生物顯微技術切片的制作

1、石蠟切片的過程石蠟切片的過程v動物的處死動物的處死v動物組織取材動物組織取材v固定固定v組織固定后的處理組織固定后的處理v脫水和透明脫水和透明v包埋包埋v切片切片一、動物的處死一、動物的處死v麻醉麻醉v空氣栓塞空氣栓塞v頸椎脫臼或斷頭頸椎脫臼或斷頭v股動脈放血股動脈放血二、動物組織取材二、動物組織取材v動物組織取材原則：動物組織取材原則：盡量保持組織的生活狀態(tài)。盡量保持組織的生活狀態(tài)。v動作要快動作要快v不要過度用力夾捏組織，不要過度用力夾捏組織，防止組織變形。防止組織變形。三、固定三、固定v1、目的：、目的：盡量保持組織的生前狀態(tài)，防止組織的死后變盡量保持組織的生前狀態(tài)，防止組織的死后變化、

2、自溶?；?、自溶。保持細胞和組織原有的形態(tài)結構，保持細胞和組織原有的形態(tài)結構，保持組織內(nèi)部成分特征不發(fā)生變化。保持組織內(nèi)部成分特征不發(fā)生變化。v2、方式：浸入式、方式：浸入式 灌注式灌注式灌注式灌注式v此法適用于動物實驗研究。自左心室插入主此法適用于動物實驗研究。自左心室插入主動脈，先以生理鹽水沖冼血液后，以泵、吊動脈，先以生理鹽水沖冼血液后，以泵、吊筒或筒或50-100ml注射器注入固定液。然后取材，注射器注入固定液。然后取材，投入固定液。投入固定液。v灌注法固定可使固定液迅速達到全身各組織。灌注法固定可使固定液迅速達到全身各組織。達到充分固定之目的。達到充分固定之目的。3、固定液、固定液v醛

3、類固定劑醛類固定劑v非醛類固定劑非醛類固定劑v丙酮及醇類固定劑丙酮及醇類固定劑醛類固定劑醛類固定劑v雙功能交聯(lián)劑，其作用是使組織之間相互交聯(lián)。雙功能交聯(lián)劑，其作用是使組織之間相互交聯(lián)。v包括：甲醛、多聚甲醛、戊二醛包括：甲醛、多聚甲醛、戊二醛v通常與其他的試劑聯(lián)合使用通常與其他的試劑聯(lián)合使用v優(yōu)點是對組織穿透性強，收縮性小。可以保存優(yōu)點是對組織穿透性強，收縮性小?？梢员４娴鞍踪|(zhì)、脂肪、黏液物質(zhì)以及一定量的糖原。蛋白質(zhì)、脂肪、黏液物質(zhì)以及一定量的糖原。v缺點：長期固定使組織過度硬化及細胞核不著缺點：長期固定使組織過度硬化及細胞核不著色，并且產(chǎn)生色，并且產(chǎn)生“福爾馬林色素福爾馬林色素”，它是由于血

4、，它是由于血紅蛋白與甲醛轉化的酸形成正鐵血紅素。紅蛋白與甲醛轉化的酸形成正鐵血紅素。非醛類固定劑非醛類固定劑v氯化汞（氯化汞（HgCI2）：）：蛋白的強固定劑蛋白的強固定劑v重鉻酸鉀：重鉻酸鉀：保存類脂、高爾基復合體、及染色體等結構。保存類脂、高爾基復合體、及染色體等結構。v苦味酸：三硝基苯酚，蛋白、糖原固定劑，苦味酸：三硝基苯酚，蛋白、糖原固定劑，v醋酸：固定染色體。軟化組織，緩解收縮。醋酸：固定染色體。軟化組織，緩解收縮。v蔗糖：防止某些細胞成分擴散，保持酶活性，良好形態(tài)。蔗糖：防止某些細胞成分擴散，保持酶活性，良好形態(tài)。v四氧化鋨：保存細胞蛋白質(zhì)細微結構有良好效應，應用與四氧化鋨：保存細

