基于Cytb基因、28SrDNA序列分析對(duì)蕨葉蜂亞科系統(tǒng)發(fā)育的研究畢業(yè)論文

1、1 引言昆蟲綱是動(dòng)物界種類最豐富的一個(gè)類群，研究昆蟲的系統(tǒng)學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育對(duì)了解生物進(jìn)化以及進(jìn)化機(jī)制都有重要意義。葉蜂總科(tenthredinoidea)隸屬于昆蟲綱膜翅目(hymenoptera)廣腰亞目(symphyta)，種類極多，分布廣泛。葉蜂科是葉蜂總科最大的科，大概有7000余種，已知5000種以上，中國種類超過300屬2000種,這個(gè)類群對(duì)農(nóng)、林害蟲種群控制和保持生態(tài)平衡起到一種關(guān)鍵性的自然調(diào)控作用。長期以來，傳統(tǒng)的葉蜂分類學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育研究主要依賴于形態(tài)解剖特征、生物學(xué)性狀以及生物地理學(xué)信息等，因?yàn)橥獠啃螒B(tài)等比較直觀，容易得到。這些分類依據(jù)在大多數(shù)情況下能清晰地反映一個(gè)物種的分類地

2、位或系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系1-3。傳統(tǒng)的昆蟲系統(tǒng)學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育研究主要依賴形態(tài)解剖特征、生物學(xué)性狀以及生物地理學(xué)信息等，這些依據(jù)在大多數(shù)情況下能清晰的反映一個(gè)物種的分類地位或系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。但隨著學(xué)科的發(fā)展也遇到了一些傳統(tǒng)方法難以解決的困難，例如，一些近緣種很難確定其分類地位，對(duì)于種群、生態(tài)型的研究更是如此。生物大分子如dna和蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)所必需，其中核酸攜帶了生物的所有遺傳基因。berlocher(1984)以昆蟲分子系統(tǒng)學(xué)4（insect molecular systematics）為題首次專門介紹了分子技術(shù)在昆蟲系統(tǒng)學(xué)研究中的應(yīng)用及其數(shù)據(jù)分析方法。20年來，昆蟲分子系統(tǒng)學(xué)快速發(fā)展，目前應(yīng)用核酸序列

3、分析技術(shù)測(cè)定昆蟲特定的核苷酸序列，以比較不同昆蟲之間的演化關(guān)系，建立符合自然發(fā)育的分子系統(tǒng)譜系，是昆蟲分子系統(tǒng)發(fā)育方面的主要研究方向之一。coi基因是mtdna13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因之一。該基因的產(chǎn)物是細(xì)胞色素氧化酶亞基i，后者是細(xì)胞色素氧化酶的重要組成部分。細(xì)胞色素氧化酶在呼吸鏈電子傳遞和質(zhì)子的跨膜反應(yīng)中發(fā)揮著巨大作用，在真核生物中它由多個(gè)亞基組成，其中亞基i，ii和iii由線粒體dna編碼，其余為核基因編碼。這些亞基多為跨膜蛋白，跨過線粒體的內(nèi)膜，亞基i和11組成酶的催化核心。col是細(xì)胞色素c氧化酶中最大和最保守的亞基，葉蜂中col全長860bp。研究葉蜂亞科生物學(xué)一方面在生產(chǎn)上有助于害蟲

4、治理，另一方面，通過研究其系統(tǒng)演化及在各個(gè)地質(zhì)時(shí)期的分布變遷，研究其和寄主植物的協(xié)同演化關(guān)系，將有助于人類對(duì)自然界的演化規(guī)律、物種多樣性及地球表面環(huán)境變遷(大陸漂移、陸地表面的升降等)的認(rèn)識(shí)，有助于人類更好地保護(hù)和利用我們賴于生存的環(huán)境。1.1 研究背景及研究內(nèi)容在昆蟲分子系統(tǒng)學(xué)研究中主要應(yīng)用細(xì)胞核dna、mtdna和rdna。其中細(xì)胞核dna或mtdna的序列分析是一項(xiàng)最急需的技術(shù)，它提供了大量的詳細(xì)資料。而mtdna在進(jìn)化研究中非常有用，一直應(yīng)用于種群結(jié)構(gòu)和基因流、雜交、生物地理學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育的研究5 。mtdna小、相對(duì)快的進(jìn)化速率和母本的遺傳特性使得它很適合于種群歷史和親緣關(guān)系相近的分類

