營養(yǎng)因子對鐵皮石斛幼苗生長的影響

1、基金項目:國家杰出青年科學基金資助項目(30325047作者簡介:孟志霞,女,助理研究員,碩士 *通訊作者:郭順星,男,研究員,博士生導師 Te:l (01062829619 E-m ai:l sxguo2006ya -hoo .co 營養(yǎng)因子對鐵皮石斛幼苗生長的影響孟志霞,房慧勇,郭順星*,陳曉梅,肖培根(中國醫(yī)學科學院-中國協和醫(yī)科大學藥用植物研究所,北京100094摘要:目的 研究營養(yǎng)因子對鐵皮石斛(D endrobiu m cand i du m W all 1Ex L ind1幼苗生長的影響。方法 以鐵皮石斛幼苗為外植體,以培養(yǎng)一個周期后的生物量、分蘗數或生根數為指標,采用單因素實驗

2、分別考察不同培養(yǎng)基、碳源種類、氮源總濃度及兩種形態(tài)氮素配比和活性炭添加量5組因子對幼苗生長的影響,對生物量的統(tǒng)計學處理采用單因素方差分析和q 檢驗。結果 在幼苗生長過程中,20%馬鈴薯汁可顯著促進植株分蘗形成,1/2M S(大量元素減半+20%馬鈴薯汁是鐵皮石斛幼苗分蘗和生長的適宜培養(yǎng)基。除乳糖外,30g #L -1蔗糖和葡萄糖均適合幼苗生長,且對其生物量的影響無顯著差異。培養(yǎng)基中氮源濃度過高抑制幼苗的生長,氮源以30mm o l #L -1總氮量,NH +4/NO -3的比例為0B 3或1B 2較適宜幼苗生長。培養(yǎng)基中3g #L -1的活性炭可使試管苗每株生根數提高為對照的3126倍,使干重

3、顯著提高(P 0105,且生長健壯。結論 適宜的營養(yǎng)條件可使鐵皮石斛幼苗的分蘗增殖培養(yǎng)與生根壯苗培養(yǎng)在同一種培養(yǎng)基上一步完成。關鍵詞:營養(yǎng)因子;鐵皮石斛幼苗;培養(yǎng)基;碳源;氮源;活性炭;分蘗;生物量中圖分類號:S567 文獻標識碼:A 文章編號:1001-2494(200809-0665-04Effects of Nutritional Factors on t he Grow t h of D endrobiu m candi d u m SeedlingsM ENG Zh-i x i a ,F ANG H u-i yong ,GUO Shun -x i n g *,C HEN X iao

4、-m e,i X IAO Pe-i gen (Instit ute of M edicinal P lant D evel -opm ent ,Chinese A cade my of M edical Sciences and Pek ing Un i on M edical Colle ge ,B eijing 100094,Ch i naAB STRACT :OB J ECT I VET o i nvesti ga te the e ffects o f nutr i tiona l factors on t he gro w th o f D endrobiu m cand i du

5、m seed -li ng s 1M ETHODS D endrobiu m cand i du m seedli ngs were used as exp l ants ,t he si ng le factor desi gn w as app lied t o esti m ate t he effects o f var i ous fac t o rs i nclud i ng cu lt ure med i u m,ca rbon source ,n itrogen source and active carbon on the grow th o f D endrob i u m

6、 cand i du m seed lings ,w ith its b i omass ,till e r number or average roo t number as i ndex 1The data of b i om ass were analyzed w ith O ne -w ay ANOVA and q test 1RESULTS A s for seedli ng grow th ,20%potato juice si gn ifican tly promo ted the till er f o r m ati on o f the in v itro p l antl

7、 e ts ,the suitable cu lture m ed i u m for seed li ng to till er and gro w th w as 1/2M S (half o f m acro -e le m entssupple m ented w ith 20%potato j u i ce 1Carbon source test i ndicated no sign ifi cant difference i n t he b i omass and g row th of seedli ng s bet w een sucrose and glucose exce

