血站核酸檢測(cè)

1、 血站核酸檢測(cè)血站核酸檢測(cè) 甘肅省紅十字血液中心甘肅省紅十字血液中心血站核酸檢測(cè)的意義 核酸檢測(cè)（NAT）可以 有效地縮短病毒特異抗原和抗體免疫測(cè)定的“窗口期”，從而減少輸血風(fēng)險(xiǎn)，提高輸血安全。乙型肝炎病毒（HBV）感染檢測(cè)中，NAT除可縮短HBV感染檢測(cè)的窗口期外，還可以減少HBV急性感染恢復(fù)期、慢性隱匿性HBV感染以及變異病毒株感染的漏檢。丙型肝炎病毒（HCV）感染檢測(cè)中，可將HCV感染檢測(cè)的窗口期縮短，減少免疫靜默感染的漏檢。人類免疫缺陷病毒（HIV）感染檢測(cè)中，可將HIV感染檢測(cè)的窗口期縮短。 檢測(cè)窗口期 Window Period核酸研究的歷史 1869 1869 米舍爾（米舍爾（F

2、riedrich MiescherFriedrich Miescher） 從膿球分離出細(xì)從膿球分離出細(xì)胞核，不受蛋白酶分解，磷含量高，命名為胞核，不受蛋白酶分解，磷含量高，命名為“核核素素”(nuclein)”(nuclein)。 1944 1944 美國(guó)微生物學(xué)家埃弗里（美國(guó)微生物學(xué)家埃弗里（O.T. Avery O.T. Avery ）等的肺）等的肺炎球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。炎球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。 1953 1953 沃森和克里克（沃森和克里克（WATSONWATSON，CRICKCRICK）-DNA-DNA雙螺旋雙螺旋Francis Crick Francis Crick 核酸研究的歷史 1960196

3、0年代中期桑格年代中期桑格(Sanger)(Sanger)的的DNADNA測(cè)序法測(cè)序法 1972 1972 伯格伯格(Paul Berg) (Paul Berg) 重組重組DNADNA技術(shù)技術(shù) 引起人腫瘤的猴病毒基因與噬菌體lambdalambda的重組的重組 1973 1973 博耶（博耶（Herbert BoyerHerbert Boyer）和科恩（）和科恩（Stanley CohenStanley Cohen）- -使用重組使用重組DNADNA技術(shù)首次得到了重組技術(shù)首次得到了重組DNADNA微生物微生物( (基因工程技基因工程技術(shù)術(shù)) ) 1983 1983 穆利斯（穆利斯（Kary M

4、ullis) PCRKary Mullis) PCR技術(shù)技術(shù)核酸的種類DEOXYRIBONUCLEICACID（DNA）RIBONUCLEIC ACID（RNA） ribosome RNA(rRNA) transfer RNA(tRNA) messenger RNA(mRNA)核酸的分子組成元素組成 C H O N P C H O N P （恒定，（恒定，910%910%）基本結(jié)構(gòu)單位核苷酸核苷酸 磷酸 核苷（核苷（戊糖 、堿基）、堿基）核酸的理化性質(zhì)核酸分子具有強(qiáng)烈的紫外吸收DNA變性是雙鏈解離為單鏈的過(guò)程 DNA的增色效應(yīng) Tm值變性的核酸可以復(fù)性或形成雜交雙鏈 復(fù)性 退火 核酸分子復(fù)性和

5、雜交示意圖磁珠提取的原理：第一步：細(xì)胞的裂解：破碎細(xì)胞，并向溶液中加入磁珠第二步：結(jié)合核酸：pH較低，在高鹽環(huán)境下，硅膠磁珠帶正電荷，選擇性的與 優(yōu)化試劑中的核酸結(jié)合第三步：洗滌：用洗滌液將非核酸成分沖洗分離（為清洗干凈該步驟可以重復(fù)多次）第四步：核酸的洗脫：pH升高，在低鹽環(huán)境下，核酸被洗脫下來(lái)核酸檢測(cè)基本原理核酸檢測(cè)：一系列直接檢測(cè)病原體核酸的技術(shù)的總稱，對(duì)靶核酸直接擴(kuò)增或?qū)ζ涓綆У男盘?hào)擴(kuò)增，使看不見(jiàn)的極微量的核酸變成直觀的光電或可視信號(hào)。NAT檢測(cè)技術(shù)方法PCR擴(kuò)增技術(shù)轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增方法（TMA 、NASBA）其它NAT技術(shù)（bDNA、LAMP、LCR、SDA等）PCR 原理DNADNA

