第三章蛋白質(zhì)

1、 第三章第三章 蛋蛋 白白 質(zhì)質(zhì)生工生工082班班第三章 蛋白質(zhì)(protein) 1蛋白質(zhì)的概念存在于所蛋白質(zhì)的概念存在于所有的生物細(xì)胞中，是由有的生物細(xì)胞中，是由20種種氨基酸按一定的氨基酸按一定的序列通過酰胺鍵（蛋白序列通過酰胺鍵（蛋白質(zhì)化學(xué)中稱為肽鍵）縮質(zhì)化學(xué)中稱為肽鍵）縮合而成的，具有較穩(wěn)定合而成的，具有較穩(wěn)定的構(gòu)象，是構(gòu)成生物體的構(gòu)象，是構(gòu)成生物體最基本最基本的的結(jié)構(gòu)物質(zhì)結(jié)構(gòu)物質(zhì)和和功功能物質(zhì)能物質(zhì)。相對(duì)分子質(zhì)量。相對(duì)分子質(zhì)量由數(shù)千到數(shù)千萬由數(shù)千到數(shù)千萬。第三章 蛋白質(zhì)(protein) (123-317頁 第3，4，5，6，7章)第一節(jié)第一節(jié) 氨基酸氨基酸蛋白質(zhì)的構(gòu)件分子蛋白質(zhì)的

2、構(gòu)件分子第二節(jié)第二節(jié) 蛋白質(zhì)通論與結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)通論與結(jié)構(gòu) 第三節(jié)第三節(jié) 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 第四節(jié)第四節(jié) 蛋白質(zhì)的性質(zhì)、蛋白質(zhì)的性質(zhì)、分離與純化分離與純化1第一節(jié)第一節(jié) 氨基酸氨基酸蛋白質(zhì)的構(gòu)件分子蛋白質(zhì)的構(gòu)件分子水解類型使用試劑優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)酸水解h2so4 (4m) 或hcl (6m), 20h無消旋作用色氨酸被破壞，部分絲氨酸、蘇氨酸水解，天冬酰胺和谷氨酰胺脫酰胺基堿水解naoh (5m) 10-20h色氨酸穩(wěn)定酶水解蛋白酶無消旋作用，aa不被破壞不完全水解，需多種酶協(xié)同作用完全水解完全水解完全水解：混合的氨基酸完全水解：混合的氨基酸部分水解：肽段和氨基酸部分水解：肽段

3、和氨基酸大多數(shù)aa被破壞，有消旋作用，產(chǎn)物為d-和l-氨基酸混合物；精氨酸脫氨（一）蛋白質(zhì)的水解（一）蛋白質(zhì)的水解（二）氨基酸的分類（二）氨基酸的分類1、根據(jù)側(cè)鏈、根據(jù)側(cè)鏈r基團(tuán)是否有極性基團(tuán)是否有極性非極性氨基酸 ala 、val、 ile、 pro、 phe、 trp、 met極性氨基酸 不帶電極性：gly ser thr cys tyr asn gln 帶負(fù)電：asp glu 帶正電：lys arg his2、根據(jù)分子中氨基與羧基數(shù)目、根據(jù)分子中氨基與羧基數(shù)目酸性氨基酸：asp glu 堿性氨基酸：lys his arg中性氨基酸：15種3、根據(jù)人和哺乳動(dòng)物所需氨基酸是否能自身合成、根據(jù)

4、人和哺乳動(dòng)物所需氨基酸是否能自身合成必需氨基酸：lysvalmet try leu ile thr phe半必需：arg his非必需：其余10種不常見的氨基酸：4-羥基脯氨酸 5-羥基賴氨酸 （由常見的氨基酸經(jīng)修飾而來的）非蛋白質(zhì)氨基酸：150余種20種組成蛋白質(zhì)的氨基酸均為l-型特殊氨基酸的特殊氨基酸的總結(jié)總結(jié)唯一一個(gè)無手性碳、無旋光性的氨基酸 ：gly唯一一個(gè)亞氨基酸、與茚三酮反應(yīng)生成黃色物質(zhì)的氨基酸：pro含有巰基，在空氣中易氧化生成二硫鍵的氨基酸：cys在生物合成中是一種重要甲基供體的氨基酸：met在大多數(shù)酶的活性中心都發(fā)現(xiàn)有其殘基的氨基酸：ser在生理ph條件下唯一具有緩沖能力的氨