8、pt l ac -tose 1N itrog en source results show ed that the s u itable n itrogen concentration f o r t he grow th w as 30mm o l #L -11the best ratio o f a mm o -n i u m to n itrate we re 0B 3o r 1B 2,wh ile ex cessi ve concentration o f n itrog en source inh i bited seedli ng g row th 1T he concentrat

9、i on o f acti v e ca rbon added i n the m ed i u m w as 3g #L -1,w hich not only i ncreased si gnificantly the dry we i ght of t h is p l ant(P 0105but also m ade the average nu mber o f roo ts per p lantlet i ncrease to 3126ti m es co m pari ng w it h the contro ,l furt her m ore t he p l antl e ts

10、 g rew hea lthy and strong 1CONCLU SI ON T iller propagati on ,roo ting and g row th -pro m oti ng o f D endrob i um cand i du m seedli ng s could be carried out in the sa m e med i u m under su itab l e nu tritiona l cond iti ons 1K EY W ORDS :nu tritiona l factors ;D endrobiu m cand i du m seedli

11、ngs ;cu lture m ediu m;carbon source ;n itrogen sou rce ;active ca rbon ;til-l e r ;b i om ass鐵皮石斛(D endrobiu m candidum W all 1Ex L i n d l 1是蘭科石斛屬多年生附生型草本植物,生于海拔21002500m 的林中樹上或林緣巖石上,并常與苔蘚植物伴生,在我國主要分布于廣西、云南、貴州等地1。鐵皮石斛是2005年版5中國藥典6收錄的3種石斛原植物之一2,是石斛藥材中最珍貴品種,具有滋陰清熱、養(yǎng)胃生津、潤肺止咳等功效3,它所含的多糖類成分具有增強人體免疫功能、防

12、癌抗癌、恢復嗓音等顯著功效1。由于大量采挖,近年來鐵皮石斛野生資源逐年減少并處于瀕危狀態(tài),已被國家列為重點保護的野生藥材品種。另外,由于鐵皮石斛人工栽培繁殖力低等緣故,使其產量與質量的提高也受到較大限制。用組織培養(yǎng)的方法可以實現鐵皮石斛的工廠化生產,有關這方面的研究國內已有許多文獻發(fā)表4,但大多是在影響其種子萌發(fā)、原球莖生長及壯苗因素等方面取得了一定的進展,并在簡化培養(yǎng)基及降低生產成本方面進行了探索。但未見有以鐵皮石斛無菌幼苗為外植體進行規(guī)模化擴繁的報道。在試管苗階段,鐵皮石斛幼苗生長緩慢,制約了生產速度,加大了生產成本。本實驗以鐵皮石斛幼苗為外植體,研究在其分蘗擴繁過程中培養(yǎng)基種類、碳源、氮

13、源、不同形態(tài)氮素配比、活性炭等營養(yǎng)因子對其生長的影響,為鐵皮石斛產業(yè)化生產提供可行性依據。1材料與方法111材料無菌培養(yǎng)誘導莖節(jié)腋芽萌發(fā)和增殖獲得的完整小植株作為本實驗的材料,接種時鐵皮石斛幼苗高約2c m、含12個節(jié)、34片葉、12條不定根。112方法11211培養(yǎng)基對幼苗生長和分蘗形成的影響實驗共5種供試培養(yǎng)基,分別為培養(yǎng)基A:MS培養(yǎng)基;培養(yǎng)基B:M S培養(yǎng)基大量元素減半;培養(yǎng)基C:B5培養(yǎng)基;培養(yǎng)基D:67-V培養(yǎng)基;培養(yǎng)基E:M S培養(yǎng)基大量元素減半。除培養(yǎng)基E作對照不添加馬鈴薯汁以外,其余4種均添加20%馬鈴薯汁,5種培養(yǎng)基均加入蔗糖30g#L-1,瓊脂810g#L-1,p H51

