關(guān)于“基因表達(dá)載體構(gòu)建”的教學(xué)思考

1、關(guān)于“基因表達(dá)載體構(gòu)建”的教學(xué)思考關(guān)于“基因表達(dá)載體構(gòu)建”的教學(xué)思考江蘇省南京市天印高級(jí)中學(xué) 倪同亮【摘 要】一個(gè)完整的基因表達(dá)載體上除了目的基因外，還必須有啟動(dòng)子、終止子及標(biāo)記基因等，如果目的基因自帶啟動(dòng)子，是不是就不需要加啟動(dòng)子呢？構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，用同一種限制酶酶切含目的基因的DNA片段和載體是不是最佳選擇？文章主要就這兩點(diǎn)進(jìn)行分析歸納，旨在提高課堂授課效率，提升學(xué)生的應(yīng)試能力。【關(guān)鍵詞】基因表達(dá)載體；限制酶；黏性末端；平末端；啟動(dòng)子；乳腺生物反應(yīng)器新課程實(shí)施已逾十年，伴隨著教與學(xué)、學(xué)與考，高中生物課程知識(shí)體系及高考的考察重點(diǎn)已趨于明朗化。如近幾年全國各地高考卷頻繁對(duì)選修“基因工程”這

2、一知識(shí)點(diǎn)進(jìn)行考察，尤其對(duì)“基因表達(dá)載體的構(gòu)建”這一核心步驟中所涉及的諸多問題的考查可謂層出不窮。本文從自身教學(xué)實(shí)踐出發(fā)，認(rèn)為應(yīng)強(qiáng)化以下兩點(diǎn)的教學(xué)：一、關(guān)于啟動(dòng)子的選擇構(gòu)建基因表達(dá)載體的目的是使目的基因能在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)，使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用，所以在一個(gè)完整的基因表達(dá)載體上除了目的基因外，還必須有啟動(dòng)子、終止子及標(biāo)記基因等。一個(gè)基因包含編碼區(qū)和非編碼區(qū)，啟動(dòng)子位于編碼區(qū)上游非編碼區(qū)序列，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終翻譯獲得所需要的蛋白質(zhì)。那么，啟動(dòng)子的選擇有要求嗎？我們知道獲取目的基因的方法有從基因組文庫中獲取、有

3、人工合成：如反轉(zhuǎn)錄法（cDNA文庫）、PCR、直接合成等。人工合成的目的基因往往不含啟動(dòng)子、終止子等，這就必須在構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)加入啟動(dòng)子，否則轉(zhuǎn)錄無法啟動(dòng)。問題是加入的一定是原目的基因中的啟動(dòng)子嗎？另外，如果是從基因組文庫中獲取的目的基因是含啟動(dòng)子的，那么，在構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，是不是就無需加入啟動(dòng)子呢？人教版選修三現(xiàn)代生物科技專題第21頁在講述動(dòng)物基因工程應(yīng)用前景時(shí)，提到用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)藥物。將藥物蛋白基因與乳腺蛋白基因的啟動(dòng)子等調(diào)控組件重組在一起，通過顯微注射等方法，導(dǎo)入哺乳動(dòng)物的受精卵中，將受精卵送入母體，使其發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物進(jìn)入泌乳期后，可以通過分泌乳汁生產(chǎn)所需要的藥品

4、，稱為乳腺生物反應(yīng)器。請(qǐng)注意：基因表達(dá)載體上的啟動(dòng)子并不是藥用蛋白基因自帶的啟動(dòng)子，而是乳腺蛋白基因的啟動(dòng)子，這也體現(xiàn)了有些啟動(dòng)子具有特異性，如乳腺蛋白基因的啟動(dòng)子只會(huì)在乳腺細(xì)胞中啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄，從而使得藥用蛋白基因能在乳腺細(xì)胞中成功特異性表達(dá)，以此從乳汁中獲得藥用蛋白。二、關(guān)于限制酶的選擇在構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，其核心是將目的基因與載體結(jié)合，而結(jié)合是否符合要求，限制酶的選擇至關(guān)重要。限制酶的作用是識(shí)別雙鏈DNA分子中特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。DNA經(jīng)限制酶酶切產(chǎn)生的DNA片段通常有兩種形式粘性末端和平末端。人教版選修教科書第11頁寫到用同一種限