5、基酸：his堿性最強(qiáng)、在生理?xiàng)l件下完全質(zhì)子化的氨基酸：arg含有兩個(gè)手性碳的氨基酸：thr ile在近紫外區(qū)有吸收的氨基酸：trp tyr phe 能夠發(fā)生millon反應(yīng)的氨基酸：trp能夠發(fā)生pauly反應(yīng)的氨基酸：his能夠發(fā)生坂口反應(yīng)的氨基酸： arg（三）氨基酸的酸堿化學(xué)三）氨基酸的酸堿化學(xué)aa在晶體或水中以兼性離子形式存在在晶體或水中以兼性離子形式存在等電點(diǎn)：等電點(diǎn)：在溶液某一特定ph值時(shí)，氨基酸主要以兩性離子形式存在，凈電荷為零，在電場中不向電場的正極或負(fù)極移動(dòng)，這時(shí)的溶液ph值稱為該氨基酸的等電點(diǎn)。 當(dāng)溶液ph低于該氨基酸等電點(diǎn)時(shí)，氨基酸凈電荷為正，反之為負(fù)。 氨基酸在等電點(diǎn)時(shí)

6、溶解度最低不同氨基酸等電點(diǎn)不同應(yīng)用應(yīng)用 根據(jù)氨基酸的電荷不同（電泳法,離子交換層析）分離混合物。根據(jù)氨基酸的等電點(diǎn)不同（調(diào)節(jié)溶液ph ）分離混合物。handerson-hasselbalch公式公式ph = pka + lg（a-/ ha）= pka + lg（堿/酸） 等電點(diǎn)的計(jì)算等電點(diǎn)的計(jì)算 1.側(cè)鏈不解離的中性氨基酸 pi = (pk1 + pk2)/2 2.側(cè)鏈含有可解離基團(tuán)的氨基酸 酸性氨基酸 pi = (pk1 + pkr2)/2 堿性氨基酸 pi = (pk2 + pkr3)/2 半胱氨酸 pi = (pk1 + pkr2)/2 酪氨酸 pi = (pk1 + pkr2)/2 注

7、意：pka的數(shù)值選公式中代入的質(zhì)子供體和質(zhì)子受體之間的解離子數(shù)。（四）氨基酸的化學(xué)反應(yīng)（四）氨基酸的化學(xué)反應(yīng) 1.- 氨基參加的反應(yīng)與亞硝酸反應(yīng)與?；噭┓磻?yīng)烴基化反應(yīng) 生成西佛堿的反應(yīng)脫氨基反應(yīng)與轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)2,4二硝基氟苯二硝基氟苯 （dnfb或或fdnb，sanger試劑試劑）苯異硫氰酸酯苯異硫氰酸酯 （pitc， edman試劑試劑） 用于鑒定多肽或蛋白質(zhì)的用于鑒定多肽或蛋白質(zhì)的n n端氨基酸及序列測(cè)定端氨基酸及序列測(cè)定2.-氨基和-羧基共同參加的反應(yīng) （1）與茚三酮的反應(yīng)）與茚三酮的反應(yīng) （2）氨基酸的兩性解離）氨基酸的兩性解離 （3）形成肽鍵）形成肽鍵 （4）離子交換反應(yīng)）離子交換反

8、應(yīng)茚三酮在弱酸性溶液中與氨基酸共熱，所有具有游離氨基氨基酸都生成紫色化合物（570）。脯氨酸和羥脯氨酸與茚三酮反應(yīng)直接生成的是黃色化合物（440）。應(yīng)用：應(yīng)用：是一個(gè)檢測(cè)和定量氨基酸和蛋白質(zhì)的重要反應(yīng)。用層析法把各種氨基酸分開后，利用茚三酮顯色可以定性測(cè)定各種氨基酸。3.側(cè)鏈r基參加的反應(yīng)(1)酪氨酸的酚基米倫反應(yīng)（millon) 與hgno3、hg（no3)2、hno3作用呈紅色；與濃硝酸作用生成黃色。pauly反應(yīng)與重氮化合物反應(yīng)生成橘黃色化合物。注： his的咪唑基與重氮化合物反應(yīng)生成棕紅色（2）精氨酸的胍基坂口反應(yīng)（sagakuchi）與次氯酸鈉(或次溴酸鈉)及-萘酚在氫氧化鈉溶液中產(chǎn)