14、8。觀察培養(yǎng)過程中幼苗在5種培養(yǎng)基上生長及分蘗情況。11212活性炭濃度對幼苗生長和根系形成的影響實驗培養(yǎng)基為1/2M S(大量元素減半+20%馬鈴薯汁+30g#L-1蔗糖。以不添加活性炭為對照,質量濃度分別為1,2,3,5g#L-1。11213碳源對幼苗生長的影響實驗培養(yǎng)基為1/ 2M S(大量元素減半+20%馬鈴薯汁+2g#L-1活性炭,碳原分別采用蔗糖、葡萄糖和乳糖,質量濃度均為30g#L-1。11214氮源濃度及配比對幼苗生長的影響實驗5在去除KNO3與NH4NO3的1/2M S(大量元素減半+20%馬鈴薯汁+30g#L-1蔗糖+2g#L-1活性炭培養(yǎng)基上,添加(NH42SO4與KNO

15、3分別作為銨態(tài)氮和硝態(tài)氮供試的唯一氮源。方法一:固定銨態(tài)氮和硝態(tài)氮比例為1B2,調節(jié)總氮濃度分別為6,15, 30,60,90mm o l#L-1;方法二:在總氮濃度為30 mmo l#L-1水平下,調節(jié)銨態(tài)氮和硝態(tài)氮比例分別為0B3,1B2,1B1,2B1和3B0。11215培養(yǎng)條件和實驗指標的測定以上4組實驗中培養(yǎng)基均添加8g#L-1瓊脂,p H518。每個250mL錐形瓶裝固體培養(yǎng)基60mL,每瓶接種3株幼苗,接種量017019g,接種量間無顯著差異。各組每個處理重復6次。培養(yǎng)溫度(23?2e,光照強度15002000lx,光照時間1012h#d-1,所有處理組均于培養(yǎng)的第16周收獲,將

16、收獲的鐵皮石斛苗除去培養(yǎng)基,以瓶為單位稱量并記錄苗的鮮重,統(tǒng)計單株分蘗數(指在一個培養(yǎng)周期內平均每轉接1株幼苗可形成的分蘗數、每株平均生根數和根的生長情況等。收獲的鐵皮石斛苗50e干燥恒重后,以瓶為單位稱量并記錄苗的干重,根據每瓶苗的鮮重和干重計算鐵皮石斛組培苗的折干率,各處理取平均值。11216統(tǒng)計學處理對鐵皮石斛的鮮重、干重和折干率進行單因素方差分析,如果F檢驗各均數間存在顯著或極顯著差異,再對各均數以q檢驗(Ne w-m an-Keu ls檢驗進行多重比較,結果以/均值?標準差0(x?s的形式表示6。2結果211不同培養(yǎng)基對鐵皮石斛幼苗分蘗和生長的影響在不同培養(yǎng)基上,鐵皮石斛幼苗(含12

17、條根的莖基部節(jié)處都可分蘗繁殖不斷生出新的植株成叢生長。培養(yǎng)至16周時,各培養(yǎng)基中新分蘗的幼苗大多含46片葉、34個節(jié)、118315c m高、每株平均根數12條。從植株的生長勢來看,A和B培養(yǎng)基中幼苗長勢明顯好于其余3種培養(yǎng)基,植株葉色碧綠,生長健壯,根綠色或白色,B培養(yǎng)基中原接種幼苗平均每株可分蘗新植株7122株,是5種培養(yǎng)基中平均單株分蘗數最高的一種;C培養(yǎng)基上植株葉色綠,莖粗一般,根細、綠色;D培養(yǎng)基上植株葉色濃綠,莖較粗,根綠色;E培養(yǎng)基上植株色澤較深、葉墨綠色無光澤,生長一般,根綠色或白色。A、B、C和D4種培養(yǎng)基中原接種幼苗的單株分蘗數都高于E培養(yǎng)基,表明在培養(yǎng)基中添加20%馬鈴薯汁

18、可促進幼苗的生長和分蘗形成,這從B和E培養(yǎng)基中單株分蘗數的比較也可以看出,添加馬鈴薯汁的1/2M S培養(yǎng)基是對照1/2MS培養(yǎng)基的2193倍。見表1。表1不同培養(yǎng)基對鐵皮石斛幼苗分蘗和生長的影響T ab11Effects o f d ifferent cu lture med i u m on t he tiller and gro w th of D1candidu m seedli ngsGroup Cult ure m edi umT ill er numberpe r pl antletP la nt he i g h t/c mRoo t nu m berPe r pl antlet