5、胞蛋白質(zhì)細微結構有良好效應，應用與 電鏡觀察切片的固定與染色。電鏡觀察切片的固定與染色。丙酮及醇類固定劑丙酮及醇類固定劑v丙酮：沉淀蛋白質(zhì)和糖，對組織穿透性很強?？梢员撼恋淼鞍踪|(zhì)和糖，對組織穿透性很強。可以單獨使用，低溫下保持酶活性效果好。單獨使用，低溫下保持酶活性效果好。v乙醇：固定糖原和核酸的作用。低分子蛋白質(zhì)、多乙醇：固定糖原和核酸的作用。低分子蛋白質(zhì)、多肽及胞漿內(nèi)蛋白質(zhì)保存效果較差。必須與其他試劑肽及胞漿內(nèi)蛋白質(zhì)保存效果較差。必須與其他試劑混合使用，單獨使用使組織收縮嚴重，對細胞形態(tài)混合使用，單獨使用使組織收縮嚴重，對細胞形態(tài)保存不良。保存不良?；旌瞎潭▌┗旌瞎潭▌﹙固定組織時，單

6、獨使用一種固定劑很難對組固定組織時，單獨使用一種固定劑很難對組織成分有理想的固定效果。通常幾種固定劑織成分有理想的固定效果。通常幾種固定劑混用，制成混合固定劑。以求得補償某試劑混用，制成混合固定劑。以求得補償某試劑對組織所致的缺陷。對組織所致的缺陷。v4%多聚甲醛磷酸緩沖液多聚甲醛磷酸緩沖液 pH7.4v成分：成分： 4%多聚甲醛溶于多聚甲醛溶于1倍的磷酸緩沖液中，倍的磷酸緩沖液中，v1倍的磷酸緩沖液倍的磷酸緩沖液:PBS MVv NaCl 140mM 58.44 v KCl 2.7mM 74.55v NaH2PO412H2O， 10mM 358.14v KH2PO4 1.8mM 136.09

7、v 調(diào)調(diào)pH至至7.4。 Bouins液液v苦味酸飽和水溶液苦味酸飽和水溶液 75ml 15 固定糖原固定糖原v37%-40%福爾馬林液福爾馬林液 25ml 5 固定蛋白和脂肪固定蛋白和脂肪v冰醋酸冰醋酸 5ml 1 凝固核染色質(zhì)凝固核染色質(zhì)固定組織時應注意：固定組織時應注意：v應力求保持組織新鮮，勿使其干燥，盡快固定應力求保持組織新鮮，勿使其干燥，盡快固定處理。處理。v組織塊不易過大過厚，必須小于組織塊不易過大過厚，必須小于2cm1.5cm0.3cm，尤其是組織塊厚度必須控尤其是組織塊厚度必須控制在制在0.3cm以內(nèi)。以內(nèi)。v固定液必須有足夠的量，在體積上一般大于組固定液必須有足夠的量，在體

8、積上一般大于組織織20倍以上，否則組織中心固定不良影響效果。倍以上，否則組織中心固定不良影響效果。固定時間的選擇v不同的研究目的所需使用的固定液。v材料的大小，組織的特性與致密度。v溫度的不同有所差別。組織固定后的處理組織固定后的處理v沖洗或漂洗：沖洗或漂洗：組織固定后應充分水洗，去除固定組織固定后應充分水洗，去除固定液造成的人為假象。液造成的人為假象。v修塊修塊:大小合適、去除形態(tài)不好的部分，大小合適、去除形態(tài)不好的部分，四、脫水四、脫水v脫水目的：脫水目的：運用某種溶劑置換組織內(nèi)的水分。運用某種溶劑置換組織內(nèi)的水分。v脫水劑：乙醇、丙酮、正丁醇等脫水劑：乙醇、丙酮、正丁醇等v乙醇乙醇：最常

9、用的脫水劑：最常用的脫水劑v一般組織：一般組織：70%-80%-90%-100%- 100%v特殊組織：特殊組織：30%-40-%-50%-60%-70%- 80%-90%-100%- 100% 每步每步30分鐘左右。分鐘左右。v要求：要求：完全脫凈，保證脫水梯度和每一步脫水時間完全脫凈，保證脫水梯度和每一步脫水時間v 不能過度脫水（使組織變脆）不能過度脫水（使組織變脆）v不同組織脫水時間不同：不同組織脫水時間不同：v大的致密的組織需要延長脫水時間大的致密的組織需要延長脫水時間v為加速各級酒精的穿透力，脫水可為加速各級酒精的穿透力，脫水可在在37溫箱中進行。溫箱中進行。 五、透明或媒浸五、透明

