現(xiàn)代生物技術(shù)導(dǎo)論論文蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用

1、內(nèi)蒙古科技大學選修課結(jié)課論文課程名稱： 現(xiàn) 代 生 物 技 術(shù) 導(dǎo) 論論文題目： 蛋 白 質(zhì) 工 程 的 應(yīng) 用作者姓名： 楊 尚 文學院名稱： 信 息 工 程 學 院學科專業(yè)： 09 自 動 化 4 班學 號 ： 0 9 6 7 1 0 6 4 2 7蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用摘要目前蛋白質(zhì)工程發(fā)展迅速，在生物工程領(lǐng)域起到了越來越重要的作用，利用蛋白質(zhì)工程發(fā)展和造福人類已經(jīng)越來越近了，我們相信，蛋白質(zhì)工程一定會為我們的社會做更好的貢獻。關(guān)鍵字蛋白質(zhì)工程、基因、改造、晶振、dna、應(yīng)用正文蛋白質(zhì)工程是指在基因工程的基礎(chǔ)上，結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)晶學，計算機輔助設(shè)計和蛋白質(zhì)化學等多學科的基礎(chǔ)知識通過對基因的人工定向

2、改造等手段，對蛋白質(zhì)進行修飾，改造和拼接以生產(chǎn)出能滿足人類需要的新型蛋白質(zhì)的技術(shù)，蛋白質(zhì)工程應(yīng)用非常廣泛，蛋白質(zhì)是一切生命活動存在的物質(zhì)基礎(chǔ)和唯一形式，同時也是診斷疾病、治療疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)或藥物。人類蛋白數(shù)量不僅遠超過基因數(shù)量，而且由于蛋白質(zhì)的可變性和多樣性導(dǎo)致了蛋白質(zhì)研究技術(shù)遠比核酸技術(shù)要復(fù)雜和困難的多。因此人類蛋白質(zhì)構(gòu)成了后基因組時代最重要的研究內(nèi)容，具有無限廣闊的前景，目前，蛋白質(zhì)工程尚未有統(tǒng)一的定義。一般認為蛋白質(zhì)工程就是通過基因重組技術(shù)改變或設(shè)計合成具有特定生物功能的蛋白質(zhì)。實際上蛋白質(zhì)工程包括蛋白質(zhì)的分離純化，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的分析、設(shè)計和預(yù)測，通過基因重組或其它手段改造或創(chuàng)造蛋白

3、質(zhì)。從廣義上來說，蛋白質(zhì)工程是通過物理，化學，生物和基因重組等技術(shù)改造蛋白質(zhì)或設(shè)計合成具有特定功能的新蛋白質(zhì)。 利用基因工程的手段，在目標蛋白的氨基酸序列上引入突變，從而改變目標蛋白的空間結(jié)構(gòu)，最終達到改善其功能的目的。傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)工程手段大多通過引入隨機突變來改造目標蛋白，隨著計算機技術(shù)和生物信息學技術(shù)的飛速發(fā)展，計算機模擬被越來越多的應(yīng)用到蛋白質(zhì)工程中，從而衍生出半合理化設(shè)計，合理化設(shè)計等多種新的蛋白質(zhì)工程的手段。例如國內(nèi)的尚科生物醫(yī)藥上海有限公司通過對蛋白質(zhì)dna改組，定向進化對酶進行合理化設(shè)計，從而提高酶的活性。 蛋白質(zhì)工程的核心內(nèi)容之一就是收集大量的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的信息，以便建立結(jié)構(gòu)

4、與功能之間關(guān)系的數(shù)據(jù)庫，為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能之間關(guān)系的理論研究奠定基礎(chǔ)。三維空間結(jié)構(gòu)的測定是驗證蛋白質(zhì)設(shè)計的假設(shè)即證明是新結(jié)構(gòu)改變了原有生物功能的必需手段。晶體學的技術(shù)在確定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)方面有了很大發(fā)展，但是最明顯的不足是需要分離出足夠量的純蛋白質(zhì)（幾毫克幾十毫克），制備出單晶體，然后再進行繁雜的數(shù)據(jù)收集、計算和分析。另外，蛋白質(zhì)的晶體狀態(tài)與自然狀態(tài)也不盡相同，在分析的時候要考慮到這個問題。核磁共振技術(shù)可以分析液態(tài)下的肽鏈結(jié)構(gòu)，這種方法繞過了結(jié)晶、x射線衍射成像分析等難點，直接分析自然狀態(tài)下的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)?，F(xiàn)代核磁共振技術(shù)已經(jīng)從一維發(fā)展到三維，在計算機的輔助下，可以有效地分析并直接模擬出蛋白質(zhì)的空