5、單元間進(jìn)化的研究68 。mtdna主要用于rflp和克隆后或pcr擴(kuò)增后的測(cè)序910 。1.1.1 核基因序列生物的性狀基本由核基因決定。核基因中含有更加豐富的生物學(xué)信息，用適當(dāng)?shù)暮嘶蜓芯坷ハx的系統(tǒng)發(fā)育，其結(jié)果更有可能比較真實(shí)地反映出昆蟲的進(jìn)化歷史。核基因有以下優(yōu)點(diǎn)：1)核基因一般比線粒體基因進(jìn)化得慢，這使它們成為一種解決分歧久遠(yuǎn)的類群關(guān)系比較好的標(biāo)記；2)核基因構(gòu)建的樹普遍有比較高的ci值，與線粒體基因相比更有助于整棵樹的解決；3)核基因的堿基位點(diǎn)速率變異有更高的同質(zhì)性；4)核基因的堿基替代速率距陣比線粒體基因的要均勻。細(xì)胞色素b是一個(gè)橫貫?zāi)蓚?cè)的極端疏水性的蛋白。對(duì)細(xì)胞色素b氨基酸組成和

6、結(jié)構(gòu)基因的脫氧核糖核酸(dna)順序研究指出,約68的氨基酸為非極性的。對(duì)細(xì)胞色素b在電子傳遞鏈中的復(fù)雜功能至今還不清楚。1.1.2 線粒體基因(mtdna)序列mtdna 廣泛存在于昆蟲體內(nèi)富含線粒體的飛行肌中和卵內(nèi),昆蟲的mtdna 大小一般為15141613 kb，以高拷貝數(shù)目存在于線粒體內(nèi)。相對(duì)于核dna 來說，mtdna 是一個(gè)封閉的環(huán)狀雙鏈，核酸序列和組成比較保守，以它作為模板制作的pcr 反應(yīng)引物的通用性比較強(qiáng)。對(duì)進(jìn)化過程中不同生物體的dna 序列的核苷酸替換率的比較研究發(fā)現(xiàn)，mtdna 基因組的替換率比核dna 高510 倍。mtdna 基因組中不含間隔區(qū)和內(nèi)含子，無重復(fù)序列和

7、不等交換，在遺傳過程中不發(fā)生基因重組、倒位、易位等突變，并且遵守嚴(yán)格的母系遺傳方式，可以簡單地認(rèn)為mtdna 是克隆型。正是由于以上結(jié)構(gòu)和進(jìn)化上的特點(diǎn)，mtdna 已成為研究生物(主要是動(dòng)物) 進(jìn)化的重要材料。國內(nèi)已有很多學(xué)者利用mtdna上的不同基因組對(duì)昆蟲綱內(nèi)不同分類階(單) 元之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行了研究。印紅11將我國直翅目蝗總科8 科8個(gè)種和從互聯(lián)網(wǎng)genbank 中檢索到相關(guān)物種的線粒體基因組16s rrna序列片段進(jìn)行同源性比較，計(jì)算核苷酸使用頻率，并構(gòu)建分子系統(tǒng)樹。胡婧12年以網(wǎng)翅蝗科的6種昆蟲作為材料，通過特異性引物，對(duì)mt 16s rrna基因序列進(jìn)行了擴(kuò)增。劉殿鋒13測(cè)定

8、了斑腿蝗科10亞科20種蝗蟲和其他蝗科3種蝗蟲的線粒體16s rrna部分序列，并從genbank中下載了15種蝗亞目昆蟲的16s rrna基因相應(yīng)序列片段。劉曉麗在2004年報(bào)道了9種擬步甲16s rdna 部分序列及其親緣關(guān)系，部分?jǐn)M步甲16s rrna和和18s rrna基因序列與分子系統(tǒng)14-15。現(xiàn)有的研究結(jié)果表明，快速進(jìn)化的基因或者核苷酸區(qū)段（如線粒體dna、線粒體的rrna的igs區(qū)域）適合于種內(nèi)或近緣種的系統(tǒng)發(fā)育分析；慢速進(jìn)化的基因（如核糖體dna及其產(chǎn)物rrna）適合于遠(yuǎn)緣種類或高級(jí)階元的系統(tǒng)發(fā)育。有學(xué)者認(rèn)為，由于核基因沒有線粒體基因的替代偏異特征，昆蟲分子系統(tǒng)學(xué)應(yīng)該更加關(guān)注