19、A M S41692103100193B1/2M S71222153151119C B541781182151119D67-V31581182151189E1/2M S(CK2146117-2131189212活性炭對鐵皮石斛幼苗生根和生長的影響活性炭在誘導某些植物生根方面具有非常明顯的作用7。幼苗根系的形成及根的生長與培養(yǎng)基中活性炭濃度密切相關。當培養(yǎng)基中不添加活性炭時,平均每株形成根數相對較少,不足1條。隨培養(yǎng)基中添加活性炭濃度的提高(15g#L-1,新分蘗植株平均每株生根數也相應增加。當活性炭濃度最高達5g#L-1時,平均株根數最多為4149條,是對照組的5110倍,新生根數量雖多且粗壯

20、,但根生長較慢,平均根長只有約3c m,而其他3組處理中以2和3g#L-1濃度作用下幼苗的根生長最快,根長平均可達7c m。與對照組相比,活性炭的不同濃度對幼苗生物量的影響不同,培養(yǎng)基中5g#L-1的活性炭可極顯著提高組培苗的鮮重(P0101,提高了3113倍;可極顯著提高組培苗的干重(P0101,提高了3165倍。培養(yǎng)基中3g#L-1的活性炭可顯著提高組培苗的鮮重(P0105,提高了2149倍;可顯著提高組培苗的干重(P0105,提高了2137倍。5組處理之間對鐵皮石斛幼苗的折干率無顯著影響。見表2。表2活性炭對鐵皮石斛幼苗生根和生長的影響1n=6,x? sTab12E ffects o f

21、 acti ve carbon on t he roo ti ng and gro w th o f D1candi du m seedli ngs1n=6, x?sConcent rati on /g#L-1Fresh we i ght/g#f lask-1Dry wei ght/g#fl ask-1Dry wei ghtc oe ff ici en/%Root nu m berper pl antl et051181?0141001483?010*?012770188191714?0187601832?010*?0147111132101059?0192801919?010*?018132

22、1383121877?11411111145?01072181843?0187621875161198?11473211761?011312111304?110624149注:與對照組比較,1P0105,2P0101No t e:v s c ont ro l g ro up,1P0105,2P0101213不同碳源對鐵皮石斛幼苗生長的影響3種碳源對鐵皮石斛幼苗生物量的影響有極顯著差異(P0101(表3。多重比較結果表明,蔗糖和葡萄糖中生長的組培苗其鮮重和干重都極顯著高于乳糖(P0101,折干率都顯著低于乳糖(P 0105。蔗糖和葡萄糖兩者在生物量和折干率上均無顯著性差異,這表明,除乳糖外,蔗糖

23、和葡萄糖在濃度為30g#L-1時均適合組培苗生長。而乳糖中的組培苗在培養(yǎng)16周后纖細、矮小,葉片不舒展,根系不發(fā)達,生長緩慢,平均僅增高約0176c m。葡萄糖中植株比較健壯、群體整齊,根綠色、較發(fā)達,平均增高約315c m。蔗糖中植株健壯,生長速度最快,平均增高約416c m。表3不同碳源對鐵皮石斛幼苗生長的影響1n=6,x?sT ab13E ffects of d iffe rent carbon source on t he grow t h o f D1 candidum seed li ngs1n=6,x?sCa r bonsourceF resh w ei ght/g#fl ask

24、-1D ry wei ght/g#fl ask-1D ry w ei ghtCo effi c i ent/%G l ucose91050?11122101791?01038181876?017511Sucro se101059?01930101920?01052191081?117341La ct ose11955?0158701213?010*?11006注:與乳糖比較,1P0101N ote:co m pare d w it h t he l actose,1P1B21B12B1m3B0。當培養(yǎng)基中氮源全部為硝態(tài)氮時(0B3,組培苗生長健壯,生物量增長最快,培養(yǎng)物中干物質累積也較快,干重