6、TMA的原理的原理Transcription-Mediated Amplification 轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增技術(shù)的擴(kuò)增技術(shù)模擬DNA 轉(zhuǎn)錄成轉(zhuǎn)錄成mRNA 的的自然過(guò)程自然過(guò)程DNA模板在反應(yīng)中作為中模板在反應(yīng)中作為中介介利用2個(gè)引物和個(gè)引物和2種酶種酶(RNA聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶）聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶）RNA聚合酶與聚合酶與DNA 模板的模板的啟動(dòng)子序列結(jié)合啟動(dòng)子序列結(jié)合等溫?cái)U(kuò)增（41.5）轉(zhuǎn)錄翻譯逆轉(zhuǎn)錄TMA的原理的原理特異性靶標(biāo)捕獲特異性捕獲探針與病毒核酸分子及內(nèi)標(biāo)物雜交結(jié)合，并將其固定在磁珠表面。對(duì)體系進(jìn)行重復(fù)的洗滌，去除血液樣品中除病毒核酸外的其他成分。轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增借助逆轉(zhuǎn)錄酶和RN

7、A多聚酶的共同作用，在等溫條件下，經(jīng)過(guò)一小時(shí)的擴(kuò)增得到約10億個(gè)目標(biāo)產(chǎn)物片斷。雙動(dòng)力學(xué)化學(xué)發(fā)光檢測(cè) 試劑消除未結(jié)合的檢測(cè)探針，雙動(dòng)力學(xué)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，分別檢測(cè)內(nèi)標(biāo)與病毒分子信號(hào)。理想的核酸擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)A理想的核酸擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)B核酸擴(kuò)增檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的一般原則各區(qū)獨(dú)立注意風(fēng)向因地制宜方便工作關(guān)于“區(qū)域”合并如使用擴(kuò)增和產(chǎn)物分析同時(shí)完成的實(shí)時(shí)熒光PCR儀進(jìn)行核酸擴(kuò)增檢測(cè)，擴(kuò)增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)可以合并。如使用核酸提取、擴(kuò)增及產(chǎn)物分析等均在一臺(tái)儀器上完成的全自動(dòng)核酸檢測(cè)分析儀，標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)可合并。符合基本要求的核酸擴(kuò)增檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的條件 （1）試劑準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)和擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)等

8、三個(gè)或四個(gè)區(qū)域在物理空間上，必須是完全相互獨(dú)立的，各區(qū)域無(wú)論是在空間還是在使用中，應(yīng)始終處于完全的分隔狀態(tài)，不能有空氣的直接相通。（2）各區(qū)的可移動(dòng)的儀器設(shè)備及各種物品包括實(shí)驗(yàn)記錄本、記號(hào)筆、試管架及清潔用具等必須專用。（3）應(yīng)在標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)等相對(duì)有可能出現(xiàn)“污染物”的區(qū)域安裝排風(fēng)扇或其它排風(fēng)和有效的裝置，以使空氣按試劑準(zhǔn)備區(qū)標(biāo)本制備區(qū)擴(kuò)增（及產(chǎn)物分析）區(qū)方向流動(dòng)。核酸擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室的工作流程 試劑準(zhǔn)備區(qū) 標(biāo)本制備區(qū) 擴(kuò)增區(qū)及擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)試劑貯存準(zhǔn)備區(qū) 核酸擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室中最為“潔凈”的區(qū)域，不應(yīng)有任何核酸的存在，包括試劑中所帶的標(biāo)準(zhǔn)品和陽(yáng)性對(duì)照。所有實(shí)驗(yàn)用潔凈物品如離心管、吸頭等的