5、制酶分別切割目的基因與載體，因?yàn)榍懈詈竽墚a(chǎn)生相同的黏性末端，末端之間能發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)而形成重組DNA分子，但此方法是最佳選擇嗎？ 結(jié)合近幾年高考試題和教學(xué)實(shí)踐，就限制酶選擇的優(yōu)缺點(diǎn)歸納如下：1.單酶切（用同一種限制酶酶切）的優(yōu)缺點(diǎn)。如教材所述，用同一種限制酶分別切割含目的基因的DNA片段與載體。這是最易操作的一種方法，含目的基因的DNA片段與載體在同種限制酶作用下會(huì)形成相同的黏性末端，這兩個(gè)黏性末端通過堿基間的互補(bǔ)配對(duì)而連接，進(jìn)而形成重組DNA分子，但存在著明顯的缺點(diǎn)：酶切后的載體與目的基因在DNA連接酶作用下會(huì)發(fā)生自身環(huán)化。原因是酶切后的目的基因和載體的兩端各有一個(gè)黏性末端，這兩個(gè)末端會(huì)發(fā)

6、生堿基互補(bǔ)配對(duì)而使目的基因和載體都會(huì)發(fā)生首尾相連，從而形成環(huán)狀DNA分子（載體載體連接和目的基因目的基因連接），甚至出現(xiàn)多個(gè)載體、多個(gè)目的基因連接而成的環(huán)狀DNA分子，這就加大了篩選的工作量。目的基因與載體的反向連接。目的基因的插入是要有正確的方向才能正確表達(dá)（轉(zhuǎn)錄），如果載體和目的基因的酶切使用的是同一種限制酶，那么，目的基因的插入有兩種可能：一種是目的基因的最前端剛好插在啟動(dòng)子下游，這樣可以正確表達(dá)；另一種剛好相反，目的基因的末端插在啟動(dòng)子的下游（目的基因旋轉(zhuǎn)180度），目的基因則無法表達(dá)或表達(dá)錯(cuò)誤。這兩種重組DNA分子，其中只有一種是我們所需要的，同樣也加大了篩選的工作量。2.多酶切（用

7、兩種或兩種以上的限制酶酶切）的優(yōu)缺點(diǎn)。用兩種或兩種以上的限制酶去切割含目的基因的DNA片段和載體，較常見的是用同一組兩種限制酶去切割含目的基因的DNA片段和載體，兩者都會(huì)產(chǎn)生具有兩種不同的黏性末端的DNA片段，黏性末端間通過堿基互補(bǔ)配對(duì)從而形成重組DNA分子。多酶切的優(yōu)點(diǎn)是可以克服單酶切的兩大缺點(diǎn)：一是多酶切后目的基因與載體的兩側(cè)的黏性末端不相同，因此不會(huì)發(fā)生自身環(huán)化（載體載體連接和目的基因目的基因連接）現(xiàn)象。二是可實(shí)現(xiàn)目的基因與載體的定向連接。如緊靠啟動(dòng)子下游的是EcoR位點(diǎn)（GAATTC），而BamH1位點(diǎn)（GGATTC）在后面；目的基因的前端是EcoR位點(diǎn)，末端是BamH1位點(diǎn)，酶切之后

8、插進(jìn)去，就可以保證目的基因的前端剛好插到緊靠著啟動(dòng)子的下游，且只產(chǎn)生一種重組DNA，目的基因?qū)崿F(xiàn)定向插入，這樣就可以正確表達(dá)。當(dāng)然，多種酶酶切的缺點(diǎn)同樣存在，用多種酶切割，由于每種限制酶的最適作用條件往往不同（如最適溫度、pH值等），所以一般不能將兩種酶放在同一環(huán)境中使用，而是要進(jìn)行兩次操作，需更換培養(yǎng)液，以保證酶的高效性。因此，使用多酶切的方法在實(shí)際操作中較單酶切要復(fù)雜得多。3.慎重選擇切割出平末端的限制酶。如果備選的限制酶酶切產(chǎn)生的末端是平末端，則可用相同或不同的限制酶分別切割含目的基因的DNA片段和載體，因?yàn)榧词故莾蓚€(gè)不同的平末端，在DNA連接酶的作用下也可以任意連接。此方法的優(yōu)點(diǎn)不需要含目的基因的DNA片段和載體具有相同的限制酶識(shí)別序列，減少了對(duì)載體的挑選和改造的工作量。但在實(shí)踐中，極少用平末端，因?yàn)槠侥┒说倪B接效率比較低，且也會(huì)出現(xiàn)目的基因目的基因、載體載體的自身環(huán)化現(xiàn)象及目的基因和載體的反向連接現(xiàn)象。一般只有在找不到合適切成黏性末端的酶切位點(diǎn)而有平末端切口的情況下才使用。教師的教學(xué)是一個(gè)不斷積累的過程，積累來自于自身的學(xué)習(xí)、來自于高考試題的感悟、來自于學(xué)生課堂的質(zhì)疑我們不可一成不變地照本宣書，而應(yīng)該做一個(gè)發(fā)現(xiàn)者、改革者，只有這樣才能符合學(xué)生的認(rèn)知規(guī)律，才能拓展學(xué)生的思維空間，才能提升學(xué)生的綜合素養(yǎng)。參考文獻(xiàn)：1朱正威，趙占良。普通高中課