10、或媒浸目的與作用目的與作用v對組織的最后脫水處理對組織的最后脫水處理v與包埋劑置換與包埋劑置換透明劑：透明劑：苯、甲苯、二甲苯、氯仿等有苯、甲苯、二甲苯、氯仿等有機溶劑機溶劑v100%乙醇脫水后進入二甲乙醇脫水后進入二甲苯兩次，保證透明完全。苯兩次，保證透明完全。六、包埋六、包埋包埋劑的特點：包埋劑的特點：v具有一定的強度和韌度，滿足切片的要求。具有一定的強度和韌度，滿足切片的要求。v能完全進入組織。能完全進入組織。v對組織內(nèi)部成分損傷小。對組織內(nèi)部成分損傷小。石蠟包埋石蠟包埋v石蠟特點：熔點：石蠟特點：熔點：45-50 軟蠟軟蠟v 55-60 55-60 硬蠟硬蠟 常用常用v石蠟的處理：石蠟

11、的處理： 新蠟應溶一次，增加密度。新蠟應溶一次，增加密度。 并用濾紙過濾去處雜質(zhì)。并用濾紙過濾去處雜質(zhì)。 加加5%10%的蜂蠟的蜂蠟,增加石蠟的韌性。增加石蠟的韌性。 反復溶的舊蠟包埋效果更好。反復溶的舊蠟包埋效果更好。v程序：在溶蠟箱中進行程序：在溶蠟箱中進行55-6055-60，恒溫。，恒溫。v浸蠟：二甲苯透明后的組織塊在二甲苯：石蠟（浸蠟：二甲苯透明后的組織塊在二甲苯：石蠟（1 1：1 1）中兩）中兩次，在石蠟中兩次，每次一個小時左右。次，在石蠟中兩次，每次一個小時左右。v包塊：在室溫進行包塊：在室溫進行七 石蠟切片v載玻片處理：v切片：v展片：背面與玻片。 v烘片：37的溫箱內(nèi)烤干(約

12、需12小時)。 v優(yōu)點：操作比較簡便、容易，可以切出較薄的切片，并且易于制成連續(xù)切片，也容易附著于載玻片上。v缺點：是不適于較大的標本，材料在經(jīng)過脫水、浸蠟的過程中容易收縮?；鹈弈z切片法火棉膠切片法v透明劑：乙醚與乙醇等量混合透明劑：乙醚與乙醇等量混合v包埋劑：火棉膠溶于透明劑包埋劑：火棉膠溶于透明劑v包埋：常溫進行包埋：常溫進行v凝固：在乙醚中過夜，凝固：在乙醚中過夜，v 在氯仿中過夜。在氯仿中過夜。v在在70%乙醇中保存。乙醇中保存。v優(yōu)點：優(yōu)點：可切大的組織可切大的組織v 可切較硬的組織如硬骨可切較硬的組織如硬骨v缺點：操作所用時間長缺點：操作所用時間長v 一般切片厚度為一般切片厚度為2

13、0-30m。v 不能連續(xù)切片不能連續(xù)切片v 全部試劑為易燃物質(zhì)，注意防火全部試劑為易燃物質(zhì)，注意防火冰凍切片法 v取材：液氮保存v載玻片處理v切片v保存：-70 或-20 混合固定劑混合固定劑v固定組織時，單獨使用一種固定劑很難對組固定組織時，單獨使用一種固定劑很難對組織成分有理想的固定效果。通常幾種固定劑織成分有理想的固定效果。通常幾種固定劑混用，制成混合固定劑。以求得補償某試劑混用，制成混合固定劑。以求得補償某試劑對組織所致的缺陷。對組織所致的缺陷。v4%多聚甲醛磷酸緩沖液多聚甲醛磷酸緩沖液 pH7.4v成分：成分： 4%多聚甲醛溶于多聚甲醛溶于1倍的磷酸緩沖液中，倍的磷酸緩沖液中，v1倍

14、的磷酸緩沖液倍的磷酸緩沖液:PBS MVv NaCl 140mM 58.44 v KCl 2.7mM 74.55v NaH2PO412H2O， 10mM 358.14v KH2PO4 1.8mM 136.09v 調(diào)調(diào)pH至至7.4。 組織固定后的處理組織固定后的處理v沖洗或漂洗：沖洗或漂洗：組織固定后應充分水洗，去除固定組織固定后應充分水洗，去除固定液造成的人為假象。液造成的人為假象。v修塊修塊:大小合適、去除形態(tài)不好的部分，大小合適、去除形態(tài)不好的部分，石蠟包埋石蠟包埋v石蠟特點：熔點：石蠟特點：熔點：45-50 軟蠟軟蠟v 55-60 55-60 硬蠟硬蠟 常用常用v石蠟的處理：石蠟的處理： 新蠟應溶一次，增加密度。新蠟應溶一次，增加密度。 并用濾紙過濾