9、核基因數(shù)據(jù)而不是線粒體基因數(shù)據(jù)?？傊?dāng)前運(yùn)用核基因序列或?qū)⒑嘶蛐蛄信c線粒體基因相結(jié)合研究昆蟲的系統(tǒng)發(fā)育正成為該領(lǐng)域的一種發(fā)展趨勢(shì)。雖然應(yīng)用dna 序列分析等分子手段來探討昆蟲不同類群之間的系統(tǒng)關(guān)系是當(dāng)今昆蟲系統(tǒng)學(xué)研究的熱點(diǎn)。但是目前在實(shí)驗(yàn)技術(shù)、資料積累、數(shù)據(jù)處理分析以及序列數(shù)據(jù)的可比性等方面還有待于進(jìn)一步的完善和充實(shí)。1.2分子系統(tǒng)樹構(gòu)建方法分子系統(tǒng)學(xué)的主要目的是根據(jù)分子數(shù)據(jù)構(gòu)建系統(tǒng)樹，已有很多統(tǒng)計(jì)學(xué)方法可以用于分析分子數(shù)據(jù)來重建系統(tǒng)發(fā)育樹，通常使用的方法分為4類：距離法、簡約法、似然法以及貝葉斯法。距離矩陣法（distance matrix method）首先獲得所有分類群間的進(jìn)化距離，

10、再基于這些距離值之間的關(guān)系構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。包括兩種方法，算術(shù)平均的不加權(quán)對(duì)群法（upgma），類群間的距離是兩個(gè)類群內(nèi)所有成員成對(duì)距離的平均值，聚類結(jié)果可用樹狀圖表示，分支點(diǎn)是兩個(gè)序列間的中間點(diǎn)。一對(duì)序列間的距離是分支長度的總和。鄰接法（neighberjointingmethod）原理是逐漸尋找新的近鄰，使最終生成的分支樹的總長度達(dá)到最小。它只產(chǎn)生一個(gè)帶有分支長度估計(jì)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。簡約法（parsimony method）中最大簡約法是獲得最簡約的進(jìn)化途徑。所產(chǎn)生的最大簡約樹中，所有類群的性狀狀態(tài)的變化總數(shù)也最小。對(duì)dna序列而言，理論上每個(gè)位點(diǎn)均可以構(gòu)建三種可能的譜系樹，然而并非所有的位點(diǎn)都

11、可用于重建系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系?？捎糜跇?gòu)建最大簡約樹的位點(diǎn)稱為信息位點(diǎn)。最大似然法（maximumlikelihoodmethod，ml）對(duì)每個(gè)譜系拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，計(jì)算出可觀察到符合特定替代模式的一組特定的序列數(shù)據(jù)的最大概率（似然率），然后挑選最大似然值最高的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)（樹分支圖）作為重建的譜系樹。以核酸替代模型為基礎(chǔ)，ml法需要確定每個(gè)分支在一定時(shí)間間隔內(nèi)核苷酸發(fā)生特定替代變化的概率。貝葉斯法16（bayesain analysis）建立在ml基礎(chǔ)上的但比ml更為捷徑的一種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，它采用了ml法的基本原理，同時(shí)引進(jìn)了馬爾科夫鏈蒙特卡洛方法(the markov chain monthe carloanl

12、ysis，mcmc)途徑，將運(yùn)算效率提高，大大地縮短運(yùn)算時(shí)間，最終獲得一組似然率最大樹構(gòu)成的合意樹，直接估算貝葉斯后驗(yàn)概率(bayesain posterior probabilities)。目前還沒有一種構(gòu)樹方法可以適合所有的數(shù)據(jù)和各種條件。在距離矩陣法中，upgma法隱含了所有支系上速率相等的假設(shè)。鄰接法和轉(zhuǎn)換距離法不包括速率一致的假設(shè)，但均采用校正距離矩陣來減少各分支不同速率的影響。這些方法依賴校正距離系數(shù)的準(zhǔn)確性。當(dāng)序列之間的進(jìn)化速率差異很大或替代型式不同時(shí)，同型事件出現(xiàn)的可能性就較大，這也直接限制了簡約法的應(yīng)用。swofford17提出了最大簡約法中轉(zhuǎn)換替代和顛換替代賦予不同權(quán)重的計(jì)