25、達每瓶11006g;1B2時次之,干重達每瓶01871g;隨比值繼續(xù)加大即培養(yǎng)基中銨態(tài)氮比例增大硝態(tài)氮比例減少,組培苗的生長速度減慢;當培養(yǎng)基中氮源全部為銨態(tài)氮時(3B0,組培苗生長受到明顯的抑制,表現為,原接種幼苗中有少量植株死亡,存活的幼苗中有部分植株未見明顯生長,植株分蘗數少,葉片容易黃化、脫落,根系不發(fā)達。方差分析和q檢驗表明,在折干率上,3B0與1B2兩組間有極顯著差異(P 0101,0B3組比1B2組顯著提高了折干率(P 0105,提高1517%。以上結果表明,在培養(yǎng)基總氮量30mm o l#L-1的水平下,硝態(tài)氮(NO-3的相對含量高有利于組培苗生長,銨態(tài)氮(NH+4的相對含量高

26、抑制組培苗的生長。見表5。表5不同氮素比值對鐵皮石斛幼苗生長的影響1n=6,x?sTab15Effects o f different ratio o f NH+4to NO-3on t he gro w tho f D1cand i du m seed lings1n=6,x?sNH+4/NO-3F resh w ei ght/g#fl a sk-1Dry wei ght/g#fl ask-1Dry wei ghtcoe f f i cie nt/%T il ler num berper pla ntlet0B3111687?1145611006?0114381695?01466141841

27、B2111339?1173901871?010*?0167051171B181536?0194301731?010*?0189231612B181425?0175101770?0118191083?014812153B031554?0136701351?010*?0140722117注:與1B2比較,1P0105,2P0101No t e:vs1B2group,1P0105,2P01013討論在自然條件下,鐵皮石斛有性繁殖極為困難,主要靠根部無性分蘗繁殖不斷生出新的植株成叢生長,有時也從上部莖節(jié)處生根長出新植株1。本實驗根據自然條件下野生鐵皮石斛可分蘗繁殖的生長發(fā)育習性,在組織培養(yǎng)中以無菌的幼

28、小植株為外植體進行分蘗擴繁,并通過單因素實驗分別從幾種營養(yǎng)因子中初步篩選出了適宜其生長、分蘗和生根的營養(yǎng)條件。在這些適宜的營養(yǎng)因子作用下,可在同一種培養(yǎng)基上,使鐵皮石斛幼苗的分蘗增殖與生根壯苗等過程一步完成,短期內擴繁出數倍生長健壯的完整植株。這與以往組培中常見的無性繁殖程序相比,在縮短繁殖周期的同時也降低了生產成本。另外,本實驗只是研究了部分影響因子,有關其他因子對幼苗生長及對組培苗品質的影響還有待深入研究。本實驗的研究為鐵皮石斛的組織培養(yǎng)和產業(yè)化生產提供了一種可參考的途徑。REFERENCE S1RAN M X1Dend robium(石斛M1Beiji ng:S ci en tifi c

29、 andTechn i cal Docum en ts Pub lis h i ng H ouse,2002:1312Ch1P(2005Vol(中國藥典2005年版1一部S12005:62-6313XU H,WANG Z T,D I NG J Y,e t al1G eneral research aspect ofb i otechnology about m ed i cal Dendrob iiJ1Ch i n W il d P lant R e-sour(中國野生植物資源,2001,20(1:1-414Z HANG Q F,MAO B Z1S t ud ies on i ndustri

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31、n ol:Na tS ci(合肥工業(yè)大學學報:自然科學版,2004,27(1:53-5716Z HANG Q,ZHANG Q N1B iostatistics(生物統(tǒng)計學M1B eiji ng:Ch i na Agricu l turalUn i versit y Pub li cati on H ouse,200217LI U G L,L I ANG Z H,Z HU J1E ffects of acti vat ed charcoal onp l an t tiss ue cultures:a revi e wJ1J Ji ang su F orest S ci T e chnol(江蘇林業(yè)科技,2001,28(5:46-4818W U S P,ZHANG X J,W U C,et al1E ffects of d iffe