9、存放和準(zhǔn)備處。商品試劑盒自制試劑：一次較大量配制，然后分裝成小瓶保存，每次檢測(cè)時(shí)，取出一小瓶使用，未用完的即棄掉，不再使用。儀器設(shè)備主要有加樣器、天平、離心機(jī)和冰箱等，最好配備超凈工作臺(tái)。標(biāo)本制備區(qū) 儀器設(shè)備主要有混樣設(shè)備、核酸提取儀、生物安全柜、加樣器、高速臺(tái)式（冷凍）離心機(jī)、加熱模塊或水浴箱、冰箱等。生物安全柜不應(yīng)放在實(shí)驗(yàn)室門(mén)口等易受人員走動(dòng)影響的地方，也不應(yīng)直對(duì)分體式空調(diào)。主要是用于血液樣本的混樣、核酸樣本的提取。加樣器吸頭必須帶濾芯。使用加熱模塊時(shí)，如在模塊孔中填入二氧化硅細(xì)砂，然后將標(biāo)本管置于細(xì)砂中溫育，可得到較為一致的溫育溫度。擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū) 擴(kuò)增反應(yīng)體系的配制和提取核酸的加入，

10、可在標(biāo)本制備區(qū)也可在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行，關(guān)鍵是要防止產(chǎn)物的污染。如果空間允許的話，也可在一個(gè)獨(dú)立的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行。加樣時(shí)，先加提取的核酸模板樣本，每加完一個(gè)即蓋好蓋子，然后加陽(yáng)性質(zhì)控核酸模板，再就是標(biāo)本制備陰性質(zhì)控和僅含按樣本一樣稀釋的主反應(yīng)混合液的擴(kuò)增陰性質(zhì)控，這樣做的目的是，最大可能地測(cè)出以前擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染。擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)熱循環(huán)儀的電源應(yīng)專用，并配備一個(gè)不間斷電源（UPS）或穩(wěn)壓電源。每次擴(kuò)增后，可使用可移動(dòng)紫外燈對(duì)擴(kuò)增熱循環(huán)儀進(jìn)行照射。擴(kuò)增儀應(yīng)定期進(jìn)行校準(zhǔn)。工作流程關(guān)注采集、保存、運(yùn)輸?shù)年P(guān)鍵點(diǎn)留樣方式、采血管采血后什么時(shí)間離心采血后保存溫度、時(shí)間離心后保存溫度、時(shí)間（運(yùn)輸）檢測(cè)前的保存溫度、時(shí)

11、間長(zhǎng)期保存的樣本第一步：標(biāo)本的采集-采血管無(wú)菌真空采血管一、血清管普通血清管帶分離膠的血清管二、抗凝管EDTA 2K或3K抗凝管EDTA 2K抗凝間分離膠（PPT)枸櫞酸鈉抗凝管第一步：標(biāo)本的采集-留樣方式 最佳方式：旁袋1管 5ml用于核酸檢測(cè) 2管 5ml用于酶免疫測(cè)定等 3管用于長(zhǎng)期保存留樣 旁路采樣1管 5ml用于核酸檢測(cè) 2管 5ml用于酶免疫測(cè)定等 3管用于長(zhǎng)期保存留樣 小辮留樣(不可取)1管 5ml用于核酸檢測(cè) 2管 5ml用于酶免疫測(cè)定等第二步：標(biāo)本的采集-離心離心條件 800-1600g 20min離心時(shí)間 4小時(shí)以內(nèi) 以免RNA的降解第三步：標(biāo)本的運(yùn)送應(yīng)采用不易破碎的容器裝

