微生物原生質(zhì)體融合育種ppt課件

1、Your Logo微生物原生質(zhì)體交融育種微生物原生質(zhì)體交融育種姓名：付鳳根姓名：付鳳根一、概述一、概述原生質(zhì)體交融(protoplast fusion)是20世紀(jì)70年代開展起來的基因重組技術(shù)。原生質(zhì)體：細(xì)胞內(nèi)由原生質(zhì)組成的各種構(gòu)造統(tǒng)稱為原生質(zhì)體,包括細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)(包括各種細(xì)胞器、細(xì)胞骨架系統(tǒng)及胞基質(zhì))和細(xì)胞核等部分,原生質(zhì)體是由原生質(zhì)特化而來。植物細(xì)胞即細(xì)胞壁內(nèi)的原生質(zhì)部分;動(dòng)物細(xì)胞就是原生質(zhì)體。原生質(zhì)體交融：利用物理、化學(xué)或生物學(xué)方法，誘導(dǎo)遺傳特性不同的兩個(gè)親本原生質(zhì)體交融，經(jīng)染色體交換、重組而到達(dá)雜交的目的，經(jīng)挑選獲得集雙親優(yōu)良性狀于一體的穩(wěn)定交融子。大幅提高親本間的重組頻率擴(kuò)展重組的

2、親本范圍原生質(zhì)體交融時(shí)親本整套染色體參與交換、遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移和重組性狀較多，集中雙親優(yōu)良性狀時(shí)機(jī)更大。與常規(guī)雜交相比，原生質(zhì)體交融具有的優(yōu)勢(shì)：缺乏之處：原生質(zhì)體交融后DNA交換和重組隨機(jī)發(fā)生， 添加重組體分別挑選的難度。二、微生物原生質(zhì)體交融步驟與方法二、微生物原生質(zhì)體交融步驟與方法遺傳標(biāo)志親株挑選原生質(zhì)體制備原生質(zhì)體再生原生質(zhì)體交融異核體檢出重組體檢出和鑒定重組體的形狀、生理生化和遺傳分析根據(jù)交融的目的選擇適宜的直接親本。如今普通以為親本應(yīng)采器具有較大遺傳差別的近親菌株，重組后的新個(gè)體具有更大的雜種優(yōu)勢(shì)。作為原生質(zhì)體交融的二親本都應(yīng)該有一定的遺傳標(biāo)志，便于重組體的檢出。常用的遺傳標(biāo)志有：帶隱性

3、性狀的營(yíng)養(yǎng)缺陷、抗性標(biāo)志、熱致死、孢子顏色和菌落形狀等作為標(biāo)志。實(shí)踐運(yùn)用時(shí)終究采用哪各遺傳標(biāo)志，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)看_實(shí)定。1 1、親本及遺傳標(biāo)志的選擇、親本及遺傳標(biāo)志的選擇2、原生質(zhì)體制備、原生質(zhì)體制備原生質(zhì)體的分別搜集純化活性鑒定保管制備流程制備原生質(zhì)體，是原生質(zhì)體技術(shù)的前提和根底，但是不同微生物的細(xì)胞壁組成各不一樣，所以制備其原生質(zhì)體的最正確條件也存在著很大差別。早期人們?cè)角筮\(yùn)用研磨等機(jī)械方法和超聲波等物理方法來制備原生質(zhì)， 制備效果都不理想，目前人們主要運(yùn)用酶法來制備原生質(zhì)體。人們多傾向于運(yùn)用復(fù)合酶進(jìn)展處置，常用的酶有纖維素酶、蝸牛酶和幾丁質(zhì)酶等 不同微生物在制備原生質(zhì)體時(shí)所需酶和種類不同

4、， 而且所需酶量也存在著差別。適宜的酶濃度是影響原生質(zhì)體制備的重要要素， 酶濃度過大時(shí)，酶中往往含有對(duì)原生質(zhì)體有害的酶類( 如過氧化物酶、 核糖核酸酶等) ，隨著酶量的添加， 雜酶的濃度也會(huì)隨之添加， 當(dāng)?shù)竭_(dá)一定濃度時(shí)，必然會(huì)影響原生質(zhì)體的活性；酶濃度過大，易使菌體凝集， 難于原生質(zhì)體化；而且， 細(xì) 胞 脫 壁 太 徹 底 ， 必 然 降 低 原 生 質(zhì) 體 的 再 生 率 。2、原生質(zhì)體制備、原生質(zhì)體制備菌齡：在菌齡的選擇上， 多采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期或生長(zhǎng)中后期的菌， 這是由于， 菌體的不同生理形狀直接影響到細(xì)胞壁的構(gòu)造， 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)菌的細(xì)胞壁中膚聚糖含量最低， 細(xì)胞壁對(duì)酶的作用最敏感， 但是對(duì)