9、生紅色產(chǎn)物。（3）cys側(cè)鏈上的巰基（sh）與鹵化烷生成穩(wěn)定的烷基衍生物-可保護(hù) -sh 以防被氧化cys巰基打開氮丙啶的環(huán)巰基能和各種金屬離子形成絡(luò)合物-sh 酶遇到重金屬離子而生成硫醇鹽時(shí)，將導(dǎo)致酶失活巰基易受空氣或其他氧化劑氧化兩種氧化衍生物形成二硫化物：胱氨酸的形成形成磺酸基：對(duì)游離的巰基具有保護(hù)作用，保護(hù)cly巰基之間的氧化。二硫鍵的還原（打開） 氧化劑：過甲酸（hcoooh） 還原劑：巰基乙醇、巰基乙酸、二硫蘇糖醇等。（五）氨基酸的光學(xué)活性和光譜性質(zhì)（五）氨基酸的光學(xué)活性和光譜性質(zhì)氨基酸的旋光性氨基酸的光譜性質(zhì)在280nm處有最大吸收峰 可見光區(qū)都沒有光吸收 在遠(yuǎn)紫外區(qū)和紅外區(qū)都有

10、光吸收 近紫外區(qū)(220400nm)只有酪氨酸(275nm)苯丙氨酸(257nm)和色氨酸(280nm)有吸收。這是紫外吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的基礎(chǔ)。（六）氨基酸混合物的分離和分析（六）氨基酸混合物的分離和分析 分配分配層析法的一般原理 紙層析 柱層析 離子交換層析 氣液層析 薄層層析 高效(壓)液相層析hplc二、蛋白質(zhì)通論與結(jié)構(gòu)二、蛋白質(zhì)通論與結(jié)構(gòu)（一）蛋白質(zhì)通論1. 化學(xué)組成：c、h、o、n、p、s蛋白質(zhì)系數(shù)：1g氮所代表的蛋白質(zhì)g數(shù)。是凱氏定氮法測(cè)蛋白質(zhì)含量的計(jì)算基礎(chǔ)2.蛋白質(zhì)的生理功能：要點(diǎn) 構(gòu)成生物體的基本成分；具有多種多樣的生物功能（二）.蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)1、肽2、蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)3、蛋

11、白質(zhì)的構(gòu)象 二級(jí)結(jié)構(gòu) 超二級(jí)結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域 三級(jí)結(jié)構(gòu) 四級(jí)結(jié)構(gòu)（三）肽（三）肽一分子氨基酸的一分子氨基酸的-羧基與另一分子氨基酸羧基與另一分子氨基酸-氨基脫水縮合的化合物叫氨基脫水縮合的化合物叫做做肽肽肽是氨基酸的線性聚合物。肽是氨基酸的線性聚合物。 肽鍵的特點(diǎn)肽鍵的特點(diǎn)具有部分雙鍵特性，不能自由旋轉(zhuǎn),呈現(xiàn)相對(duì)的剛性和平面化。肽鍵的亞氨基沒有明顯的解離和質(zhì)子化。除脯氨酸外多以反式反式結(jié)構(gòu)存在。 肽的化學(xué)反應(yīng)肽的化學(xué)反應(yīng)多肽鏈的水解：酸水解、堿水解、酶水解具有旋光性顏色反應(yīng)紫外吸收 天然存在的重要多肽天然存在的重要多肽以蛋白質(zhì)形式存在:以天然活性肽形式存在： 生物活性肽生物活性肽（四）一級(jí)結(jié)構(gòu)一級(jí)