13、算算法，但該方法仍需要假定轉(zhuǎn)換替代與顛換替代的比率。計(jì)算機(jī)模擬研究表明：在進(jìn)化速率恒定的前提下，最大似然法的結(jié)果質(zhì)量則依賴序列進(jìn)化模式的確定。在進(jìn)化速率可變的前提下，最大簡約法略差于轉(zhuǎn)換距離法和鄰接法，最大似然法結(jié)果最優(yōu)。然而，如果轉(zhuǎn)換替代的頻率大大顛換替代時(shí)，鄰接法要優(yōu)于最大似然法的結(jié)果。1.3 葉蜂科昆蟲分子系統(tǒng)發(fā)育研究現(xiàn)狀 一般認(rèn)為，葉蜂總科包括三節(jié)葉蜂科(argidae),四節(jié)葉蜂科/梨室葉蜂科（blasticotomidae),錘角葉蜂科（cimbicdae）,松葉蜂科（diprionidae）,筒腹葉蜂科（pergidae),葉蜂科(tenthredinidae)。研究葉蜂總科內(nèi)部

14、的系統(tǒng)關(guān)系對(duì)解決整個(gè)廣腰亞目之間的關(guān)系有至關(guān)重要的作用。2003年schulmeister1提出了葉蜂總科的系統(tǒng)關(guān)系: （葉蜂科（不包括殘青葉蜂科）+ 錘角葉蜂科 + 松葉蜂科）是單系群，并且作為（三節(jié)葉蜂科+ 筒腹葉蜂科）的姐妹群，顯然是葉蜂科的并系，而去除殘青葉蜂科外的其余葉蜂科類群是單系17。schulmeister對(duì)分子數(shù)據(jù)獨(dú)立分析所得葉蜂總科內(nèi)部的分支與vilhelsmsen不同，也未出現(xiàn)vespina。葉蜂總科內(nèi)的節(jié)點(diǎn)目前大部分還處于模糊狀態(tài)。中國葉蜂研究的工作在新中國成立以后繁榮起來，葉蜂研究的工作者越來越多，中國科學(xué)院動(dòng)物研究所的朱弘復(fù)、王林瑤、袁德成，中國林業(yè)科學(xué)研究院的黃孝

15、運(yùn)、周淑芷、肖剛?cè)帷菆?jiān)、張真等先后報(bào)道了中國一些葉蜂的新種18-27。蕭剛?cè)嵯壬?991年總結(jié)了中國葉蜂的系統(tǒng)分類研究成果 28。從20世紀(jì)90年代開始，中南林業(yè)科技大學(xué)昆蟲系統(tǒng)與進(jìn)化研究組的魏美才、聶海燕、張少冰、鐘義海、鄧鐵軍、陳明利、黃寧廷等都對(duì)中國葉蜂研究工作做出了突出貢獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)大量新種，并建立了許多新屬。2006年魏美才等系統(tǒng)回顧了中國葉蜂系統(tǒng)學(xué)和生物地理學(xué)研究歷史，給出了中國葉蜂種類名錄和研究文獻(xiàn)目錄。葉蜂總科是廣腰亞目最大的總科，中國己記載6個(gè)科，分別為三節(jié)葉蜂科argidae，葉蜂科tenthredinidae，松葉蜂科diprionidae，錘角葉蜂科cimbicidae

16、，筒腹葉蜂科pergidae和茸蜂科blasticotomidae。2 材料與方法2.1 標(biāo)本及來源本研究提取了葉蜂科昆蟲10個(gè)樣品的基因組dna，標(biāo)本是中南林業(yè)科技大學(xué)昆蟲系統(tǒng)與進(jìn)化生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室人員在野外采集的近三年標(biāo)本，100% 酒精浸泡，20保存。魏美才博士完成標(biāo)本鑒定。實(shí)驗(yàn)選取葉蜂成蟲胸部提取基因組dna，殘骸繼續(xù)用酒精保存以做證據(jù)。提取的dna和殘骸標(biāo)本均保存于中南林業(yè)科技大學(xué)昆蟲系統(tǒng)與進(jìn)化實(shí)驗(yàn)室。以蕨葉蜂亞科selandriinae、平背葉蜂亞科allantinae、巨基葉蜂亞科megabelesesinae及藺葉蜂亞科belesesinae為內(nèi)群，從genbank下載runari

17、a reducta的28s dna及cytb基因序列做為外群。樣本詳情見表1。 表1 蕨葉蜂亞科與其它各亞科系統(tǒng)發(fā)育研究選用類群信息 table.1 specimens information of tenthredinidae researched in this study 所屬類群 基因序列號(hào) 采集地點(diǎn)采集時(shí)間科 亞 科屬 種 名cytb28srdnain grouptenthredinidaeselandriinaeaneugmenusaneugmenus frontalis 00湖北宜昌神農(nóng)架2010.5aneugmenus pteridii00湖南東安舜皇山2010.7neostr