12、載標(biāo)本溫度2-8 C符合生物安全標(biāo)準(zhǔn)第四步：標(biāo)本的接收保存確認(rèn)標(biāo)本數(shù)量 運(yùn)輸狀態(tài) 標(biāo)本狀態(tài)：溶血、脂血保存： 用于檢測(cè)的樣本管：檢測(cè)前保存 4小時(shí)內(nèi)離心，離心后2天內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)的可存放2-8 C。 用于留樣備查的樣本：3個(gè)月以內(nèi)存放于-20 C以下，3個(gè)月以上置于-70 C以下。樣本匯集在Star上進(jìn)行準(zhǔn)備工作：將采血管開(kāi)蓋后裝載到專用32孔樣品架上。采血管上條形碼一律面向條碼掃描器，以方便掃描條碼。按照要求，將TIP頭、PCR板、24深孔板、洗脫管、磁套、廢棄管放置于平臺(tái)相應(yīng)位置。樣本匯集樣本匯集樣本匯集核酸提取同樣在Star核酸提取儀上進(jìn)行，緊跟Pooling之后，利用自動(dòng)移液配置裂解液、結(jié)

13、合液、洗液、洗脫液等，利用磁性分離功能自動(dòng)完成核酸樣本的裂解、提取、純化、PCR試劑配制、PCR上樣等實(shí)驗(yàn)操作。核酸擴(kuò)增結(jié)果確認(rèn)陰性反應(yīng)：進(jìn)入合格血液的放行程序。陽(yáng)性反應(yīng)：?jiǎn)螜z分項(xiàng)目檢測(cè)呈陽(yáng)性反應(yīng)單檢混合項(xiàng)目檢測(cè)呈陽(yáng)性反應(yīng)混樣分項(xiàng)目檢測(cè)呈陽(yáng)性反應(yīng)1.混樣混合項(xiàng)目檢測(cè)呈陽(yáng)性反應(yīng)混樣分項(xiàng)目檢測(cè)呈陽(yáng)性反應(yīng)按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行雙孔拆分檢測(cè)檢出陽(yáng)性標(biāo)本陽(yáng)性反應(yīng)標(biāo)本陰性反應(yīng)標(biāo)本進(jìn)入血液的隔離程序，填寫(xiě)相關(guān)報(bào)表，將標(biāo)本及血液篩查檢測(cè)報(bào)告送衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心進(jìn)入合格血液的放行程序全部標(biāo)本為陰性反應(yīng)進(jìn)入合格血液的放行程序，實(shí)驗(yàn)室需查找原因并完成分析報(bào)告質(zhì)量控制室內(nèi)質(zhì)量控制室間質(zhì)量評(píng)價(jià)遼寧省血液中心 實(shí)驗(yàn)室工作調(diào)整

14、工作模式:早8晚4標(biāo)本接收-采血當(dāng)天 EIA檢測(cè)-采集后第2天,當(dāng)天出最終結(jié)論報(bào)告.核酸檢測(cè):全血EIA(合格)NAT(第3天)血小板:EIA與NAT平行檢測(cè)(第2天)采用依據(jù):快篩、陽(yáng)性率低確保報(bào)告時(shí)限 血小板30小時(shí) 全血54小時(shí)7+1檢測(cè)模式檢測(cè)模式標(biāo)本質(zhì)量的控制采血管選擇采樣方式 旁袋采樣（理想） 血袋導(dǎo)管采樣(被稀釋的可能、規(guī)定順序-風(fēng)險(xiǎn)降到最低)標(biāo)本正確標(biāo)識(shí) 措施： 動(dòng)作連續(xù)不能中斷 清場(chǎng) 計(jì)算機(jī)控制（PDA實(shí)物核查、及時(shí)傳輸采集信息）離心時(shí)間 4小時(shí)內(nèi)計(jì)算機(jī)控制保證標(biāo)本、血液同源標(biāo)本采集人員采用PDA 對(duì)血袋、標(biāo)本管等實(shí)物進(jìn)行核查離心處理一、標(biāo)本采集后離心離心處理二、標(biāo)本接收后實(shí)