5、數(shù)生長(zhǎng)早期的菌相對(duì)較為脆弱，受酶的過度作用會(huì)影響原生質(zhì)體的再生率。酶解時(shí)間在原生質(zhì)體制備過程中也是一個(gè)非常重要的要素。原生質(zhì)體制備液的p H值， 也可以直接影響到原生質(zhì)體的制備。由于只需在最適p H值時(shí)， 酶的活性才最高， 酶促反響速率才最大 影響原生質(zhì)體構(gòu)成的要素：浸透壓穩(wěn)定劑：由于原生質(zhì)體對(duì)浸透壓非常敏感， 浸透壓穩(wěn)定劑對(duì)于原生質(zhì)體的制備起著重要作用。常用的浸透壓穩(wěn)定劑有KCl , NaCl , CaCl2 , Mg SO4， 等無機(jī)鹽和蔗糖、 甘露糖、 山梨醇等， 普通說來， 絲狀真菌以無機(jī)鹽作為穩(wěn)定劑比較適宜， 而酵母菌那么運(yùn)用糖或醇做穩(wěn)定劑比較好。 原生質(zhì)體再構(gòu)成有生活才干的菌絲稱為

6、再生 。不同微生物的原生質(zhì)體最適再生條件存在一定的差別 培育基：在再生培育基中會(huì)添加一些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì) 這些物質(zhì)能夠是作為細(xì)胞壁合成的前體物質(zhì) 也能夠經(jīng)過代謝轉(zhuǎn)化成細(xì)胞壁的前體物質(zhì)或起到促進(jìn)代謝 加速細(xì)胞壁合成的作用。菌齡：菌齡過短的菌絲經(jīng)酶解破壁構(gòu)成小原生質(zhì)體，有的細(xì)胞器不完全，營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)缺乏再生才干也較低；菌齡長(zhǎng)的原生質(zhì)體再生率高。Ca2+：Ca2+主要是經(jīng)過維系膜構(gòu)造的完好性來實(shí)現(xiàn)原生質(zhì)體的穩(wěn)定性與活性。3、原生質(zhì)體再生、原生質(zhì)體再生原生質(zhì)體懸浮液未酶解的細(xì)菌無菌水稀釋高滲溶液稀釋高滲溶液稀釋培育培育培育計(jì)數(shù)再生率%=再生培育基上總菌落數(shù)酶處置后未原生質(zhì)體化菌落數(shù)原生質(zhì)體數(shù)100%總菌落數(shù)(A)

7、未原生質(zhì)化細(xì)胞B)再生菌落(C)=CBAB100%再生率及其計(jì)算再生率及其計(jì)算 所謂原生質(zhì)體交融， 就是將雙親株的微生物細(xì)胞分別經(jīng)過酶解脫壁， 使之構(gòu)成原生質(zhì)體， 然后在高滲的條件下混合， 并加人物理的或者化學(xué)的或者生物的助融條件， 使雙親株的原生質(zhì)體間發(fā)生相互凝集， 經(jīng)過細(xì)胞質(zhì)交融， 核交融， 而后發(fā)生基因組間的交換重組， 進(jìn)而可以在適宜的條件下再生出微生物的細(xì)胞壁來， 從而獲得重組子的過程。4、原生質(zhì)體交融、原生質(zhì)體交融聚乙二醇是乙二醇的多聚化合物，存在一系列不同分子量的多聚體。PEG 分子中常有醚鍵，使其顯示出弱的負(fù)電荷，可與水、蛋白質(zhì)、糖類分子的正電基團(tuán)構(gòu)成氫鍵，而使原生質(zhì)體連在一同發(fā)