18、ombocerosneostromboceros nipponicus00湖南東安舜皇山2010.7euforsiuseuforsius pieli00湖南瀏陽大圍山2010.5allantinaetaxonus taxonus attenatus00浙江臨安清涼峰2010.5linomorphalinomorpha flava00浙江臨安清涼峰2010.4allantusallantus nigrocaeruleus00湖南東安黃泥洞2010.7megabelesesinaemegabeleses megabeleses liriodendrovorax00湖南瀏陽大圍山2010.5bele

19、sesinaeabeleses abeleses rufotibialis00湖南東安舜皇山2010.7belesesbeleses nigroapicalis00湖南瀏陽大圍山2011.4out groupblasticotomidaerunariarunariarunaria reductaef032212gq374688注: “0”表示本次實(shí)驗(yàn)所得序列, “no”表示序列缺失, 有序列號(hào)標(biāo)注的為ncbi中下載的序列. 2.2 實(shí)驗(yàn)用品2.2.1 主要儀器pcr擴(kuò)增儀：2720 thermal cycler，凝膠成像儀：tanon2500r, 穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀：dyy8c，長沙平凡儀器儀表有

20、限公司，臺(tái)式高速離心機(jī)：tg16w，移液槍：eppendorf，數(shù)顯恒溫水浴鍋：hhs26，實(shí)驗(yàn)室超純水器：p105w，多功能漩渦混合儀：230/240vac。2.2.2 主要試劑溴代十六烷基三甲胺（ctab）；tris飽和酚；乙二胺四乙酸（edta）；溴化乙錠（eb）；taq dna聚合酶（takara）；瓊脂糖；250bpdna marker；其余試劑均為分析純； 實(shí)驗(yàn)所用引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。2.2.3 主要溶液dna提取常規(guī)溶液配制：te溶液（ph8.0）：10mmol/l tris-hcl，（ph8.0，1 mmol/l edta（ph8.0）2ctab 100ml提取

21、液：ctab 2g，nacl 1.4m，tris-hcl（ph8.0）0.1m， edta（ph8.0）0.02m，pvp（1%）1g。氯仿:異戊醇=24:1。tbe緩沖液（5儲(chǔ)存液）：每升含54g tris堿，27.5g硼酸，20ml 0.5mol/l edta（ph8.0）。2.3 實(shí)驗(yàn)方法2.3.1 基因組dna的提取本文采用ctab法和試劑盒法提取葉峰基因組dna。提取具體步驟如下：1 將2%ctab buffer 預(yù)熱至60。2 將100%酒精浸泡過的葉峰標(biāo)本用1te buffer 浸泡兩次，每次15min。3 解剖葉峰，取個(gè)體胸部肌肉組織，于1.5ml離心管中液氮研磨；待液氮完全揮

22、發(fā)，加入600ul 2% ctab buffer（已預(yù)熱）。4 在所得溶液加入2ul 25mg/mlprok(終濃度100mg/ml)和1.0ul -巰基乙醇溶液，輕輕搖勻。5 將上述所得溶液于60下恒溫水浴34h。6 從水浴鍋中取出溶液，于4 7000rpm下離心3min，取上清液，去雜質(zhì)碎片。7 在上清液中加入4等體積氯仿/異戊醇（24:1）混合液混勻，然后在7000rpm下離心10min，取上層清液，量體積；重復(fù)一次。8 在上層清液中加入2倍體積無水乙醇（20）沉降dna過夜。9 dan沉降溶液于4 10000rpm下離心15min，取沉淀，小心棄上清。10 用4 200ul 75%酒精

23、洗滌沉淀10000rpm下離心3min，棄上清；重復(fù)一次。11 自然干燥。12 用40ul te buffer重溶所得基因組dna，然后，置20保存?zhèn)溆谩?.3.2 pcr擴(kuò)增（1）28s dna基因擴(kuò)增引物：上游：5-gacccgtcttgaaacacgga-3；下游：5-cccacagcgccagttctgcttacc-3。（2）pcr反應(yīng)循環(huán)體系及參數(shù)pcr反應(yīng)體系1為50ul體系，成分如下：濃度體積ddh2o34.5ulprimer buffer5ulmix dntp4ulprimer110ul/mol2ulprimer210ul/mol2ultemplate2ultaq dna po