12、結(jié)構(gòu)：指蛋白質(zhì)分子中氨基酸的組成、排列順序、連接方式以及多肽鏈的數(shù)目和關(guān)聯(lián)。（主要為肽鍵，包括二硫鍵） 是蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)和生理功能的基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定要求要求樣品必須是均一的。純度在97% 以上知道蛋白質(zhì)的分子量步驟步驟（待測(cè)樣品分成多份分別進(jìn)行各步驟測(cè)定） 測(cè)定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目 拆分蛋白質(zhì)分子的多肽鏈和二硫鍵 分析每一多肽鏈的氨基酸組成 測(cè)定并確定多肽鏈的氨基酸序列 確定原多肽鏈中二硫鍵的位置（五） 蛋白質(zhì)的構(gòu)象蛋白質(zhì)的構(gòu)象指蛋白質(zhì)的所有原子在三維空間的位置，即蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)一、研究蛋白質(zhì)構(gòu)象的方法1.應(yīng)用間接的x射線衍射法（技術(shù)）2.研究溶液中蛋白質(zhì)構(gòu)

13、象的光譜學(xué)法二、穩(wěn)定蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的作用力非共價(jià)鍵：氫鍵、疏水相互作用力、范德華力、鹽鍵共價(jià)鍵：二硫鍵三、蛋白質(zhì)天然折疊結(jié)構(gòu)決定因素與溶劑分子的相互作用溶劑的ph和離子組成多肽主鏈折疊的空間限制。蛋白質(zhì)的氨基酸序列四、蛋白質(zhì)的二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu) 二級(jí)結(jié)構(gòu)指肽鏈的主鏈在空間的排列,或規(guī)則的幾何走向、旋轉(zhuǎn)及折疊。維系力：鏈內(nèi)或鏈間形成的氫鍵。由r基的短程順序決定。主要有-螺旋、-折疊、-轉(zhuǎn)角。 幾種纖維狀蛋白質(zhì) -角蛋白 -角蛋白 膠原蛋白 肌球蛋白與肌動(dòng)蛋白超二級(jí)結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域超二級(jí)結(jié)構(gòu)：是指蛋白質(zhì)中相鄰的二級(jí)單元（即螺旋、折疊和轉(zhuǎn)角等）組合在一起，彼此相互作用，形成有規(guī)則的、在空間上能辨認(rèn)的二級(jí)結(jié)

14、構(gòu)組合體。模體（motif,超二級(jí)結(jié)構(gòu)） 常見的3種基本組合形式：、結(jié)構(gòu)域：對(duì)于較大的蛋白質(zhì)分子（或亞基），多肽鏈往往由兩個(gè)或兩個(gè)以上相對(duì)獨(dú)立的三維實(shí)體締合而成三級(jí)結(jié)構(gòu)。這種相對(duì)獨(dú)立的三維實(shí)體就稱結(jié)構(gòu)域。存在于一條肽鏈內(nèi)。l鉸鏈區(qū)l功能域結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)意義1. 相當(dāng)多的結(jié)構(gòu)域都具有局部而不完全的功能。2. 結(jié)構(gòu)域的間隙部位往往是蛋白質(zhì)的功能部位，而且不同的間隙可以表現(xiàn)不同的功能。3. 多結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)的活性是不同結(jié)構(gòu)域的活性的總和，但絕不是機(jī)械的加和。4. 結(jié)構(gòu)域的相互作用會(huì)導(dǎo)致整個(gè)蛋白質(zhì)分子的變構(gòu)效應(yīng)三級(jí)結(jié)構(gòu)三級(jí)結(jié)構(gòu)：是建立在二級(jí)結(jié)構(gòu)、超二級(jí)結(jié)構(gòu)乃至結(jié)構(gòu)域的基礎(chǔ)上的，多肽鏈進(jìn)一步折疊卷曲形成復(fù)雜的球狀分子結(jié)構(gòu)，稱為三級(jí)結(jié)構(gòu)。維系力：有氫鍵、疏水鍵、離子鍵和范德華力等。由氨基酸的長程順序決定球狀蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)1.分子內(nèi)各種側(cè)鏈基團(tuán)相互作用的結(jié)果2.含有多種二級(jí)結(jié)構(gòu)單元3.一般疏水側(cè)鏈埋藏在分子內(nèi)部（疏水核