5、間結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)與輔基和底物結(jié)合的情況以及酶催化的動態(tài)機理。從某種意義上講，核磁共振可以更有效地分析蛋白質(zhì)的突變。國外有許多研究機構(gòu)正在致力于研究蛋白質(zhì)與核酸、酶抑制劑與蛋白質(zhì)的結(jié)合情況，以開發(fā)具有高度專一性的藥用蛋白質(zhì)。根據(jù)對天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能分析建立起來的數(shù)據(jù)庫里的數(shù)據(jù)，可以預(yù)測一定氨基酸序列肽鏈空間結(jié)構(gòu)和生物功能；反之也可以根據(jù)特定的生物功能，設(shè)計蛋白質(zhì)的氨基酸序列和空間結(jié)構(gòu)。通過基因重組等實驗可以直接考察分析結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系；也可以通過分子動力學、分子熱力學等，根據(jù)能量最低、同一位置不能同時存在兩個原子等基本原則分析計算蛋白質(zhì)分子的立體結(jié)構(gòu)和生物功能。雖然這方面的工作尚在起步階段，

6、但可預(yù)見將來能建立一套完整的理論來解釋結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系，用以設(shè)計、預(yù)測蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。蛋白質(zhì)的改造，從簡單的物理、化學法到復(fù)雜的基因重組等等有多種方法。物理、化學法：對蛋白質(zhì)進行變性、復(fù)性處理，修飾蛋白質(zhì)側(cè)鏈官能團，分割肽鏈，改變表面電荷分布促進蛋白質(zhì)形成一定的立體構(gòu)像等等；生物化學法：使用蛋白酶選擇性地分割蛋白質(zhì)，利用轉(zhuǎn)糖苷酶、酯酶、酰酶等去除或連接不同化學基團，利用轉(zhuǎn)酰胺酶使蛋白質(zhì)發(fā)生膠連等等。以上方法只能對相同或相似的基團或化學鍵發(fā)生作用，缺乏特異性，不能針對特定的部位起作用。采用基因重組技術(shù)或人工合成dna，不但可以改造蛋白質(zhì)而且可以實現(xiàn)從頭合成全新的蛋白質(zhì) 。蛋白質(zhì)是由不同氨

7、基酸按一定順序通過肽鍵連接而成的肽構(gòu)成的。氨基酸序列就是蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)，它決定著蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)和生物功能。而氨基酸序列是由合成蛋白質(zhì)的基因的dna序列決定的，改變dna序列就可以改變蛋白質(zhì)的氨基酸序列，實現(xiàn)蛋白質(zhì)的可調(diào)控生物合成。在確定基因序列或氨基酸序列與蛋白質(zhì)功能之間關(guān)系之前，宜采用隨機誘變，造成堿基對的缺失、插入或替代，這樣就可以將研究目標限定在一定的區(qū)域內(nèi)，從而大大減少基因分析的長度。一旦目標dna明確以后，就可以運用定位突變等技術(shù)來進行研究。定位突變蛋白質(zhì)中的氨基酸是由基因中的三聯(lián)密碼決定的，只要改變其中的一個或兩個就可以改變氨基酸。通常是改變某個位置的氨基酸，研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定

8、性或催化特性。噬菌體m13的生活周期有二個階段，在噬菌體粒子中其基因組為單鏈，侵入宿主細胞以后，通過復(fù)制以雙鏈形式存在。將待研究的基因插入載體m13，制得單鏈模板，人工合成一段寡核苷酸（其中含一個或幾個非配對堿基）作為引物，合成相應(yīng)的互補鏈，用t4連接酶連接成閉環(huán)雙鏈分子。經(jīng)轉(zhuǎn)染大腸桿菌，雙鏈分子在胞內(nèi)分別復(fù)制，因此就得到兩種類型的噬菌斑，含錯配堿基的就為突變型。再轉(zhuǎn)入合適的表達系統(tǒng)合成突變型蛋白質(zhì)。盒式突變1985年wells提出的一種基因修飾技術(shù)盒式突變，一次可以在一個位點上產(chǎn)生20種不同氨基酸的突變體，可以對蛋白質(zhì)分子中重要氨基酸進行“飽和性”分析。利用定位突變在擬改造的氨基酸密碼兩側(cè)造

9、成兩個原載體和基因上沒有的內(nèi)切酶切點，用該內(nèi)切酶消化基因，再用合成的發(fā)生不同變化的雙鏈dna片段替代被消化的部分。這樣一次處理就可以得到多種突變型基因。以研究基因為模板，用人工合成的寡核苷酸（含有一個或幾個非互補的堿基）為引物，直接進行基因擴增反應(yīng)，就會產(chǎn)生突變型基因。分離出突變型基因后，在合適的表達系統(tǒng)中合成突變型蛋白質(zhì)。這種方法直接、快速和高效。 高突變率技術(shù)從大量的野生型背景中篩選出突變型是一項耗時、費力的工作。有兩種新的突變方法具有較高的突變率：硫代負鏈法：核苷酸間磷酸基的氧被硫替代后修飾物（s）dctp）對某些內(nèi)切酶有耐性，在有引物和（s）dctp）存在下合成負鏈，然后用內(nèi)切酶處理，