24、lymer 酶0.5ul28s dna基因的pcr反應(yīng)的參數(shù)：94預(yù)變性1分鐘，33個(gè)循環(huán)（94變性30秒，55退火30秒，72延伸60秒）；最后72延伸10分鐘。后期更換為pcr反應(yīng)體系2，亦為50ul體系，成分如下：濃度體積taq mastermix25ulprimer110ul/mol2ulprimer210ul/mol2ultemplate2ulrnase-free water19ulpcr反應(yīng)體系2的反應(yīng)參數(shù)為：由于實(shí)驗(yàn)樣品有限，在實(shí)驗(yàn)后期更改為25ul體系，即以上兩個(gè)反應(yīng)體系的每種成分均減半。2.3.3 pcr產(chǎn)物檢測(cè)、純化及測(cè)序pcr產(chǎn)物檢測(cè),取5ul的反應(yīng)產(chǎn)物，經(jīng)0.8%瓊脂糖

25、凝膠電泳后（57v，0.5小時(shí)）eb染色0.5小時(shí)，在凝膠成像系統(tǒng)中檢測(cè)是否有目標(biāo)條帶并照相；產(chǎn)物的純化和測(cè)序均有上海博尚生物技術(shù)公司完成。 2.3.4 數(shù)據(jù)處理的相關(guān)軟件(1)bioedit 5.0.629 bioedit是一個(gè)生物序列編輯器可在windows 95/98/nt/2000中運(yùn)行，它的基本功能是提供蛋白質(zhì)核酸序列的編輯排列處理和分析，其直觀的菜單式的并有大量的圖示提供用戶一個(gè)外部分析程序的圖形界面。 (2) clustalx 1.8330clustalx是一個(gè)使用最廣泛的菜單操作的多序列比對(duì)程序，在任何主流的計(jì)算機(jī)平臺(tái)上都可以免費(fèi)使用31。這個(gè)程序基于漸進(jìn)比對(duì)的思想，得到一系列

26、序列的輸入，對(duì)每兩個(gè)序列進(jìn)行成對(duì)比對(duì)(pairwise alignment)并且計(jì)算結(jié)果。(3) mega 4.132 mega 是 molecular evolutionary genetics analysis 的簡稱，由 sudhir kumar 等人編寫是一個(gè)用于序列分析、比較統(tǒng)計(jì)和系統(tǒng)發(fā)育分析的免費(fèi)軟件包，其操作界面清晰簡單，主要功能包括核酸和蛋白質(zhì)序列的多序列比對(duì)、對(duì)比對(duì)序列的統(tǒng)計(jì)分析，估算進(jìn)化距離(genetic distance)和標(biāo)準(zhǔn)誤、和系統(tǒng)樹的推斷和檢驗(yàn)等32。(4) paup4.033 paup是 phylogenetic analysis using parsimon

27、y的簡稱，是一款用于構(gòu)建進(jìn)化樹（系統(tǒng)發(fā)育樹）及進(jìn)行相關(guān)檢驗(yàn)的軟件，包含了眾多分子進(jìn)化模型和方法，可利用最大似然法、簡約法、距離法等分析分子數(shù)據(jù)（dna、蛋白質(zhì)序列）、形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)及其他類型的數(shù)據(jù)。截至目前，paup是應(yīng)用最廣泛的系統(tǒng)發(fā)育分析軟件。2.3.5 外群的選擇選取runaria reducta 這個(gè)種為外群。2.3.6 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析將所得雙向測(cè)序結(jié)果輸入contigexpress軟件中，輔以bioedit軟件進(jìn)行序列拼接和序列編輯。此程序可自動(dòng)對(duì)序列進(jìn)行編輯選擇，當(dāng)然也可手工對(duì)其進(jìn)行編輯，最后將編輯后的最終序列輸出，保存成fasta格式。然后用clustalx進(jìn)行計(jì)算比對(duì)，再用meg

28、a 4.1 統(tǒng)計(jì)28s dna基因序列堿基組成，計(jì)算遺傳距離。本文選用nj、me和mp分析法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。nj、me分析法建立的發(fā)育樹在mega4.1中完成，mp法建立的發(fā)育樹在paup4.0中完成。3 研究結(jié)果與分析3.1 pcr擴(kuò)增結(jié)果本文共提取了10個(gè)樣品的28s dna基因，擴(kuò)增結(jié)果如圖1.2所示。圖1所測(cè)樣品pcr檢測(cè)結(jié)果1 m 1 2 3 4 注：m：marker：200bpdna，從下往上依次是200bp，400bp，600bp，800bp，1000bp,1200bp.圖中，1：arge xanthogaster；2：arge vulnerata； 3：arge lingulo