15、驗(yàn)室再離心江蘇省血液中心 核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)置應(yīng)關(guān)注的細(xì)節(jié)各實(shí)驗(yàn)區(qū)可以移動(dòng)的物品最好用不同顏色進(jìn)行標(biāo)記。以防各區(qū)混用。樣品制備室最好多配備一臺(tái)44樣品冰箱，用于樣品冰箱，用于混樣后樣品的臨時(shí)保存；陰陽(yáng)性對(duì)照試劑盒的?；鞓雍髽悠返呐R時(shí)保存；陰陽(yáng)性對(duì)照試劑盒的保存。存。樣品制備室最好配備開(kāi)蓋機(jī)，用于真空采血管的去帽。在樣品制備室，實(shí)驗(yàn)耗材、試劑準(zhǔn)備區(qū)域和樣品處理區(qū)域最好分開(kāi)。核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)置應(yīng)關(guān)注的細(xì)節(jié)各區(qū)還需配備：無(wú)粉手套，專用工作服，一次性鞋套、口罩，一次性吸水紙，紗布?jí)K。55.5g/100ml的的次氯酸鈉溶液，的乙醇溶液等。次氯酸鈉溶液，的乙醇溶液等。在樣本制備區(qū)，生物安全柜不應(yīng)放在實(shí)驗(yàn)

16、室門(mén)口等易受人員走動(dòng)影響的地方，也不應(yīng)直對(duì)分體式空調(diào)?；鞓觾x的加樣吸頭必須帶濾芯。樣品制備區(qū)和核酸檢測(cè)區(qū)的儀器還應(yīng)配備電源。核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)置江蘇省血液中心核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室簡(jiǎn)介實(shí)驗(yàn)分區(qū)：分4個(gè)室個(gè)室(區(qū)區(qū))：試劑準(zhǔn)備室：試劑準(zhǔn)備室(區(qū)區(qū))，為，為藍(lán)色藍(lán)色標(biāo)記；標(biāo)本制備室標(biāo)記；標(biāo)本制備室(區(qū)區(qū))，為，為綠色綠色標(biāo)記；核酸擴(kuò)增檢測(cè)標(biāo)記；核酸擴(kuò)增檢測(cè)室室(區(qū)區(qū))，為，為黃色黃色標(biāo)記；全自動(dòng)核酸檢測(cè)室標(biāo)記；全自動(dòng)核酸檢測(cè)室(區(qū)區(qū))，為，為灰灰色色標(biāo)記。標(biāo)記。采用的檢測(cè)系統(tǒng)：科華和羅氏兩套檢測(cè)系統(tǒng),兩者共兩者共用試劑準(zhǔn)備室用試劑準(zhǔn)備室(區(qū)區(qū))和標(biāo)本制備室和標(biāo)本制備室(區(qū)區(qū))，核酸擴(kuò)增檢測(cè)，核酸擴(kuò)增檢測(cè)分

17、別在各自的擴(kuò)增檢測(cè)區(qū)。分別在各自的擴(kuò)增檢測(cè)區(qū)。核酸檢測(cè)樣品的質(zhì)量保證應(yīng)注意的細(xì)節(jié)首先要制定樣品采集手冊(cè)，并對(duì)采血人員進(jìn)行全員培訓(xùn)。采血管的選擇：最好選擇EDTA 2KEDTA 2K或或3K3K抗凝帶分離抗凝帶分離膠的抗凝管。膠的抗凝管。注意樣品采集后的充分混勻，一般顛倒次以上。樣品離心：應(yīng)采用大容量低溫離心機(jī)，離心要充分，離心條件最好g g、分鐘。、分鐘。樣品的開(kāi)蓋：應(yīng)在離心后，放冰箱靜置minmin后，再開(kāi)蓋。應(yīng)在生物安全柜中進(jìn)行。后，再開(kāi)蓋。應(yīng)在生物安全柜中進(jìn)行?；鞓又敛鸱謾z測(cè)其間, ,將樣品放將樣品放冰箱臨時(shí)保存。冰箱臨時(shí)保存。核酸檢測(cè)樣品的質(zhì)量保證標(biāo)本的采集: 采用無(wú)采用無(wú)DNA酶、無(wú)酶、無(wú)RNA酶、帶分離膠、酶、帶分離膠、EDTA-K2抗凝、無(wú)菌真空采血管抗凝、無(wú)菌真空采血管( BD PPTTM血漿制血漿制備管）。備管）。為保證標(biāo)本采集后能