10、結(jié)果僅在正鏈上產(chǎn)生“缺口”，用核苷酸外切酶iii從35擴大缺口并超過負鏈上錯配的核苷酸，在聚合酶作用下修復(fù)正鏈，就可以得到二條鏈均為突變型的基因；ump正鏈法：大腸桿菌突變株rz1032中缺少脲嘧啶糖苷酶和utp酶，m13在這種宿主中可以用脲嘧啶（u）替代胸腺嘧啶（t）摻入模板而不被修飾。用這種含u的模板產(chǎn)生的突變雙鏈轉(zhuǎn)化正常大腸桿菌，結(jié)果含u的正鏈被寄主降解，而突變型負鏈保留并復(fù)制。 蛋白質(zhì)融合將編碼一種蛋白質(zhì)的部分基因移植到另一種蛋白質(zhì)基因上或?qū)⒉煌鞍踪|(zhì)基因的片段組合在一起，產(chǎn)生出新的融合蛋白質(zhì)。這種方法可以將不同蛋白質(zhì)的特性集中在一種蛋白質(zhì)上，顯著地改變蛋白質(zhì)的特性。現(xiàn)在研究的較多的所

11、謂“嵌合抗體”和“人緣化抗體”等，就是采用的這種方法。蛋白質(zhì)工程的實際應(yīng)用一.提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性葡萄糖異構(gòu)酶（gi）在工業(yè)上應(yīng)用廣泛，為提高其熱穩(wěn)定性，朱國林等人在確定第138位甘氨酸(gly138)為目標氨基酸后，用雙引物法對gi基因進行體外定點誘變，以脯氨酸（pro138）替代gly138，含突變體的重組質(zhì)粒在大腸桿菌中表達，結(jié)果突變型gi比野生型的熱半衰期長一倍；最適反應(yīng)溫度提高1012；酶比活相同。據(jù)分析，pro替代gly138后，可能由于引入了一個吡咯環(huán)，該側(cè)鏈剛好能夠填充于gly138附近的空洞，使蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)更具剛性，從而提高了酶的熱穩(wěn)定性。腦啡肽(enk)n端5肽線形結(jié)構(gòu)是與

12、型受體結(jié)合的基本功能區(qū)域，干擾素（ifn）是一種廣譜抗病毒抗腫瘤的細胞因子。黎孟楓等人化學合成了enkn端5肽編碼區(qū)，通過一連接3肽編碼區(qū)與人1型ifn基因連接，在大腸桿菌中表達了這一融合蛋白。以體外人結(jié)腸腺癌細胞和多形膠質(zhì)瘤細胞為模型，采用3h胸腺嘧啶核苷摻入法證明該融合蛋白抑制腫瘤細胞生長的活性顯著高于單純的ifn，通過naloxone競爭阻斷實驗證明，抑制活性的增高確由enk導(dǎo)向區(qū)介導(dǎo)。二蛋白質(zhì)活性的改變通常飯后3060min，人血液中胰島素的含量達到高峰，120180min內(nèi)恢復(fù)到基礎(chǔ)水平。而目前臨床上使用的胰島素制劑注射后120min后才出現(xiàn)高峰且持續(xù)180240min，與人生理狀況

13、不符。實驗表明，胰島素在高濃度（大于105mol/l）時以二聚體形式存在，低濃度時（小于109mol/l）時主要以單體形式存在。設(shè)計速效胰島素原則就是避免胰島素形成聚合體。類胰島素生長因子i(igfi)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)與胰島素具有高度的同源性和三維結(jié)構(gòu)的相似性，但igfi不形成二聚體。igfi的b結(jié)構(gòu)域（與胰島素b鏈相對應(yīng)）中b28b29氨基酸序列與胰島素b鏈的b28b29相比，發(fā)生顛倒。因此，將胰島素b鏈改為b28lysb29pro，獲得單體速效胰島素。該速效胰島素已通過臨床實驗。三治癌酶的改造癌癥的基因治療分二個方面：藥物作用于癌細胞，特異性地抑制或殺死癌細胞；藥物保護正常細胞免受化學藥物的侵