29、pygia； 4：eutomostethus formosanus。圖2 所測(cè)樣品pcr檢測(cè)結(jié)果2 m 1 2 3 4 5注：m：marker：200bp； 1：pachyprotasis wui； 2：pachyprotasis sellata； 3：cibdela chinensis； 4：megabeleses liriodendrovorax； 5：aneugmenus pteridii。從以上圖1、圖2可以看出，28s dna的引物擴(kuò)增結(jié)果特異性強(qiáng)，條帶均清晰，測(cè)序長度約在1050bp。3.2基因序列長度和堿基組成基因部分序列經(jīng)clustalx1.83比對(duì)后對(duì)位排列，測(cè)得的 28s

30、rrna基因部分片段比對(duì)后長為1086bp，用mega4.0計(jì)算出保守位點(diǎn)為837個(gè)，變異位點(diǎn)239個(gè)，簡約信息位點(diǎn)155個(gè)。28s rrna基因序列的長度和堿基組成見表2：表2 28s rrna基因片段長度以及堿基組成speciest(u) c a g total55 euforsius pieli 28s87 aneugmenus frontalis 28s173 aneugmenus pteridii175neostrombceros nipponicus91 megabeleses liriodendrovorax58taxonus attenatus 28s63 linomorpha

31、 flava 28s153 allantus nigrocaeruleus178 abeleses rufotibialis219 beleses nigroapicalicrunaria reductadownloadavg.19.7 26.9 22.9 30.4 109519.9 26.9 22.6 30.6 108220.0 26.8 23.1 30.2 106118.9 27.2 22.9 31.0 106919.7 27.2 22.5 30.6 107219.8 27.3 22.1 30.8 102919.3 26.9 23.0 30.7 109119.9 26.6 22.9 30.

32、5 111320.5 26.7 22.3 30.5 111719.7 27.7 22.7 30.0 108119.3 26.8 22.0 31.9 122019.7 27.0 22.6 30.7 1093.6由表2統(tǒng)計(jì)結(jié)果可知28s rrna平均堿基組成為：t：22.5%；c：30.6%；a：19.9%；g：27.1%，堿基組成沒有明顯ta的偏好。3.3 堿基替換統(tǒng)計(jì)與遺傳距離3.3.1 堿基替換統(tǒng)計(jì)對(duì)28s dna基因序列進(jìn)行堿基替換統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3表3 28s rdna基因序列堿基替換統(tǒng)計(jì)表domainiisisvrtotaldomaininfoavg102221121.61057.0dat

33、a1st342732.4351.6 1st pos data2nd3381071.4354.4 2nd pos data3rd342541.2351.1 3rd pos data對(duì)28s rdna基因序列進(jìn)行堿基替換統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表4表4 cytb dna基因序列堿基替換統(tǒng)計(jì)表domainiisisvrtotaldomaininfoavg4121061370.8654.3data1st14133410.8215.4 1st pos data2nd13142460.9219.1 2nd pos data3rd13931500.6219.9 3rd pos dataii表示不變位點(diǎn) ii = iden

34、tical pairssi表示轉(zhuǎn)換位點(diǎn) si = transitionsal pairssv表示顛換位點(diǎn) sv = transversional pairsr 表示轉(zhuǎn)換與顛換的比值 r = si/svdomain表示統(tǒng)計(jì)內(nèi)容 total表示總長 domain info表示統(tǒng)計(jì)所包括的位點(diǎn)利用表3中統(tǒng)計(jì)結(jié)果計(jì)算出28s dna轉(zhuǎn)換取代(transition)的速率為3.74%，顛換取代(transversion)的速率為2.68%，顛換取代的速率略低于轉(zhuǎn)換取代的速率，轉(zhuǎn)換速率與顛換速率之比r=1.4。3.4 28s rdna分子系統(tǒng)樹圖1:28s rdna基因部分序列經(jīng) mega分析產(chǎn)生nj樹擴(kuò)

