P0101,提高了3165倍。培養(yǎng)基中3g#L-1的活性炭可顯著提高組培苗的鮮重(P0105,提高了2149倍;可顯著提高組培苗的干重(P0105,提高了2137倍。5組處理之間對(duì)鐵皮石斛幼苗的折干率無顯著影響。見表2。表2活性炭對(duì)鐵皮石斛幼苗生根和生長的影響1n=6,x? sTab12E ffects o f

21、 acti ve carbon on t he roo ti ng and gro w th o f D1candi du m seedli ngs1n=6, x?sConcent rati on /g#L-1Fresh we i ght/g#f lask-1Dry wei ght/g#fl ask-1Dry wei ghtc oe ff ici en/%Root nu m berper pl antl et051181?0141001483?010*?012770188191714?0187601832?010*?0147111132101059?0192801919?010*?018132

22、1383121877?11411111145?01072181843?0187621875161198?11473211761?011312111304?110624149注:與對(duì)照組比較,1P0105,2P0101No t e:v s c ont ro l g ro up,1P0105,2P0101213不同碳源對(duì)鐵皮石斛幼苗生長的影響3種碳源對(duì)鐵皮石斛幼苗生物量的影響有極顯著差異(P0101(表3。多重比較結(jié)果表明,蔗糖和葡萄糖中生長的組培苗其鮮重和干重都極顯著高于乳糖(P0101,折干率都顯著低于乳糖(P 0105。蔗糖和葡萄糖兩者在生物量和折干率上均無顯著性差異,這表明,除乳糖外,蔗糖

23、和葡萄糖在濃度為30g#L-1時(shí)均適合組培苗生長。而乳糖中的組培苗在培養(yǎng)16周后纖細(xì)、矮小,葉片不舒展,根系不發(fā)達(dá),生長緩慢,平均僅增高約0176c m。葡萄糖中植株比較健壯、群體整齊,根綠色、較發(fā)達(dá),平均增高約315c m。蔗糖中植株健壯,生長速度最快,平均增高約416c m。表3不同碳源對(duì)鐵皮石斛幼苗生長的影響1n=6,x?sT ab13E ffects of d iffe rent carbon source on t he grow t h o f D1 candidum seed li ngs1n=6,x?sCa r bonsourceF resh w ei ght/g#fl ask

24、-1D ry wei ght/g#fl ask-1D ry w ei ghtCo effi c i ent/%G l ucose91050?11122101791?01038181876?017511Sucro se101059?01930101920?01052191081?117341La ct ose11955?0158701213?010*?11006注:與乳糖比較,1P0101N ote:co m pare d w it h t he l actose,1P1B21B12B1m3B0。當(dāng)培養(yǎng)基中氮源全部為硝態(tài)氮時(shí)(0B3,組培苗生長健壯,生物量增長最快,培養(yǎng)物中干物質(zhì)累積也較快,干重

25、達(dá)每瓶11006g;1B2時(shí)次之,干重達(dá)每瓶01871g;隨比值繼續(xù)加大即培養(yǎng)基中銨態(tài)氮比例增大硝態(tài)氮比例減少,組培苗的生長速度減慢;當(dāng)培養(yǎng)基中氮源全部為銨態(tài)氮時(shí)(3B0,組培苗生長受到明顯的抑制,表現(xiàn)為,原接種幼苗中有少量植株死亡,存活的幼苗中有部分植株未見明顯生長,植株分蘗數(shù)少,葉片容易黃化、脫落,根系不發(fā)達(dá)。方差分析和q檢驗(yàn)表明,在折干率上,3B0與1B2兩組間有極顯著差異(P 0101,0B3組比1B2組顯著提高了折干率(P 0105,提高1517%。以上結(jié)果表明,在培養(yǎng)基總氮量30mm o l#L-1的水平下,硝態(tài)氮(NO-3的相對(duì)含量高有利于組培苗生長,銨態(tài)氮(NH+4的相對(duì)含量高

26、抑制組培苗的生長。見表5。表5不同氮素比值對(duì)鐵皮石斛幼苗生長的影響1n=6,x?sTab15Effects o f different ratio o f NH+4to NO-3on t he gro w tho f D1cand i du m seed lings1n=6,x?sNH+4/NO-3F resh w ei ght/g#fl a sk-1Dry wei ght/g#fl ask-1Dry wei ghtcoe f f i cie nt/%T il ler num berper pla ntlet0B3111687?1145611006?0114381695?01466141841

27、B2111339?1173901871?010*?0167051171B181536?0194301731?010*?0189231612B181425?0175101770?0118191083?014812153B031554?0136701351?010*?0140722117注:與1B2比較,1P0105,2P0101No t e:vs1B2group,1P0105,2P01013討論在自然條件下,鐵皮石斛有性繁殖極為困難,主要靠根部無性分蘗繁殖不斷生出新的植株成叢生長,有時(shí)也從上部莖節(jié)處生根長出新植株1。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)自然條件下野生鐵皮石斛可分蘗繁殖的生長發(fā)育習(xí)性,在組織培養(yǎng)中以無菌的幼

28、小植株為外植體進(jìn)行分蘗擴(kuò)繁,并通過單因素實(shí)驗(yàn)分別從幾種營養(yǎng)因子中初步篩選出了適宜其生長、分蘗和生根的營養(yǎng)條件。在這些適宜的營養(yǎng)因子作用下,可在同一種培養(yǎng)基上,使鐵皮石斛幼苗的分蘗增殖與生根壯苗等過程一步完成,短期內(nèi)擴(kuò)繁出數(shù)倍生長健壯的完整植株。這與以往組培中常見的無性繁殖程序相比,在縮短繁殖周期的同時(shí)也降低了生產(chǎn)成本。另外,本實(shí)驗(yàn)只是研究了部分影響因子,有關(guān)其他因子對(duì)幼苗生長及對(duì)組培苗品質(zhì)的影響還有待深入研究。本實(shí)驗(yàn)的研究為鐵皮石斛的組織培養(yǎng)和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供了一種可參考的途徑。REFERENCE S1RAN M X1Dend robium(石斛M1Beiji ng:S ci en tifi c

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