14、害，可以提高化學治療的劑量。皰癥病毒胸腺嘧啶激酶(tk)可以催化胸腺嘧啶和其他結(jié)構(gòu)類似物如gancic-lovir和acyclovir無環(huán)鳥苷磷酸化。ganciclovir和acyclovir缺少3端羥基，就可以終止dna的合成，從而殺死癌細胞。hsvtk催化ganciclovir和acyclovir的能力可以通過基因突變來提高。從大量的隨機突變中篩選出一種，在酶活性部位附近有6個氨基酸被替換，催化能力分別提高43和20倍。o6烷基鳥嘌呤是dna經(jīng)烷基化劑（包括化療用亞硝基藥物）處理以后形成的主要誘變劑和細胞毒素，所以這些亞硝基藥物的使用劑量受到限制。o6烷基鳥嘌呤dna烷基轉(zhuǎn)移酶o6alky

15、lguaninednaalkyltransferase(agt)能夠?qū)ⅧB嘌呤o6上的烷基去除掉，起到保護作用。通過反向病毒轉(zhuǎn)染，人類agt在鼠骨髓細胞中表達并起到保護作用。通過突變處理，得到一些正突變agt基因且活性都比野生型的高，經(jīng)檢查發(fā)現(xiàn)一個突變基因中的第139位脯氨酸被丙氨酸替代。四嵌合抗體和人緣化抗體免疫球蛋白呈y型，由二條重鏈和二條輕鏈通過二硫鍵相互連接而構(gòu)成。每條鏈可分為可變區(qū)（n端）和恒定區(qū)（c端），抗原的吸附位點在可變區(qū)，細胞毒素或其他功能因子的吸附位點在恒定區(qū)。每個可變區(qū)中有三個部分在氨基酸序列上是高度變化，在三維結(jié)構(gòu)上是處在折疊端頭的松散結(jié)構(gòu)（cdr），是抗原的結(jié)合位點，其

16、余部分為cdr的支持結(jié)構(gòu)。不同種屬的cdr結(jié)構(gòu)是保守的，這樣就可以通過蛋白質(zhì)工程對抗體進行改造。 鼠單克隆抗體被人免疫系統(tǒng)排斥，它潛在的治療作用得不到利用。嵌合抗體就是用人抗體的恒定區(qū)替代鼠單克隆抗體的恒定區(qū)，這樣它的免疫原性就顯著下降。如用于治療直腸結(jié)腸腺癌（colorectaladenocarcinoma）的單克隆抗體mab171a。盡管嵌合抗體還存在著免疫原的問題，但仍有幾種嵌合抗體通過了臨床實驗。所謂人緣化抗體就是將抗原吸附區(qū)域嫁接到人抗體上，這樣抗體上的外源肽鏈降低到最小，免疫原性也就最小。但是，僅將cdr轉(zhuǎn)接到人抗體上，其抗原吸附能力很小，必須帶上幾個框架氨基酸殘基，才能保持原有的

17、吸附力。這樣就存在免疫原性與抗原吸附力之間的矛盾。通過逐個氨基酸替代或計算機模擬分析，可在保持原有吸附力的基礎(chǔ)之上，盡可能地降低免疫原性。第一個臨床上應(yīng)用的用于治療淋巴肉芽腫病和風濕性關(guān)節(jié)炎的人緣化抗體campath1h，盡管療效顯著，但仍有半數(shù)以上的患者有免疫反應(yīng)。而其他人緣化抗體如治療脊髓性白血病的anticd33等，其免疫反應(yīng)可以忽略不計。五蛋白質(zhì)工程進展當前，蛋白質(zhì)工程是發(fā)展較好、較快的分子工程。這是因為在進行蛋白質(zhì)分子設(shè)計后，已可應(yīng)用高效的基因工程來進行蛋白的合成。最早的蛋白工程是福什特（forsht）等在19821985年間對酪氨酰trna合成酶的分子改造工作。他根據(jù)xrd（x射線

18、衍射）實測該酶與底物結(jié)合部位結(jié)構(gòu)，用定位突變技術(shù)改變與底物結(jié)合的氨基酸殘基，并用動力學方法測量所得變體酶的活性，深入探討了酶與底物的作用機制。佩里1984年通過將溶菌酶中ile(3)改成cys(3)，并進一步氧化生成 cys(3)-cys（97）二硫鍵，使酶熱穩(wěn)定性提高，顯著改進了這種食品工業(yè)用酶的應(yīng)用價值。1987年福什特通過將枯草桿菌分子表面的asp（99）和glu（156）改成lys，而導(dǎo)致了活性中心his（64）質(zhì)子pka從7下降到6，使酶在ph=6時的活力提高10倍。工業(yè)用酶最佳ph的改變預(yù)示可帶來巨大經(jīng)濟效益。蛋白工程還可對酶的催化活性、底物專一性、抗氧化性、熱變性、堿變性等加以改變。由此可以看出蛋白工程的威力及其光輝前景。上述各例是通過對關(guān)鍵氨基酸殘基的置換與增刪進行蛋白工程的一類方法。另一類是以某個典型的折疊進行“從頭設(shè)計”的方法。1988年杜邦公司宣布，成功設(shè)計并合成