35、樸結(jié)構(gòu)圖。nj分析選用的模型是kimura 2-parameter，在 nj分析樹中只有屬內(nèi)種形成了一個(gè)分支，構(gòu)成了單系群，結(jié)果表明：28s dna平均堿基組成無明顯ta的偏好，而cytb基因堿基組成有明顯ta的偏好。采用nj、me和mp法建分子系統(tǒng)樹分析它們?cè)诜肿铀降南到y(tǒng)發(fā)育關(guān)系，結(jié)果表明：各亞科內(nèi)均獨(dú)立形成一支，成為單系群。圖2：28s rdna基因部分序列經(jīng) paup分析產(chǎn)生mp樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)圖。圖3: 28s rdna基因部分序列經(jīng) paup分析產(chǎn)生me樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)圖。結(jié) 論葉蜂總科是廣腰亞目中最大的總科，長期以來，葉蜂總科昆蟲的系統(tǒng)學(xué)都是建立在形態(tài)學(xué)的基礎(chǔ)上，葉蜂總科昆蟲在亞科水平爭議一

36、直就比較大。分子數(shù)據(jù)有極強(qiáng)的遺傳學(xué)基礎(chǔ)，是客觀、真實(shí)、可量化的，利用分子數(shù)據(jù)可以彌補(bǔ)形態(tài)學(xué)上的不足。目前dna序列數(shù)據(jù)已廣泛應(yīng)用于昆蟲系統(tǒng)學(xué)研究中，并取得了一定的結(jié)果。本文研究的類群為葉蜂總科昆蟲一小部分種類，用nj法對(duì)28s dna基因的部分片段以進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育重建，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同方法對(duì)同一序列構(gòu)建的分子系統(tǒng)樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)不太相同?；蛐蛄薪浔容^表明：測(cè)得的28s dna基因部分序列構(gòu)建的分子系統(tǒng)樹不能推斷葉蜂總科昆蟲之間的明確關(guān)系，原因是這段序列過于保守，沒有足夠的簡約信息位點(diǎn)，不適合作為葉蜂科昆蟲科級(jí)及科級(jí)以下階元系統(tǒng)發(fā)育的分子標(biāo)記。葉蜂總科中6個(gè)科的演化關(guān)系復(fù)雜。在進(jìn)一步的研究中，應(yīng)增加樣

37、本的種類和數(shù)量，使分類單元更具代表性， 本文研究的葉蜂總科昆蟲只有5屬，以后可以增加更多的研究類群。本實(shí)驗(yàn)所用的是核糖體的基因，測(cè)得的序列長度不夠長，在未來的工作中我們可以延長核酸序列的長度，使其包含更大的遺傳信息；可以加入一些編碼蛋白質(zhì)的基因，如co和ef1-a基因這些分子標(biāo)記，把更多的基因聯(lián)合起來分析；另外，本文僅用了nj 一種方法構(gòu)建分子系統(tǒng)樹，還可結(jié)合 baysain 和ml 多種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法來綜合討論這些類群之間的關(guān)系。致謝這篇論文是在 老師的悉心指導(dǎo)和嚴(yán)格要求下完成的。從論文的選題、實(shí)驗(yàn)操作、研究方法、結(jié)果分析、直至論文的審定都飽含著她眾多的辛勞。老師嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹螌W(xué)態(tài)度、忘我的工作精神、

38、敏銳的學(xué)術(shù)洞察力、謙遜平和的性格、誨人不倦的育人風(fēng)格是我做人和學(xué)習(xí)的楷模，也是我今后努力和學(xué)習(xí)的方向。在此，特向老師致以崇高的敬意和衷心的感謝!本文自開題至成文，除受老師指導(dǎo)外，特別要感謝 在我們的實(shí)驗(yàn)操作、論文撰寫及生活各個(gè)方面的幫助。同時(shí)跟我一起實(shí)驗(yàn)的同學(xué)對(duì)我的幫助也是我實(shí)驗(yàn)及論文能完成不可缺少的，對(duì)他們也表示內(nèi)心的感謝。最后，深深感謝在工作和求學(xué)之路上，所有關(guān)心和幫助過我的人。參考文獻(xiàn)1 schulmeister, s.simultaneous analysis of basal hymenoptera (insecta) : introducing robust-choise sens

39、itivity analysis j. biol j linn soc, 2003, 79: 245-275.2 schulmeister , s. review of morphological evidence on the phylogeny of basal hymenopera ( insecta ), with a discussion of the ordering of characters j. biol j linn soc, 2003, 79: 209-243.3 vilhelmsen, l. phylogeny and classification of the ext

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