8、生凝集，這種作用還可以由于Ca + 的存在而加強(qiáng)。為了發(fā)揚(yáng)PEG 促進(jìn)細(xì)胞交融的效能，必需采用較高的濃度 ( 40 5 0%，分子量為6 0 0 0 )，但PEG 在高濃度下，細(xì)胞能夠因脫水而遭到顯著的破壞。因此，選擇適宜的分子量、濃度及作用時(shí)間是P E G交融技術(shù)的關(guān)鍵。PEG誘導(dǎo)細(xì)胞交融由于具有容易制備和控制、 活性穩(wěn)定、 運(yùn)用方便等特點(diǎn)，在細(xì)胞交融領(lǐng)域獲得了可喜的成果，大量的研討仍采用此法。雖然PE G 作為交融劑有很多勝利的報(bào)道，但存在著對(duì)細(xì)胞損傷大、殘存有毒性、交融率較低及閱歷性大等缺陷。 近年來，一種物理交融技術(shù) 細(xì)胞電交融技術(shù)迅速崛起并顯示出強(qiáng)大的生命力。PEG交融法交融法從野生

9、型或突變型菌株中選擇兩親本搜集菌體，酶解，獲取原生質(zhì)體以107108ml-1 的濃度混合參與30%50%PEG及適量的CaCl2、MgCl2維持在一定pH值的浸透壓穩(wěn)定劑中，適溫處置110min再生培育基稀釋45倍低速離心數(shù)分鐘除去上清液，搜集沉淀物0.1 mol/L CaCl2洗滌兩次用交融液懸浮制備的交融體原生質(zhì)融合過程原生質(zhì)體交融的影響要素原生質(zhì)體交融的影響要素JPEG濃度：PEG既是促融劑又是浸透壓穩(wěn)定劑，低濃度低分子量的PEG促融效果不好，也容易導(dǎo)致原生質(zhì)體破裂。但是高濃度的PEG會(huì)導(dǎo)致原生質(zhì)體收縮，降低交融頻率，而且過高濃度的PEG對(duì)原生質(zhì)體有毒害作用。普通為40%。J促融時(shí)間：促

10、融時(shí)間添加可以使原生質(zhì)體交融時(shí)機(jī)增多，但是，PEG對(duì)原生質(zhì)體有毒，為保證原生質(zhì)體的再生才干，促融時(shí)間不宜過長(zhǎng)。J無機(jī)離子：原生質(zhì)體交融過程中需求一定量的 Ca2+和Mg2+促進(jìn)交融， 而 K+、 Na+會(huì)顯著降低交融率， 交融時(shí)普通 Ca2 +0 . 01 mol / L、 Mg2+0 . 02 mol / L 為佳。各菌種間略有差別。 交融體中除重組體外，還有異核體或部分結(jié)合子、雜合二倍體或雜合系，這些都會(huì)在平板上構(gòu)成菌落，檢出交融體的方法有多種，在育種任務(wù)中可根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮臀⑸锏牟煌右赃x擇。利用營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)志選擇交融體利用抗藥性選擇交融體利用滅活原生質(zhì)體檢出交融體利用熒光染色法選擇交融

11、體雙親對(duì)碳源利用不同而檢出交融體利用形狀差別檢出5、交融體的檢出與分別、交融體的檢出與分別這是一種傳統(tǒng)而有效的選擇方法，其檢出原那么是：交融的雙親帶有不同的營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)志，在分別培育基上只需交融體生長(zhǎng)而不能讓雙親構(gòu)成的原生質(zhì)體構(gòu)成菌落。其原理是由于缺陷型的雙親由于喪失了合成某種物質(zhì)的才干，它們?cè)诨w培育基上不能生長(zhǎng)、繁衍，部分單親原生質(zhì)體的同源交融體也不能在基體培育基上構(gòu)成菌落，只需雙親原生質(zhì)體的交融體因營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)互補(bǔ)而構(gòu)成菌落。利用營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)志選擇交融體利用營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)志選擇交融體 熒光染色法是事先使雙親染色而攜帶不同熒光色素標(biāo)志，然后在顯微操作器和熒光顯微鏡下，挑取現(xiàn)時(shí)帶有雙親原生質(zhì)體熒光標(biāo)志的交融體，直接分別到再生培育基上再生，最后得到交融體。 詳細(xì)方法：制備原生質(zhì)體時(shí)，在酶解液中參與熒光色素，使雙親分別攜帶有不同的熒光標(biāo)志。它對(duì)原生質(zhì)體活力無影響，攜帶色素的原生質(zhì)體能正常進(jìn)展交融并具有再生才干。運(yùn)用這種方法時(shí)，兩種熒光染料的區(qū)分